Name: Métodos de entrega Double-stranded RNA Oral para induzir a interferência do RNA no floema e insetos Hemipteran planta-sap-alimentação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprenda métodos de entrega oral de dsRNA para induzir interferência de RNA em insetos hemípteros sugadores de seiva. Esta técnica permite silenciar genes específicos no floema de plantas para controle de pragas agrícolas.

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Os autores reconhecem com gratidão Donald Weber e Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) para fornecer BMSB e HB para experimentação e manter as colônias; e Maria T. Gonzalez, Salvador P. Lopez, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) e Jackie L. Metz (Universidade da Flórida, Fort Pierce, FL) para manutenção da colônia, preparação de amostras e análises.

1. BMSB criação
<ol><li>Traseira BMSB insetos como por prática de laboratório padrão e descrito anteriormente63.</li>
	<li>Levante os insetos ACP (d. citri) em Citrus macrophylla em uma estufa (22 ° C) e a luz natural. Uso adulto ACP, em aproximadamente 5-7 dias pós eclosão.</li>
</ol>2. seleção de Gene regiões e síntese In Vitro de dsRNA
<ol><li>Selecione os genes específicos para BMSB publicados anteriormente transcriptome perfis32.</li>
	<li>Certifique-se de regiões de interesse selecionados variam entre 200 a 500 pares de bases.</li>
	<li>Realize a reação em cadeia da polimerase (PCR) usando as condições descritas abaixo para gerar fragmentos associados com o gene selecionado de interesse do DNA genômico. Consulte a tabela 1 para os oligonucleotides gene-específico.<ol>
<li>Reação de PCR: em um tubo PCR de 0,25 mL, combinar 5 µ l de 10x Buffer PCR, 4 µ l de dNTP mistura (2,5 mM cada), 2 µ l do molde de ADN (50 ng / µ l), 2,5 μL de cada de Primers 1 e 2 (10 µM), 0,25 µ l de DNA polimerase (5 U / µ l) , e DNase/RNase livre até 50 µ l de água.</li>
		<li>Condição PCR: ciclo da reação de PCR para amplificar a região de interesse a 95 ° C por 3 min, seguido de 30 ciclos de 98 ° C por 10 s, 55 ° C por 30 s, 72° C por 1 min. Incubar a reação a 72 ° C para um adicional 10 min. Purify a reação de PCR usando um kit de purificação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplificar os fragmentos obtidos de PCR ainda mais com primers específicos de gene ladeados com a sequência de promotor T7 RNA polimerase (5'-GAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA-3') como mencionado anteriormente,62.</li>
	<li>Use o gene LacZ como um controle negativo (simulação) para RNAi. Nota: LacZ é um gene que codifica a β-galactosidase amplificada do DNA genômico de Escherichiacoli (os primers utilizados são listados na tabela 1).</li>
	<li>Execute em vitro transcrição para render dsRNA como descrito anteriormente62.</li>
	<li>Dissolver e resuspenda o dsRNA resultante em 150 µ l DNase/RNase livre água, medir a concentração e armazenar a-80 ° C para uso futuro.</li>
</ol>3. entrega do dsRNA usando verde feijão
<ol><li>Selecione cedo 4th ínstar BMSB ninfas nascidas da mesma massa de ovo e privá-los durante 24 h antes da alimentação dsRNA.</li>
	<li>Selecione Delgado certificada orgânica verde feijão (Phaseolus vulgaris L.) e lavar com solução de hipoclorito de sódio 0,2% por 5 min. Nota: Delgado feijão verde foram selecionado para que os grãos facilmente podem ser acomodados em tubos de microcentrifuga de 2 mL.</li>
	<li>Lavar 3 vezes com O ddH2e deixar secar ao ar.</li>
	<li>Corte o feijão verde, desde o final do cálice para um comprimento total de 7,5 cm, usando uma lâmina de barbear limpa.</li>
	<li>Mergulhe os grãos verdes lavados e cortados em um tubo de 2 mL de tampão-menos microcentrifuga contendo 300 µ l de solução de controle (um 01:10 diluição de corante alimentar verde (ingredientes: água, propileno glicol, Fd & C amarelo 5, Fd & C Blue 1 e propilparabeno como conservante)).</li>
	<li>Faça diluições do em vitro sintetizaram dsRNAs LacZ, JHAMT ou Vg por diluição µ g 5 ou 20 µ g/ml 300 µ l de água livre de RNase/DNase para produzir concentrações finais de 0,017 µ g / µ l ou 0,067 µ g / µ l, respectivamente.</li>
	<li>Mergulhe os grãos verdes lavados e cortados em um tubo de microcentrifugadora cap-menos 2 mL contendo 300 µ l de solução de dsRNA (da etapa 3.6).</li>
