Método quantitativo e qualitativo para esfingomielina por LC-MS usando dois estável desvendar rotulado esfingomielina espécies

O objetivo geral deste procedimento é analisar com precisão a quantidade e a estrutura de cada espécie de Sphingomyelin em amostras biológicas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo lipídico relativas à biologia lipídica e lipídios A principal vantagem desta técnica é que podemos caracterizar uma variedade de espécies de esfingomielina em amostras biológicas por sistema de espectrometria de massa por cromatografia. Para começar, remova o meio de cultura de uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros contendo células HeLa e enxágue as células duas vezes com seis mililitros de PBS gelado.

Em seguida, adicione um mililitro de PBS gelado na placa de cultura de tecidos de 10 centímetros e use um raspador de células para colher as células. Uma vez removidas da superfície do prato, transfira as células para dois tubos de plástico siliconizados de mililitro. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e adicione um mililitro de metanol a cada pellet celular.

Em seguida, vórtice breve os tubos. Em seguida, coloque as amostras em um sonicador tipo banho e sonice a 200 watts por cinco minutos. Quando terminar, transfira todo o homogeneizado da célula para tubos de ensaio equipados com tampas de rosca revestidas de Teflon.

Agora adicione um mililitro de metanol, um mililitro de clorofórmio, 0,8 mililitros de água bidestilada em 50 microlitros de 10 micromolares de um padrão interno em cada tubo de ensaio. Tampe os tubos e agite-os vigorosamente a 2.500 rpm por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione mais um mililitro de clorofórmio e um mililitro de água destilada dupla a cada tubo.

Novamente, vórtice os tubos vigorosamente a 2.500 rpm por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue as amostras para separar completamente as fases aquosa e orgânica. Transfira a fase inferior para tubos de vidro descartáveis.

Adicione dois mililitros de clorofórmio nos tubos de ensaio. Em seguida, vórtice os tubos vigorosamente a 2.500 rpm por cinco minutos à temperatura ambiente para se misturar suficientemente com a fase superior e a penugem interfásica. Após uma segunda centrifugação, transferir a fase inferior modificada para os tubos de vidro descartáveis juntamente com a fase inferior inicial.

Agora coloque os tubos de vidro sob uma corrente de nitrogênio por aproximadamente 60 minutos e remova completamente os solventes orgânicos na fase inferior coletada. Por fim, reconstitua as amostras com 500 microlitros de metanol ou etanol. Filtre a mistura resultante com um filtro de 0,02 mícron em frascos de vidro.

Em seguida, armazene a amostra a menos 20 graus Celsius. Realize diluições em série do composto padrão e adicione 50 microlitros de cada concentração em tubos de ensaio separados. Em seguida, prepare três amostras de controle de qualidade adicionando uma quantidade dentro de três vezes o limite inferior da curva padrão para a primeira amostra, uma quantidade próxima ao centro da curva para a segunda amostra e uma quantidade próxima ao limite superior da curva padrão para a terceira amostra.

Em seguida, adicione o homogeneizado celular em um mililitro de metanol em cada tubo de ensaio e extraia a fração lipídica total de cada amostra usando o método que acabamos de mostrar. Para começar, prepare a fase móvel. Misture acetonitrila, metanol e água bidestilada na proporção de dois para dois para um para a fase aquosa.

Use isopropanol para a fase orgânica em garrafas de vidro com tampas de rosca revestidas de Teflon. Em seguida, sonicar ambas as fases móveis por cinco minutos em um sonicador tipo banho. Em seguida, adicione ácido fórmico a uma concentração final de 26,4 milimolares e hidróxido de amônio a 14,9 milimolares em cada fase móvel.

Para análise qualitativa, ativar o sistema de cromatografia líquida de alta eficiência. Coloque tubos de entrada nas garrafas de vidro que contêm as fases móveis e purgue as linhas de HPLC. Em seguida, vincule uma coluna de HPLC C18 ao sistema de HPLC.

Mantenha a temperatura no forno da coluna em 50 graus Celsius e condicione a coluna com a fase móvel aquosa em 100 microlitros por minuto. Durante a execução, coloque as amostras em um sample rack do amostrador automático. Defina os parâmetros do sistema de espectrometria de massa de armadilha de íons linear quádruplo triplo e quádruplo para análise de espectrometria de massa de três estágios, conforme listado na tabela um e na tabela dois do protocolo de texto que o acompanha.

Além disso, defina os parâmetros para o primeiro e o segundo íons precursores das espécies SM de interesse, conforme descrito em mais detalhes no protocolo de texto que acompanha. Crie um arquivo em lote e envie o arquivo em lote para obter os dados dos espectros de íons de três produtos MS de cada espécie de esfingomielina por cromatografia líquida, ionização por eletrospray, análise espectrométrica de massa em tandem. Obtenha os espectros de íons do produto MS trifásico das espécies de Sphingomielina de interesse por cromatografia líquida, ionização por eletrospray, análise de espectrometria de massa em tandem.

Em seguida, atribua a cada MS três espectros de íons de produto da esfingomielina comparando a razão massa/carga dos espectros de íons de produto na massa exata da base de cadeia longa esfingoide e da porção n-acila de interesse. Analise quantitativamente a esfingomielina usando cromatografia líquida, análise de espectrometria de massa em tandem de ionização por eletrospray, conforme descrito no protocolo de texto anexo. Em seguida, processe os dados de monitoramento de reações múltiplas usando o software para integração de dados para obter os dados da área de pico para o cromatograma de íons extraído de cada espécie de esfingomielina.

Quantifique cada espécie de esfingomielina e construa as curvas padrão conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. O espectro de esfingomielina e esfingomielina sintetizadas quimicamente em amostras lipídicas extraídas de células HeLa é mostrado aqui. É importante notar que a intensidade do espectro da esfingosilfosforilcolina desmetilada é maior do que a da fração SM n-acila em ambas as amostras.

Também de interesse, o espectro correspondente à esfingosina-1-fosfato é útil para especular o número de carbono e ligações duplas da base esfingomielina de cadeia longa da esfingomielina. No presente método quantitativo, é fundamental preparar com precisão as amostras para a construção da curva de calibração na validação deste método. A curva que se ajusta à baixa concentração foi claramente melhorada usando o fator de ponderação igual a um sobre x ao quadrado em comparação com o fator de ponderação de um ou um sobre x.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia e da indústria caracterizarem uma variedade de espécies de esfingomielina em amostras biológicas e produtos da indústria, como cosméticos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar com precisão a quantidade e a estrutura de cada espécie de esfingomielina em amostras biológicas. Não se esqueça de que trabalhar com absorventes pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de vidros adequados devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

Além disso, é importante usar luvas para evitar a contaminação de lipídios derivados de suas mãos.