Name: Método quantitativo e qualitativo para esfingomielina por LC-MS usando dois estável desvendar rotulado esfingomielina espécies (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a analisar esfingomielina em amostras biológicas por cromatografia líquida e espectrometria de massa. Este método permite caracterizar quantitativamente e qualitativamente as espécies lipídicas em células HeLa.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia do Japão (KAKENHI) para KH (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), KY (#26461532) e um subsídio para o estudo do projeto de doença intratável do Ministério da Saúde, trabalho e Previdência (K.Y. #201510032A). Agradecemos ao grupo de Emilia (www.edanzediting.com/ac) para a edição de um projecto deste manuscrito.

Consulte todas as fichas de dados de segurança (MSDS) antes do uso. Use luvas para minimizar a contaminação da amostra por SM derivado de pele. O presente protocolo foi aplicado às células HeLa cultivadas na mínimo essencial suplementado do águia com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 1.000 U/L penicilina e estreptomicina 100 mg/L.
1. preparação das amostras de lipídios
Nota: É importante que todos os produtos vidreiros, incluindo tubos de ensaio com tampas de rosca Teflon revestido isento de detergente.
<ol><li>Extração da fração lipídica total de homogeneizado de célula usando o método de Bligh & Dyer7<ol>
<li>Remover a cultura (ou condicionado) meios de cultura de tecido de 10cm prato e lavar duas vezes com 6 mL de PBS gelado.</li>
		<li>Adicione 1 mL de PBS gelado para o prato de cultura de tecido de 10 cm, com uma pipeta P1000. Colher as células com raspadores de célula e coletar em tubos de plástico siliconizados 2,0 mL.</li>
		<li>Após centrifugação (1.000 × g, 5 min, 4 ° C), remova o sobrenadante por uma pipeta P1000.</li>
		<li>Adicione 1 mL de metanol. Vórtice tubos brevemente e proceda à sonicação em 200 W por 5 min em um sonicador de banho-tipo. Nota: Ajuste o nível de água em um sonicador de banho-tipo para que o centrifugado eficientemente é homogeneizado.</li>
		<li>Pipeta, transferi o homogenate de célula em metanol em tubos de ensaio (13 x 100 mm), com tampas de rosca Teflon-alinhado.</li>
		<li>Adicione 1 mL de metanol, 1 mL de clorofórmio, 0,8 mL de água bidestilada e 50 µ l de 10 µmol/L de d18:1 padrão interno /(D31)-16:0 SM para cada tubo de ensaio.</li>
		<li>Tubos de ensaio de vórtice vigorosamente por 5 min à temperatura ambiente. Nota: A esta altura, uma única fase (clorofórmio/metanol/água = 1/2/0,8 (v/v/v)) é formado.</li>
		<li>Adicione 1 mL de clorofórmio e 1,0 mL de água bidestilada.</li>
		<li>Tubos de vórtice vigorosamente a 2.500 rpm durante 5 min à temperatura ambiente. Nota: neste ponto, o aquosa fase (superior) e a fase orgânica (inferior) é separada.</li>
		<li>Após centrifugação (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), coletar e transferir a fase inferior em tubos de vidro descartável (fase inicial inferior). Nota: Recolha a fase inferior usando uma pipeta Pasteur e um filtro de pipeta de segurança. Insira a ponta da pipeta na fase inferior, aperte o bulbo pequeno ao lado da válvula de 'E' entregar-se a fase superior e cotão interfacial dentro a ponta da pipeta e em seguida a fase inferior do sifão dentro da pipeta.</li>
		<li>Adicione 2 mL de clorofórmio em tubos de ensaio e vórtice os tubos vigorosamente a 2.500 rpm durante 5 min à temperatura ambiente suficientemente misturar com a fase superior e cotão interfacial.</li>
		<li>Após centrifugação (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), coletar e transferir a fase inferior modificada para os tubos de vidro descartável com a fase inicial inferior como descrito na etapa 1.1.10.</li>
		<li>Coloque os tubos de vidro sob um fluxo de nitrogênio e remover completamente os solventes orgânicos na fase inferior coletada.</li>
		<li>Reconstituir as amostras com 500 µ l de metanol ou etanol, filtrar com um filtro de 0,02 µm e armazenar em frascos de vidro a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da amostra para construir a curva de calibração e validação do método<ol>
<li>Adicionar 50 µ l de 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ou 50 µmol/L de padrão composto (d18:1 /(D9)-18:1 SM) em tubos de ensaio com tampas de rosca Teflon-alinhado.</li>