	<li>Embrulhe e selar as bordas dos tubos microcentrifuga encerram o feijão imerso para evitar a evaporação da solução dsRNA e para impedir que os animais entre o tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Coloque estes tubos de forma vertical em temperatura ambiente por 3 h permitir que a solução do dsRNA ser carregado durante todo o feijão verde por ação capilar.</li>
	<li>Coloque estes tubos na cultura limpa os vasos (polipropileno). Lugar três fome 4th ínstar ninfas BMSB nos vasos cultura.</li>
	<li>Trate a três animais por navio de cultura cada um contendo três feijões verdes com solução de coloração ou dsRNA alimento verde. Manter os insetos em 25 ° C e 72% umidade relativa, sob um fotoperíodo de 16 L: 8 em uma incubadora.</li>
	<li>Permitir que os insetos para se alimentar de feijão verde (imerso e absorvido com dsRNA) por 5 dias mas reabastecer com dietas frescas dos grânulos de tratamento verde dsRNA após 3 dias.</li>
</ol>4. em tempo real quantitativa (qPCR) análise de expressão seguinte RNAi mediada silenciamento em BMSB
<ol><li>Medir o efeito de RNAi sobre os níveis de expressão de transcrição por qPCR.</li>
	<li>Isolar o RNA total de animais Tratado de dsRNA e sintetizar o cDNA62.</li>
	<li>Configure as reações de qPCR usando um sistema PCR em tempo real e os primers listados na tabela 1. Use a seguinte condição de ciclismo qPCR: 95 ° C por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 1 min, juntamente com a etapa de dissociação, incluindo 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 1 min, 95 ° C por 15 s e 60 ° C durante 15 s.</li>
	<li>Determinar os padrões de qPCR: usar a diluição serial do cDNA preparado a partir de isolados de um animal normal como um padrão de referência para a quantificação de RNA total.</li>
	<li>Use BMSB 18s RNA como padrão interno para corrigir as diferenças na recuperação de RNA de tecidos32.</li>
</ol>5. aplicação de Spray foliar em grandes árvores cítricas em vasos e mudas
Nota: As plantas da cultivar cítrico citrange 'Carrizo' (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae), foram mantidas em estufa sob luz natural e temperatura, cultivadas em recipientes de 1,2 L. As plantas foram podadas constantemente para promover o crescimento de novos brotos foliares, chamado 'flush'. ACP prefere alimentação e oviposição no novo crescimento do citrino64.
<ol><li>Selecione as plantas ou mudas e não molhá-los durante 2-3 dias antes de usar para deixar o solo secar a umidade, mas não completamente seco.</li>
	<li>Usando um frasco de spray de bomba de mão aplicar um 200 mL de solução de dsRNA (0,5 mg/mL) para o dossel inferior (Figura 4A). Nota: Preparar o acima mencionado dsRNA soluções em água livre de RNase/DNase.</li>
	<li>Pós-spray de aplicação, permitem que a solução aplicada dsRNA ser completamente absorvido pelas folhas. Nota: Citros absorveram o dsRNA aplicado, e depois folhas de qualquer novo crescimento ou de ramos que foram cobertos antes da aplicação, foram extraídos; o dsRNA foi detectável usando qPCR e mostrou o movimento sistêmico nas folhas árvore dossel superior em 3-4 h44,,45,46.</li>
	<li>Experimente o novo crescimento das árvores previamente cobertos depois 25-40 dias coletando aproximadamente 10 folhas das pontas dos quatro ramos. Extraia o RNA total e analisá-lo por transcrição reversa PCR (RT-PCR) e qPCR para a presença do gatilho dsRNA aplicada usando as primeiras demão listados na tabela 1 e descrito anteriormente métodos46. Nota: A coleta de amostra, total isolamento de RNA, RT-PCR e qPCR foram realizados como descrito anteriormente,46.</li>
	<li>Da mesma forma, topicamente pulverizador 10ml dsRNA à região mais baixa de uma plântula ou folhagem de pequena árvore em vaso. Nota: Hemipteran insetos (ACP e GWSS) foram dadas acesso alimentação normalmente em 24h, pós tratamentos no crescimento novo (folhas) que não tinha sido pulverizado diretamente, ou que cresceu semanas mais tarde, ou plantas inteiras. Isto produziu insetos que testado positivo para o dsRNA em 3, 6 e 10 dias, pós alimentação.</li>
</ol>6. solo/raiz Drench aplicação em grandes ou pequenas em vaso mudas e árvores de citrinos
