LC-MS Análise de plaquetas humanas como uma plataforma para estudar mitocondrial Metabolism

O objetivo geral deste procedimento é determinar como um tratamento xenobiótico ou um estado de doença altera o metabolismo celular. Este método tem o potencial de revelar como um estado de doença ou uma toxina aplicada afeta o metabolismo celular. E uma vez que isso seja conhecido, nosso método tem a capacidade de revelar se algum tipo de intervenção pode corrigir o defeito.

A principal vantagem dessa técnica é que ela não depende de linhagens celulares transformadas, por isso é mais provável que forneça respostas diretamente relevantes para a saúde humana. Para iniciar este procedimento, preparar uma solução-mãe de rotenona a 10 milimolares em dimetilsulfóxido. Efectuar uma diluição em série da solução-mãe de rotenona a 10 milimolares para obter soluções com concentrações de rotenona que variem entre um nanomolar e 100 micromolares.

Em seguida, adicione 50 microlitros de cada solução-mãe a cinco mililitros de uma solução tampão de Tyrode enriquecida previamente preparada para preparar soluções com concentrações de rotenona variando de 10 picomolares a um micromolar. Adicione 50 microlitros de DMSO a uma das amostras de solução tampão para servir como controle do veículo. Para isolar as plaquetas do sangue total, centrifugue amostras de sangue total a 175 x g por 15 minutos sem interrupções.

Quando terminar, transfira um mililitro da camada superior de plasma rico em plaquetas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Ao transferir o plasma rico em plaquetas, tome cuidado para não perturbar o revestimento leucocitário para que o pellet de plaquetas não seja contaminado por linfócitos. Centrifugar a camada de plasma rico em plaquetas a 400 x g durante cinco minutos.

Em seguida, aspire o sobrenadante. Usando pelo menos três réplicas biológicas para cada condição, ressuspenda o pellet de plaquetas em um mililitro de cada solução de rotenona previamente preparada. Em seguida, incube as plaquetas ressuspensas em uma incubadora de dióxido de carbono com camisa de água ajustada para 95% de umidade e 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora.

Neste ponto, pelete as plaquetas centrifugando as amostras a 3000 x g por três minutos. Depois de aspirar o sobrenadante, adicionar o padrão interno marcado com isótopos estáveis adequado. Em seguida, ressuspenda as plaquetas em 750 microlitros de ácido tricloroacético a 10% gelado.

Sonicar cada amostra por pulso 30 vezes com pulsos de 0,5 segundo. Após a centrifugação, afixar as colunas de extração em fase sólida C18 a um coletor de vácuo. Condicione as colunas com um mililitro de metanol.

Em seguida, equilibre as colunas com um mililitro de água bidestilada Execute o sobrenadante derivado de amostra pelas colunas. Quando terminar, lave as colunas com um mililitro de água.

Em seguida, carregue tubos de centrífuga de vidro de 10 mililitros no coletor de vácuo para coletar as frações de eluição. Eluir as colunas com um mililitro de acetato de amónio 25 milimolar e metanol. Após a secagem do eluído sob gás nitrogênio, ressuspenda os resíduos secos em 50 microlitros de ácido 5%5-sulfosalicíclico e transfira as amostras para arquivos HPLC para análise.

Conforme relatado anteriormente em células SH-SY5Y, supõe-se que as alterações nos níveis relativos de tioésteres de aceil CoA em resposta à rotenona resultem da inibição do complexo. Especificamente, há uma diminuição dependente da dose no succinil CoA com um aumento simultâneo no beta-hidroxibutiril-CoA, enquanto os níveis de acetil CoA permaneceram inalterados. A análise de plaquetas humanas tratadas com rotenona revela resultados altamente consistentes e fornece um conjunto único de dados experimentais.

É importante notar que essa observação ressalta a dependência mitocondrial da resposta à rotenona porque as plaquetas não têm núcleo. Após este procedimento, outros métodos como rastreamento metabólico podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como: Como esse tratamento ou estado de doença afeta a utilização do substrato? Se identificarmos mudanças nos níveis de algum metabólito, por que ele está mudando?

Quais etapas do caminho são afetadas e de que maneira? Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar plaquetas do sangue total, realizar o desafio ex-vivo controlado e extrair os tioésteres de aceíla CoA para análise de LCMS.