		<li>Adicionar homogenate de célula para cada tubo de ensaio e adicionar 1 mL metanol. Nota: A quantidade de célula homogeneizado como uma matriz varia de acordo com cada experiência. Se a espécie de SM em amostras derivadas de células numa placa de cultura de 10 cm é rotineiramente analisada, a quantidade de células homogeneizado em cada tubo de ensaio deve ser próximo ao de células numa placa de cultura de 10 cm.</li>
		<li>Extrato da fração lipídica total conforme descrito em etapas 1.1.6-1.1.14.</li>
		<li>Prepare a verificação da qualidade (QC) amostras para validar o método como descried em etapas 1.2.1-1.2.3. Preparar três QC amostras com concentrações diferentes de padrão composto (d18:1 /(D9)-18:1 SM): um dentro de 3 x o limite inferior da curva padrão (QC-baixo, QC-L), um perto do centro (QC-médio, QC-M) e um perto do limite superior da curva padrão (QC-alta, QC-H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. SM análise por LC-ESI-MS/MS
<ol><li>Preparação da fase móvel<ol>
<li>Mistura de solventes (acetonitrilo/metanol/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) para a fase aquosa e isopropanol para a fase orgânica) em garrafas com tampas de rosca Teflon revestido de vidro e proceda à sonicação por 5 min em um sonicador de banho-tipo.</li>
		<li>Adicionar o ácido fórmico (concentração final 26,4 mmol/L) e NH4OH (14,9 mmol/L) em cada fase móvel.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise qualitativa de SM por LC-ESI-MS3<ol>
<li>Ativar o sistema de cromatografia líquida (HPLC) de alto desempenho, colocar os tubos de entrada para as garrafas de vidro que contêm fases móveis e purgar as linhas HPLC. Link de uma coluna HPLC de18 C (1,5 mm identificação × 100 mm de comprimento, partícula tamanho 3,0 µm) para o sistema HPLC, manter a temperatura do forno da coluna, a 50 ° C e condicionar a coluna com a fase aquosa móvel em 100 µ l/min. colocar as amostras em um rack de amostra na autosampl -er.</li>
		<li>Defina os parâmetros do sistema de espectrometria de massa de linear ion trap quadrupolo para análise de3 MS conforme listado na tabela 1 e tabela 2 , bem como o precursor do primeiro e segundo íons das espécies de interesse SM e triplo quadrupolo.<ol>
<li>Dê um duplo clique no ícone do software para aquisição de dados, clique duas vezes a configuração de' Hardware', selecione 'LC + QTRAP4500 + válvula' e clique em 'Ativar perfil'.</li>
			<li>Crie uma nova subpasta clicando em 'Novo sub-projeto' e 'Okey'.</li>
			<li>Clique na guia 'arquivo', selecione 'Novo' e selecione 'Método de aquisição' e 'Okey'. Clique no ícone 'Mass Spec' e 'MS' Tab. Selecione Scan tipo como 'MS/MS/MS (MS3)', taxa de varredura como 10.000 Da/s, polaridade como 'Negativo' e 'Duração' como o tempo todo para ser analisado (min). Defina a m/z do 'Start (Da)' e 'Stop (Da)' como o intervalo a ser digitalizado. Defina a m/z dos iões precursor de 1ª e 2ª do alvo espécies SM de interesse. Nota: Para analisar várias espécies de SM, destacar o '-MS3' ícone, botão direito do mouse, selecione 'Copiar este experimento' e em seguida, colocar a m/z dos 1º e 2º iões precursor de outras espécies de SM.</li>
			<li>Selecione a guia 'Avançado MS' e definir cada parâmetro da seguinte forma: modo de varredura como 'Perfil', tamanho de passo como 0.12 (Da), resolução Q1 e Q3 'Unidade' e 'Iluminada', respectivamente, o limiar de intensidade como 0, tempo de solidificação como 50 (ms), pausa entre faixas de massa como 1,5 ms, selecione ' dinâmico preencher o tempo ', barreira de entrada Q3 como 8 V e o tempo de excitação como 25 ms.</li>
			<li>Clique no botão 'Editar parâmetros' na guia 'MS' e selecione 'fonte/gás' Tab definir os parâmetros do gás de cortina, gás de colisão, ionspray tensão, temperatura, íon fonte gas1 e gas2 conforme listado na tabela 1. Então selecione a guia 'Composto' definir os parâmetros do potencial declustering, potencial de entrada, energia, energia de excitação e energia de colisão espalhar conforme listado na tabela 2.</li>
			<li>Destaque 'Integrada da válvula Valco' e selecione 'Nome da posição para etapa 0' como A e 'B' como posição para total tempo 5,0 min. Também definido 'A' como posição para total tempo min 70,0.</li>