<ol><li>Selecione as plantas ou mudas e não molhá-los durante 2-3 dias antes de usar para deixar o solo seque a úmido mas não completamente seco (isso cria espaço de ar para manter a solução líquida a ser aplicada).</li>
	<li>Adicionar 1 L da solução de dsRNA (0,2 mg/mL) para o solo de plantas em vasos grandes (cerca de 2,5 m) e adicionar 1 litro de água (caçador) depois de 1 h.</li>
	<li>Aplicam-se as árvores de 100 mL de solução de dsRNA (1,33 mg/mL) para o solo de 1 m de altura em vaso em solos parcialmente secos.</li>
	<li>Para pequenas mudas, aplica 10 mL da solução de dsRNA (1 mg/mL) para o solo nos cones ou as próprias raízes (Figura 4B, C).</li>
	<li>Permitir que as plantas que recebem a solução de dsRNA aplicada como um embebe de solo de molho por 30 min. Em seguida aplica o único tratamento de água para ajudar a absorção pelas raízes (20 mL para plantas em recipientes amarelos), ou 100 mL se vasos para plantas maiores são > 1 galão. Nota: DsRNA aplicado topicamente a folhagem resultou na deteção pelo mais distais dicas de ramos dentro de tratamentos de post de 3-6 h, mostrando a circulação sistêmica através de árvores. Novos ramos de crescimento testaram positivo para dsRNA em 60-90 dias pós tratamentos. Estacas são fornecidas aos insetos (ACP e GWSS) em um dsRNA alimentação bioensaio44.</li>
</ol>7. haste torneira (injeção de tronco de árvore) aplicação em grandes árvores cítricas em vasos e mudas
<ol><li>Selecione mudas cítricas, novo, ou aproximadamente 3,5 anos velhas plantas para injetar dsRNA usando a haste torneira método (injeções de tronco).</li>
	<li>Fure as plantas cítricas, usando uma furadeira e uma broca de 10 mm, tomando cuidado para não ultrapassar 2 cm, ou cerca de metade do diâmetro da haste.</li>
	<li>Enrole a ponta de cobre de cada injector 4 - 6 vezes com uma larga faixa de 0,6 cm (¼ de polegada) de selagem de filme para impedir o escapamento perto da ponta.</li>
	<li>Encha os injectores de tronco de árvore com 6 mL (1,7 mg/mL) do dsRNA solução diluída em água livre de DNase/RNase (denotada aqui como solução colorida).</li>
	<li>Injetar a solução no tronco da árvore e deixe o injector na mala para 6-10 h permitir a absorção da solução dsRNA. Permitir que os insetos se alimentam os cortes de árvores tratadas em 3, 10 e 30 dias pós tratamento. Nota: O dsRNA injetado usando o método de injeção de tronco persistiu nas árvores, por um período de 30-60 dias41,42,44. Validação para RNAi foi realizada por qPCR usando as primeiras demão listadas na tabela 1.</li>
</ol>8. dsRNA grânulos de argila Tratado para a entrega de insetos através de solo
<ol><li>Deite fora a argila absorvente em um tubo cónico de 50 mL até a marca de 35 mL (aproximadamente 30 g de argila absorvente) no tubo.</li>
	<li>Despeje o tubo para molhar todo o absorvente, 20 mL de solução de dsRNA diluída em água livre de DNase/RNase (100 µ g/mL). Tampar o tubo cônico, ponta do tubo para ajudar a remover o ar e o tubo do tampão.</li>
	<li>Colocar o tubo na posição vertical e deixe ficar por 1-2 min para as partículas de argila absorver a solução.</li>
	<li>Adicione suficiente encharcada de dsRNA argila na mistura solo para encher um pote de 1 galão.</li>
	<li>Misturar e preparar o solo com a mão para homogeneizar completamente encharcada de dsRNA argila no solo.</li>
	<li>Use este solo para replantar mudas selecionadas para o tratamento de dsRNA.</li>
	<li>Água do solo com 200 mL de água pura sem dsRNA. Depois de 30 min a 1 h, siga com 100 mL de água pura. Após 24h, colocar a planta em uma programação de rega normal.</li>
	<li>Teste 4-6 folhas de vasos de plantas tratadas com absorventes de argila e dsRNA tratamento de post cada mês para dsRNA, recolhendo as folhas apicais mais novo do crescimento das plantas. Nota: Plantas ou mudas destas plantas tratadas são alimentadas com insetos após 24h pós tratamento e ter sido capaz de entrega RNAi para até um ano de insetos (dados não publicados).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

RNAi tem provado para ser uma importante ferramenta para explorar a função biológica do gene e o regulamento, com grande potencial para ser utilizado para a gestão de pragas19,68,69,70, 71. o projeto e a seleção de um genes apropriados para silenciar em uma determinada espécie de inseto e o método de entrega de dsRNA(s) o correspondente para o inseto são de e...

