LC-MS Análise de plaquetas humanas como uma plataforma para estudar mitocondrial Metabolism
4 de abril de 2016
Aqui mostramos plaquetas humanas isoladas podem ser usadas como uma acessível ex vivo modelo para estudar adaptações metabólicas em resposta ao inibidor do complexo I rotenona. Esta abordagem emprega rastreio isotópica e quantificação relativa por espectrometria de massa de cromatografia de líquido e pode ser aplicado a uma variedade de modelos de estudo.
O objetivo geral deste procedimento é determinar como um tratamento xenobiótico ou um estado de doença altera o metabolismo celular. Este método tem o potencial de revelar como um estado de doença ou uma toxina aplicada afeta o metabolismo celular. E uma vez que isso seja conhecido, nosso método tem a capacidade de revelar se algum tipo de intervenção pode corrigir o defeito.
A principal vantagem dessa técnica é que ela não depende de linhagens celulares transformadas, por isso é mais provável que forneça respostas diretamente relevantes para a saúde humana. Para iniciar este procedimento, preparar uma solução-mãe de rotenona a 10 milimolares em dimetilsulfóxido. Efectuar uma diluição em série da solução-mãe de rotenona a 10 milimolares para obter soluções com concentrações de rotenona que variem entre um nanomolar e 100 micromolares.
Em seguida, adicione 50 microlitros de cada solução-mãe a cinco mililitros de uma solução tampão de Tyrode enriquecida previamente preparada para preparar soluções com concentrações de rotenona variando de 10 picomolares a um micromolar. Adicione 50 microlitros de DMSO a uma das amostras de solução tampão para servir como controle do veículo. Para isolar as plaquetas do sangue total, centrifugue amostras de sangue total a 175 x g por 15 minutos sem interrupções.
Quando terminar, transfira um mililitro da camada superior de plasma rico em plaquetas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Ao transferir o plasma rico em plaquetas, tome cuidado para não perturbar o revestimento leucocitário para que o pellet de plaquetas não seja contaminado por linfócitos. Centrifugar a camada de plasma rico em plaquetas a 400 x g durante cinco minutos.
Em seguida, aspire o sobrenadante. Usando pelo menos três réplicas biológicas para cada condição, ressuspenda o pellet de plaquetas em um mililitro de cada solução de rotenona previamente preparada. Em seguida, incube as plaquetas ressuspensas em uma incubadora de dióxido de carbono com camisa de água ajustada para 95% de umidade e 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora.
Neste ponto, pelete as plaquetas centrifugando as amostras a 3000 x g por três minutos. Depois de aspirar o sobrenadante, adicionar o padrão interno marcado com isótopos estáveis adequado. Em seguida, ressuspenda as plaquetas em 750 microlitros de ácido tricloroacético a 10% gelado.
Sonicar cada amostra por pulso 30 vezes com pulsos de 0,5 segundo. Após a centrifugação, afixar as colunas de extração em fase sólida C18 a um coletor de vácuo. Condicione as colunas com um mililitro de metanol.
Em seguida, equilibre as colunas com um mililitro de água bidestilada Execute o sobrenadante derivado de amostra pelas colunas. Quando terminar, lave as colunas com um mililitro de água.
Em seguida, carregue tubos de centrífuga de vidro de 10 mililitros no coletor de vácuo para coletar as frações de eluição. Eluir as colunas com um mililitro de acetato de amónio 25 milimolar e metanol. Após a secagem do eluído sob gás nitrogênio, ressuspenda os resíduos secos em 50 microlitros de ácido 5%5-sulfosalicíclico e transfira as amostras para arquivos HPLC para análise.
Conforme relatado anteriormente em células SH-SY5Y, supõe-se que as alterações nos níveis relativos de tioésteres de aceil CoA em resposta à rotenona resultem da inibição do complexo. Especificamente, há uma diminuição dependente da dose no succinil CoA com um aumento simultâneo no beta-hidroxibutiril-CoA, enquanto os níveis de acetil CoA permaneceram inalterados. A análise de plaquetas humanas tratadas com rotenona revela resultados altamente consistentes e fornece um conjunto único de dados experimentais.
É importante notar que essa observação ressalta a dependência mitocondrial da resposta à rotenona porque as plaquetas não têm núcleo. Após este procedimento, outros métodos como rastreamento metabólico podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como: Como esse tratamento ou estado de doença afeta a utilização do substrato? Se identificarmos mudanças nos níveis de algum metabólito, por que ele está mudando?
Quais etapas do caminho são afetadas e de que maneira? Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar plaquetas do sangue total, realizar o desafio ex-vivo controlado e extrair os tioésteres de aceíla CoA para análise de LCMS.
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Visão Geral
Este estudo demonstra o uso de plaquetas humanas isoladas como um modelo ex vivo para investigar adaptações metabólicas em resposta ao inibidor da complexo I rotenona. O método emprega rastreamento isotópico e cromatografia líquida-espectrometria de massas para quantificação relativa, tornando-o aplicável a diversos delineamentos de estudo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Metabolismo celular
- Farmacologia
- Relevância para a saúde humana
Antecedentes
- Compreender como os xenobióticos afetam o metabolismo celular é fundamental.