			<li>Destaca-se 'Sistema Shimadzu LC'. Selecione a guia 'Bomba' e definir o modo de bombeamento como fluxo binário, o fluxo total de 0,28 mL/min e o máximo de limites de pressão como 20,0 MPa. Selecione a guia 'Mostruário' e definir o volume de lavagem como 200 µ l agulha de traço como 52 milímetros, enxague a velocidade como 35 µ l/s, velocidade como 5,0 µ l/s de amostragem, purgar o tempo como 25,0 min, enxaguar o tempo de mergulho como 5 s e modo de lavagem como 'Antes e depois da aspiração'.<ol>
<li>Além disso, habilitar o aparelho refrigerador, regule a temperatura refrigerador como 4 ° C e o traço de agulha do frasco de controle como 52 mm. Selecione a guia 'Forno', permitem o forno e a temperatura do forno e a temperatura máxima definida como 50 ° C e 85 ° C, respectivamente.</li>
				<li>Seleccione o separador 'Controlador' e marque a caixa 'Ligar'. Seleccione o separador 'Programa' e defina os gradientes solventes como segue: solventes A / B na proporção de 100/0 por 5 min, programa lineares alterações de 80/20 mais de 4 min, 35/65 mais de 50 min e de 25/75 mais 1 min. depois , segurá-los no 25/75 por 10 min, em seguida linearmente para 100/0 mais 4 min. Então o método save.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Criar o arquivo de lote<ol>
<li>Duplo clique no ícone 'Construir lote de aquisição', clique em 'Adicionar Set', 'Adicionar a amostras', defina o número de novas amostras e clique em 'Okey'.</li>
			<li>Clique no botão ' método Editor' e selecione o método a ser usado. Se vários métodos são usados em um arquivo em lotes, marque a caixa de 'Uso múltiplo métodos' e selecione o método de aquisição para cada amostra. Renomear 'Nome da amostra', definir o número adequado para 'Posição de frasco' e coloque a quantidade de volume de injeção. Em seguida, salve o arquivo em lotes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Obter o produto de3 MS espectros de íons das espécies de interesse SM por LC-ESI-MS3 análise<ol>
<li>Selecione a guia 'Submeter' no arquivo de lote, destaca a linha de amostras a analisar e clique no botão 'Enviar'.</li>
			<li>Clique no ' View Quene' ícone, o ícone 'Equilíbrio', selecione o método de aquisição a ser utilizado, definir hora como 1 min e clique em 'Okey'.</li>
			<li>Desactive o 'Instrumento de reserva para Tuning', clicando no ícone correspondente. Em seguida, execute sequência em lote, clicando no ícone 'Começar a amostra'.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Atribuir a cada MS3 espectros de íon produto de SM, comparando a massa para cobrar proporção (m/z) do produto espectros de íons e a massa exata do esfingoides LCB e N-grupo acila de interesse. Determinar o número de carbonos e dois títulos no esfingoides LCB e N-grupo acila de acordo com os íons de produto correspondente.<ol>
<li>Verifique se a pasta apropriada sub-projeto foi selecionada, então dê um duplo clique no ícone 'Abrir arquivo de dados' e seleccionar as amostras a analisar. Arraste o pico no cromatograma, para cada espécie de SM de destino e clique duas vezes. Serão apresentados os obtidos espectros íon MS produto3 dentro da área arrastado.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análise quantitativa de SM por LC-ESI-MS/MS<ol>
<li>Defina as fases móveis e HPLC coluna conforme descrito no passo 2.1 e 2.2.1.</li>
		<li>Defina os parâmetros do triplo quadrupolo e sistema de espectrometria de massa linear ion trap quadrupolo para múltiplas reação (MRM) análises de monitorização, conforme listado na tabela 1 e tabela 2.<ol>
<li>Realizar os procedimentos conforme descrito na etapa 2.2.2.1 e 2.2.2.2.</li>
			<li>Clique na guia 'arquivo', selecione 'Novo' e selecione 'Método de aquisição' e 'Okey'. Clique no ícone 'Mass Spec' e 'MS' Tab. Selecione Scan tipo como 'MRM', polaridade como 'Positivo'. Defina 'Duração' como o tempo todo para ser analisado. Defina a m/z de [M + H]+ e 184 como 'Massa de Q1 (Da)' e 'Q3 massa (Da)' do alvo espécies SM de interesse, respectivamente. Definir o 'Tempo' como 10 ms e 'ID' como o nome do alvo espécies de SM.</li>
			<li>Selecione a guia 'Avançado MS' e definir cada parâmetro da seguinte forma: ambos da resolução Q1 e Q3 como 'Unidade', limiar de intensidade como 0, definindo o tempo como 0 (ms) e pausa entre faixas de massa como 5 ms.</li>
			<li>Clique no botão 'Editar parâmetros' na guia 'MS' e selecione a guia ' Fonte/gás' colocar o parâmetro de gás de cortina, gás de colisão, ionspray tensão, temperatura, íon fonte gas1 e gas2 conforme listado na tabela 1. Em seguida, selecione a guia 'Composto' colocar os parâmetros de declustering potencial, potencial de entrada, energia de colisão e potencial de saída de célula de colisão conforme listado na tabela 2.</li>