Hemipteran insetos compõem algumas das pragas mais economicamente importantes do agriculturebecause de sua capacidade para atingir o crescimento populacional elevado e espalhar doenças em plantas. O BMSB, H. Hális Stål, é uma praga invasora que foi introduzida acidentalmente no hemisfério ocidental em Allentown, Pensilvânia da Ásia (China, Taiwan, Coreia e Japão) com o primeiro avistamento relatado em 19961. Desde a sua introdução, o BMSB foi detectada em 43 Estados, com as populações mais altas no meio do Atlântico (DE, MD, PA, NJ, VA e WV), bem como no Canadá e Europa e representa uma ameaça potencial para a agricultura2. Como uma praga polífaga, BMSB pode instigar danos para aproximadamente 300 hosts de plantas identificadas, incluindo culturas de alto valor, tais como maçãs, uvas, plantas ornamentais, oleaginosas, soja e milho. Dano é causado principalmente devido ao modo de alimentação conhecido como lacerate e nivelado, onde o animal atravessa a cultura do anfitrião com seu estilete da agulha para obter acesso aos nutrientes do tecidos vasculares2,3. BMSB também é um interior de pragas que podem encontrar residência em áreas vivas, tais como escolas e casas durante o outono até o inverno de2. Produtos químicos e aeroallergens lançadas pela BMSB foram relatadas como ilícita reação alérgica em trabalhadores de colheita de frutas. BMSB também pode contribuir para doença alérgica levando a dermatite de contato, conjuntivite e rinite em indivíduos sensíveis4,5. Outro inseto hemipteran, o ACP, d. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), é uma séria Praga de frutas cítricas e transmite a bactéria limitada no floema (Candidatus Liberibacter asiaticus) causando Huanglongbing (HLB), mais conhecido como cítricas greening doença6,7. HLB foi primeiramente relatada do Sul da China e se espalhou para 40 diferentes asiático, África, Oceania, Sul e norte-americano países7. Cítrica greening é um problema mundial com ameaça de perdas económicas e financeiras devido à perda de citrinos; Portanto, gestão da ACP é considerada de suma importância para prevenir e controlar o HLB.
Medidas para o controle efetivo destas pragas de insetos geralmente requer a aplicação de pesticidas químicos que são relativamente curto viveu. Estratégias de controle químico insecticida muitas vezes faltam de estratégias de gestão ambiental segura ou diminuíram a susceptibilidade devido à resistência de pesticidas em populações de pragas8,9. Portanto, o controle biológico de pragas com biopesticidas moleculares é uma alternativa potencial, mas seu uso permanece globalmente modesto, e várias espécies de parasitoides (por exemplo, Trisolcus japonicus) podem também ser eficazes como biológico natural controles. RNAi é um potencial de tecnologia para o gerenciamento de pragas invasoras com biopesticidas molecular10emergente. RNAi é um mecanismo regulatório de gene bem descrito que facilita o silenciamento de genes posttranscriptional eficaz de endógenos bem como invadir dsRNAs de maneira sequência-específicos, que eventualmente leva a regulação da expressão do gene no mRNA nível11,12. Brevemente, quando dsRNA exógeno é internalizado em uma célula, que ele é processado em siRNAs por um membro da superfamília de RNase III nuclease bidentado, chamado Dicer, que é conservado evolutivamente em moscas, vermes, plantas, fungos e mamíferos13, 14 , 15. estes duplex de siRNA 21-25 nucleotídeos são então desenrolados e integrados no complexo RNA-induced silencioso (RISC) como guia de RNAs. Este complexo RISC-RNA permite o pareamento de Watson-Crick base para o complementar destino mRNA; eventualmente, isto leva a clivagem pela proteína Argonaute, uma proteína de multi domínio que contém um domínio de H-como RNase, que degrada o mRNA correspondente e reduz a tradução da proteína, levando assim ao silenciamento16 do gene posttranscriptional , 17 , 18.