- Plaquetas humanas isoladas fornecem um modelo relevante em comparação com linhagens celulares transformadas.
- Essa abordagem pode ajudar a identificar intervenções potenciais para defeitos metabólicos.
- Rotenona é utilizada como inibidor do complexo I para estudar alterações metabólicas.
Objetivo do Estudo
- Determinar os efeitos do tratamento com xenobióticos no metabolismo celular.
- Explorar como os estados patológicos alteram os processos metabólicos.
- Avaliar o potencial de intervenções para corrigir defeitos metabólicos.
Métodos Utilizados
- Preparação de uma solução estoque de 10 milimolar de rotenona em dimetil sulfoxido.
- Diluição seriada do estoque de rotenona para obter concentrações variadas.
- Rastreamento isotópico para análise metabólica.
- Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas para quantificação.
Resultados Principais
- Plaquetas isoladas modelam efetivamente as respostas metabólicas à rotenona.
- O rastreamento isotópico revela adaptações metabólicas significativas.
- A espectrometria de massas com cromatografia líquida fornece quantificação precisa.
- O método é aplicável a diversos delineamentos experimentais.
Conclusões
- As plaquetas humanas isoladas são um modelo valioso para o estudo do metabolismo.
- Essa abordagem pode gerar insights sobre os mecanismos das doenças e terapias potenciais.
- Estudos futuros podem expandir este método para explorar outras vias metabólicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
As plaquetas humanas oferecem um modelo clinicamente relevante e não transformado para o estudo do metabolismo mitocondrial e dos efeitos de xenobióticos, abordando as limitações das linhagens celulares tumorais na pesquisa metabólica. Esta plataforma permite a análise reprodutível e específica do doador de alterações nas vias metabólicas, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. A escalabilidade por meio da obtenção de sangue de bancos de sangue facilita a continuidade translacional desde a descoberta básica até estudos pré-clínicos e clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a análise das respostas mitocondriais a inibidores do complexo I, como a rotenona.
- Valor Operacional: Fornece um sistema relevante para humanos que reduz variáveis confundidoras decorrentes da reprogramação metabólica em linhagens celulares transformadas.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da detecção consistente de alterações metabólicas compensatórias, como o aumento da oxidação de ácidos graxos após inibição da glicólise.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas por LC-MS de tiosteres de acil-CoA, permitindo quantificação relativa e marcação isotópica para avaliação da atividade específica de vias metabólicas.
- Valor Operacional: Fornece perfis reprodutíveis de metabólitos entre réplicas biológicas, apoiando a padronização de ensaios para campanhas de triagem de xenobióticos.
- Escalabilidade: O isolamento de plaquetas a partir de doadores individuais ou bancos de sangue permite a produção escalável de amostras metabolicamente ativas para triagem de alto conteúdo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta as respostas plaquetárias ex vivo às adaptações metabólicas in vivo, apoiando a validação pré-clínica alinhada a biomarcadores.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece se as alterações metabólicas observadas são dependentes de mitocôndrias, conforme evidenciado pelas respostas em plaquetas anucleadas.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite avaliar a eficácia da intervenção na reversão de defeitos metabólicos, orientando decisões de avançar/não avançar na otimização de compostos líderes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e avaliação pré-clínica, especialmente para compostos direcionados às mitocôndrias e moduladores metabólicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre os efeitos de xenobióticos no metabolismo celular ao isolar as respostas das plaquetas ao tratamento com rotenona dependente da dose.
- Triagem: Permite o preparo de plaquetas prontas para ensaio para análise por LC-MS, gerando saídas quantitativas reprodutíveis para triagem de bibliotecas de compostos.
- Análises: Fornece quantificação relativa dos tiolésteres acetil-CoA, succinil-CoA e beta-hidroxibutiril-CoA, permitindo a comparação do fluxo metabólico entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se à continuidade pré-clínica ao modelar adaptações metabólicas relevantes para estados patológicos e intervenções terapêuticas.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado de isolamento de plaquetas e extração de metabólitos aplicável em múltiplos projetos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao utilizar um modelo humano fisiologicamente relevante que evita artefatos de linhagens celulares cancerígenas.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de isolamento de plaquetas, desafio ex vivo e extração de metabólitos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a detecção precoce de deficiências metabólicas, reduzindo a eliminação em estágios avançados devido à toxicidade mitocondrial inesperada.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos com base em seus efeitos sobre vias metabólicas centrais em um sistema relevante para humanos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em isolamento de plaquetas, manipulação estéril de células e metabolômica por LC-MS/MS.
- Depende do acesso a equipamentos de centrifugação, manifolds a vácuo para extração em fase sólida e sistemas de HPLC-MS.
- Necessita padronização na preparação de plasma rico em plaquetas e na dosagem de rotenona entre laboratórios e doadores.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes xenobióticos e esquemas de marcação isotópica.
- Limitado pela viabilidade plaquetária ex vivo e pela necessidade de processamento imediato após o isolamento para manter a integridade metabólica.