			<li>Conjunto da válvula, conforme descrito na etapa 2.2.2.6.</li>
			<li>Defina a condição de LC, conforme descrito na etapa 2.2.2.7. Então o método save.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Crie o arquivo de lote, conforme descrito na etapa 2.2.3.</li>
		<li>Obter os dados MRM de cada espécie de SM por LC-ESI-MS/MS análise conforme descrito na etapa 2.2.4.</li>
		<li>Processar os dados MRM, usando o software de integração de dados e obter os dados da área do pico para o cromatograma de íons extraídos de cada espécie de SM.<ol>
<li>Dê um duplo clique no ícone do software para integração de dados em análise quantitativa, clique na guia 'Editar' e selecione padrões de integração do usuário. Definir largura liso Gaussian como 1,0 ponto e clique em 'Okey'. Clique na guia 'Editar' e selecione 'Nova tabela de resultados'. Selecione a amostra a ser integrada, clique em um botão de seta e clique em 'Avançar'. Selecione 'Criar novo método', defina o nome do método e clique em 'Avançar'. Clique em 'Avançar' e marque a caixa de d18:1 /(D31)-16:0 SM como está, clique em 'Avançar' e clique em 'Concluir'.</li>
			<li>Clique em 'Exibe a revisão de pico' e confirmar que os picos do cromatograma são reconhecidos adequadamente. Note-se que o tempo de retenção de d18:1 /(D31)-16:0 SM é geralmente menor por ~ 0,3 min em relação a um dos 34-1 SM (geralmente consiste de d18:1 / 16:0 SM).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Quantificar a cada espécie de SM de acordo com a relação do pico de cada espécie de SM para o d18:1 /(D31)-16:0 padrão interno de SM.<ol>
<li>Clique na guia 'Arquivo', selecione 'Exportar', selecione 'Tabela de resultados', confirmando o formato do 'MultiQuant,' colunas 'Todas as colunas de exportação', linhas como 'Exportar todas as linhas exceto aqueles explicitamente ocultas' e clique em 'Okey'.</li>
			<li>Abra o arquivo exportado no software Excel. Normalizar a área do alvo espécies SM pela área de IS (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Então Multiplique pela quantidade teórica do IS na amostra injetada para calcular a quantidade de alvo espécies de SM na amostra injetada.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Construir a curva padrão<ol>
<li>Obter os dados MRM de d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM nas amostras para construir a curva padrão por LC-ESI-MS/MS análise, conforme descrito no passo 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Obter os dados da área de pico de d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM conforme descrito na etapa 2.3.5.</li>
		<li>Calcular a quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM na amostra injetada como descrito no passo 2.3.6.</li>
		<li>Construir a linha de tendência, definindo os eixos x e y como o valor nominal e montante calculado de d18:1 /(D9)-18:1 SM e obter a fórmula de linha de tendência.</li>
	</ol></li>
	<li>Validando o método quantitativo, utilizando o software Excel<ol>
<li>Para validação do método, quantificar a quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM no QC amostras, analisando cada QC da amostra pelo menos três vezes em 1 dia e repita pelo menos 3 dias, conforme descrito no passo 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Obter os dados de área de pico e calcular a quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM na amostra injetada como descrito no passo 2.3.5 e 2.3.6.</li>
		<li>De acordo com a curva de calibração obtida, calcular a quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM na amostra injetada.</li>
		<li>Avaliação da precisão<ol>
<li>Calcular a média e o desvio padrão da quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM obtido na etapa 2.5.3 sobre o dataset do dia-intra e inter dia utilizando o software Excel.</li>
			<li>A média obtida na etapa 2.5.4.1 é dividida pelo desvio-padrão e expresso em %.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Avaliação da precisão<ol>
<li>Calcule a precisão de cada dados como segue: [(O montante calculado obtido na etapa 2.5.3.) / (Valor nominal) - 1] × 100(%)</li>
			<li>Calcule a média do valor absoluto da precisão sobre o dataset do dia inter e intradia.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm nenhum conflito de interesses.

