Isolando a microglia de lesões desmielinizantes do cérebro de camundongos usando classificação de células ativadas por magnetismo

Dissecar lesões desmielinizantes coradas do corpo caloso de um cérebro de camundongo.

Essas lesões contêm micróglia residente no cérebro expressando a integrina CD11b da superfície celular.

Colete o tecido e adicione uma solução contendo uma enzima proteolítica e DNase.

A enzima degrada a matriz extracelular, enquanto a DNase degrada o DNA livre.

Adicione tampão frio e filtre a suspensão através de uma peneira para remover aglomerados celulares.

Centrifugue, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células peletizadas em um meio de gradiente de densidade.

Cubra com tampão e centrifugue para coletar os detritos restantes nas camadas superiores; as células intactas se depositam na parte inferior.

Remova os detritos e ressuspenda as células em um tampão.

Adicione esferas magnéticas anti-CD11b para rotular a microglia.

Carregar as células numa coluna contendo esferas ferromagnéticas colocadas no campo magnético do separador magnético.

Sob o campo magnético externo, a microglia ligada ao grânulo é retida na coluna enquanto as células não ligadas fluem.

Remova a coluna do campo magnético. Adicione um tampão para eluir a microglia.

Comece microdissecando as lesões marcadas com corante neutro ao redor do corpo caloso sob um estereomicroscópio. Centrifugar o tecido dissecado a 300 x g durante 30 segundos para recolher a amostra no fundo do tubo. Pré-aqueça a mistura enzimática 1 e a mistura enzimática 2 a 37 graus Celsius em uma incubadora. Em seguida, adicione 1.950 microlitros de enzimas pré-aquecidas, misture 1 a uma amostra e digerir em uma incubadora a 37 graus Celsius por 5 minutos. Adicione 30 microlitros de enzima pré-aquecida, misture 2 e misture delicadamente.

Após a digestão, adicione 4 mililitros de PBS frio ao tubo e agite suavemente. Centrifugar as amostras de tecido a 300 x g durante 10 minutos a 4 graus Celsius e aspirar o sobrenadante lenta e completamente. Ressuspenda o pellet celular suavemente com 1.550 microlitros de PBS frio. Adicione 450 microlitros da solução fria para remoção de detritos e misture bem.

Use uma pipeta de 1000 microlitros para cobrir a mistura muito lenta e suavemente, com 2 mililitros de PBS frio. Centrifugue, a mistura e procure as 3 camadas. Use uma pipeta de 1000 microlitros para aspirar completamente as 2 camadas superiores e encha o tubo até 5 mililitros com tampão de carga a frio. Inverta suavemente o tubo 3 vezes.

Em seguida, após centrifugação e aspiração do sobrenadante, ressuspenda o pellet celular com 90 microlitros de tampão de carga e adicione 10 microlitros de grânulos CD11b. Misture bem e incube por 15 minutos a 4 graus Celsius. Após a incubação, adicione 1 mililitro do tampão de carregamento e lave as células pipetando suavemente o líquido para cima e para baixo com uma pipeta de 1000 microlitros.

Centrifugue as células a 300 x g por 10 minutos a 4:00 graus Celsius e aspire completamente o sobrenadante para remover as esferas não ligadas. Ressuspenda as células em 500 microlitros do tampão de carga e coloque a coluna MS com seu separador para seleção positiva no campo magnético. Enxágue a coluna com 500 microlitros do buffer de carregamento para proteger as células e garantir a eficiência da classificação magnética com base no protocolo do fabricante.

Aplique a suspensão de células na coluna MS e descarte o fluxo que contém as células não rotuladas. Adicione 500 microlitros do tampão de carregamento para lavar a coluna e remova-o do separador. Coloque a coluna em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione 1 mililitro do tampão de carregamento na coluna. Finalmente, empurre o êmbolo para a parte inferior da coluna para liberar as células marcadas magneticamente.