No presente método qualitativo, obtivemos MS3 íons de produto de um SPC e um N-grupo acila. É fundamental para atribuir adequadamente tanto um SPC e um N-grupo acila. Para este fim, note-se que outras moléculas contendo phosphorylcholine também podem ser detectadas como MS3 íons de produto. Diacil-fosfatidilcolina (PC) e plasmalogen-PC estão abundantemente presentes em células de mamíferos, e sua hidrofobicidade é similar de SM. Portanto, diacil-PC e PC-plasmalogen com um isótopo (...

Esfingomielina (SM) é um comum esfingolipídeos em células de mamíferos. SM é sintetizada intracelular1 e presente como um precursor para outros esfingolipídeos como um esfingosina-1-fosfato e uma ceramida, que têm papéis cruciais em imune celular tráfico e homeostase da barreira, respectivamente,2, a pele 3. Assim, a análise precisa do metabolismo SM é importante para elucidar as funções fisiológicas e patológicas de esfingolipídeos.
SM é composto por uma ceramida e um phosphorylcholine que está vinculada ao grupo da ceramida, composto por mais uma esfingosina e um N1-hidroxi-grupo acila. Uma variedade do número de carbono e uma ligação dupla na esfingosina e N-grupo acila resulta na espécie número de ceramida (e SM). Avanços recentes na LC-ESI-MS/MS permitiu uma análise quantitativa e qualitativa de SM4,5. Na análise qualitativa, o número de carbono e ligações duplas de um esfingoides LCB de SM foi identificadas atribuindo espectros de íon produto da LCB. No entanto, informações estruturais do N-grupo acila não foram obtida diretamente porque seus íons correspondentes do produto não foram relatados e, portanto, N-metades de acila foram deduzidas pela análise diferencial entre íons precursor e íons de produto correspondente a LCB em ambos os modos de iões positivos e negativos4,5. Neste relatório, nós apresentamos um método para detectar os íons de produto da LCB e N-moiety de acila simultaneamente em modo de3 MS usando triplo quadrupolo e espectrometria maciça linear ion trap quadrupolo, que facilita a precisão estrutural especulação de cada espécie de SM6.
Os efeitos de supressão (ou aprimoramento) do íon causados pela matriz em amostras biológicas dificultam a quantificação exata na análise de LC-ESI-MS, e portanto, é desejável para construir as curvas de calibração para todos os analitos de interesse na matriz idêntica da amostra biológica. No entanto, esta estratégia não é viável porque é quase impossível preparar todas as espécies de SM em amostras biológicas, especialmente em uma análise abrangente. Assim, é prático para construir uma curva de calibração e determinar a escala quantitativa usando uma espécie de SM representante cravada nas amostras biológicas. Usamos duas espécies de SM desvendar-etiquetados para construir uma curva de calibração; foi usada para um padrão interno e outro para um padrão composto. Detectamos uma pequena quantidade de espécies de SM desvendar-rotulado como um padrão composto cravado em amostras biológicas e obtido com êxito uma curva de calibração e a escala quantitativa6.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de tecidos de 100 mm</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>Tubo siliconizado de 2,0 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensaio</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de rosca revestida de teflon</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidro descartável</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &micro; m 1,5 mm I.D. x 100 mm</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>O cartucho de proteção é inserido no suporte do cartucho e ligado à coluna C18</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 mm x 10 mm CARTUCHO DE PROTEÇÃO</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>Suporte do cartucho</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (álcool isopropílico)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28% de água de amônia</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador (tipo banho)</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice para tubo de ensaio de vidro</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>frasco de vidro de 1,4 mL</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>As amostras são armazenadas em frasco de vidro de 1,4 mL selado com tampa de rosca e septo de 8 mm a -20&deg; C</td></tr><tr><td>8 mm septo</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>Quando as amostras são analisadas, as tampas de rosca são substituídas por tampas de rosca com septo cortado</td></tr><tr><td>Tampa de rosca para frasco de vidro de 1,4 mm</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de rosca com septo cortado</td><td>Shimadzu GLC</td><td>GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0,22 &micro; Filtro</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Espectrometria de massa de armadilha de íons linear triplo quadrupolo e quadrupolo</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>O software para aquisição e análise de dados de espectros de íons de produtos</td><td>SCIEX</td><td>Analyst</td><td></td></tr><tr><td>O software para integração de dados em análise quantitativa</td><td>SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>Sistema HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>Garrafa de vidro Nexera</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 esfingomielina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>Esfingosilfosforilcolina</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>26140079</tr><tr><td>L-glutamina</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Penicilina e estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s mínimo essencial médio</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

método quantitativo e qualitativo para esfingomielina por lc-ms usando dois estável desvendar rotulado esfingomielina espécies

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Apresentamos um método de analisar esfingomielina (SM) qualitativamente e quantitativamente por cromatografia líquida-electrospray espectrometria de massa de ionização-em tandem (LC-ESI-MS/MS). SM é um esfingolipídeos comum, composto por um phosphorylcholine e uma ceramida como o componente hidrofílico e hidrofóbico, respectivamente. Um número de espécies de SM está presente em células de mamíferos devido a uma variedade da esfingoides longa cadeia de base (LCB) e um N-moiety de acila na ceramida. Neste relatório, vamos mostrar um método de estimar o número de carbono e ligações duplas em uma LCB e um N-grupo acila baseia seus íons de produto correspondente em experimentos de MS/MS/MS (MS3). Além disso, apresentamos um método de análise quantitativa para SM usando duas estável desvendar rotulado SM espécies, que facilita a determinação do intervalo utilizado na quantificação da SM. O presente método será útil em caracterizando uma variedade de espécies de SM em amostras biológicas e produtos industriais como cosméticos.

Sintetizados quimicamente d18:1 / 24:0 SM (Figura 1A) e d18:1 / 24:0 SM em amostras de lipídios extraídas de células HeLa (Figura 1B) foram analisados por LC-ESI-MS3 empregando– [M + HCOO] e [M-CH3]- como íons precursor de primeiro e segundo, respectivamente. Observe que a intensidade de espectro de desmetilado-sphingosylphosphorylcholine (CPE) (m/z...

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar e qualificar cada espécie de esfingomielina usando múltiplas reação monitoramento e modo de MS/MS/MS, respectivamente.

Método quantitativo e qualitativo para esfingomielina por LC-MS usando dois estável desvendar rotulado esfingomielina espécies

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar com precisão a quantidade e a estrutura de cada espécie de Sphingomyelin em amostras biológicas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo lipídico relativas à biologia lipídica e lipídios A principal vantagem desta técnica é que podemos caracterizar uma variedade de espécies de esfingomielina em amostras biológicas por sistema de espectrometria de massa por cromatografia. Para começar, remova o meio de cultura de uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros contendo células HeLa e enxágue as células duas vezes com seis mililitros de PBS gelado.Em seguida, adicione um mililitro de PBS gelado na placa de cultura de tecidos de 10 centímetros e use um raspador de células para colher as células. Uma vez removidas da superfície do prato, transfira as células para dois tubos de plástico siliconizados de mililitro. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e adicione um mililitro de metanol a cada pellet celular.Em seguida, vórtice breve os tubos. Em seguida, coloque as amostras em um sonicador tipo banho e sonice a 200 watts por cinco minutos. Quando terminar, transfira todo o homogeneizado da célula para tubos de

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Para testar a interação de uma proteína com o seu alvo de lipídios foi utilizado MACS e anexina V conjugada esferas magnéticas e vesículas de lipídios sintetizados a partir de lipídios alvo e fosfatidilserina anexina V vinculativo. Proteínas vinculado à lipídica alvo são co-purificados e analisados ​​após eluição dos grânulos.

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

Este protocolo demonstrará a extração e análise de ácidos graxos bioativos livres e esterificados das células. Os ácidos graxos são quantificados com precisão usando diluição de isótopos estáveis, cromatografia líquida quiral, espectrometria de massa de monitoramento de reações múltiplas de ionização química atmosférica de captura de elétrons (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

Apresentamos um método para o uso de espectrometria de massa MALDI e química metilação redutiva para quantificar as mudanças na metilação da lisina.

Aplicação de Medidas para MassSQUIRM quantitativa da actividade demetilase Lisina

Um método específico e sensível para obter informações sobre o perfil de expressão de antígenos glicoesfingolipídeos em órgãos e células do sistema imunológico é descrito. O método tira partido da espectrometria de massa de iões armadilha permitindo passo a passo de fragmentação de moléculas de glicoesfingolipídeos para análise estrutural em comparação com padrões de síntese química.

Análise por espectrometria de massa de Antígenos glicoesfingolipídeos

Este protocolo descreve como realizar ensaios de quantificação absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas usando monitoramento de reação selecionado. Foi usado para quantificar com precisão as proteínas da via de sinalização da quimiotaxia de macrófagos de camundongos. A seleção de peptídeos alvo, o desenvolvimento do ensaio e os ensaios qualitativos e quantitativos são descritos em detalhes.

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Aqui mostramos plaquetas humanas isoladas podem ser usadas como uma acessível ex vivo modelo para estudar adaptações metabólicas em resposta ao inibidor do complexo I rotenona. Esta abordagem emprega rastreio isotópica e quantificação relativa por espectrometria de massa de cromatografia de líquido e pode ser aplicado a uma variedade de modelos de estudo.

LC-MS Análise de plaquetas humanas como uma plataforma para estudar mitocondrial Metabolism

Muitas (fosfo)lipases previstas são mal caracterizadas em relação às suas especificidades de substrato e funções fisiológicas. Aqui fornecemos um protocolo para otimizar as atividades enzimáticas, procurar substratos naturais e propor funções fisiológicas para essas enzimas.

Definindo substrato Especificidades para a lipase e fosfolipase candidatos

gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Os esfingolípidos são metabólitos bioativos com papéis bem estabelecidos na doença humana. Caracterizar alterações em tecidos com espectrometria de massa pode revelar papéis na etiologia da doença ou identificar alvos terapêuticos. No entanto, o composto OCT usado para criopreservação em biorrepositórios interfere na espectrometria de massa. Delineamos métodos para analisar esfingolipídios em tecidos humanos incorporados em OCT com LC-ESI-MS/MS.

Preparação de tecidos humanos incorporados em composto de temperatura de corte ideal para análise de espectrometria de massa

Aqui é apresentado um método para triagem de estruturas lipídicas por meio da marcação de isótopos estáveis, usando seu tempo de retenção, mobilidade e fragmentação.

Rastreamento de lipídios de novo usando marcação de isótopos estáveis LC-TIMS-TOF MS/MS

Aprenda a analisar esfingomielina em amostras biológicas por cromatografia líquida e espectrometria de massa. Este método permite caracterizar quantitativamente e qualitativamente as espécies lipídicas em células HeLa.

Método quantitativo e qualitativo para esfingomielina por LC-MS usando dois estável desvendar rotulado esfingomielina espécies

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