RNAi para gestão de pragas requer a introdução do dsRNA na vivo para silenciar o gene de interesse, ativando assim o percurso de siRNA. Diversos métodos que foram usados para dsRNA entrega aos insetos e células de inseto para induzir RNAi sistêmica incluem alimentação10,19,20,21, microinjeção22, portadores de imersão como lipossomas 23e outras técnicas de24. RNAi foi primeiro demonstrado em elegans de Caenorhabditis para silenciar a expressão de gene unc-22 pelo fogo e Mello25, seguido por nocaute na expressão dos genes em Drosophila melanogaster26crespos. Os estudos funcionais iniciais utilizaram microinjeção para entregar dsRNA em insetos, como Apis mellifera22,27, piolho pisum28, Blattella germanica29, H. Hális30e insetos lepidópteros (revistos por Terenius et al 31). microinjection é vantajosa para entregar uma dose exata e precisa para o site de interesse no inseto. Embora tais puncturas sépticas podem eliciar a expressão de genes relacionados imunes devido a trauma32, portanto, descartando sua praticidade em desenvolvimento agrícola biopesticidas.
Outro método de entrega de dsRNA na vivo é por imersão, que envolve ingestão ou absorção do dsRNA por suspensão de animais ou células geralmente no meio extracelular, contendo dsRNA. Imersão foi usado para induzir eficientemente RNAi em células de cultura de tecidos de drosófila S2 para inibir a jusante-de-Raf1 (DSOR1) o mitogen-ativado proteína quinase quinase (MAPKK)20, assim como em c. elegans para silenciar o pos-1 gene33. No entanto, dsRNA entregado usando imersão é menos eficiente para induzir RNAi comparado a microinjeção20. RNAi mediada silenciar em um inseto mastigação era primeiro mostrado no repele milho (RPT) (Diabrotica virgifera virgifera) infundindo o dsRNA em uma dieta de ágar artificial10. Relatórios anteriores tem resumido métodos para entregar dsRNA infundido em dietas naturais específicas para artrópodes34. Esses métodos de entrega foram ainda mais determinados a ser comparavelmente eficazes meios artificiais de entrega; Como é o caso da mosca tsé-tsé (Glossina morsitans morsitans), onde "knockdown" igual de um gene imune-relacionados foi observado quando dsRNA foi entregue por meio de farinha de sangue ou microinjected35. Da mesma forma, a entrega do dsRNA através de gotículas no apple marrom luz traça (Epiphyas postvittana)36, diamondback moth (Plutella plutella) larvas37, bem como as abelhas de mel38,39 induzida por RNAi eficiente. Experimentos de RNAi mais eficazes em hemipteran têm utilizado a injeção do dsRNA40 porque entrega oral do dsRNA em insetos hemipteran é árdua, já que ele deve ser entregue através de tecidos vasculares da planta hospedeira. RNAi eficaz também foi observada em ACP e Cicadellidae atirador-de-asa-vítreo (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA foi entregue através de citros e as videiras que tinham absorvido os tecidos vasculares através de embebe de raiz, foliar dsRNA pulverizadores, injeções de tronco ou absorção por estacas41,42,,43,44,45,46. Isto também resultou na primeira patente para dsRNA contra o ACP (2016, nos 20170211082 A1). Entrega de siRNA e dsRNA usando as transportadoras como nanopartículas e lipossomas transmite estabilidade, e aumento da eficácia do dsRNA entregues rapidamente está surgindo23,,47,48,49 ,50. Uma nova classe de veículos de entrega baseados em nanopartículas de ácidos nucleicos para in vitro e em vivo que foi resumida especificamente para aplicações terapêuticas podem dar imenso potencial como vectores de entrega adequada51. Nanopartículas como um veículo de entrega para dsRNA podem ter desvantagens incluindo solubilidade, hidrofobicidade ou limitada bioacumulação52, mas uma entrega ajudando polímero apropriado pode compensar estas desvantagens. Desenvolvimento e uso de auto entrega de nucleotídeos emergem também chamados 'oligonucleotides antisentido', que são o único encalhado RNA/DNA duplex46.
Vitelogênese nos Artrópodes é uma chave de processo de controle de reprodução e regulado pelo hormônio juvenil (JH) ou isoinokosterone, que são as chaves indutores da síntese de Vg pela gordura corporal; o Vg é eventualmente ocupado pelo oócito em desenvolvimento através de de endocitose receptor mediado Vg53. VG é um grupo de polipeptídeos sintetizados extraovarially, que é essencial para o desenvolvimento da proteína de gema de ovo grande, vitelina54,55, e portanto, é importante na reprodução e envelhecimento56. VG foi silenciada com êxito em nematoides57 , bem como em abelhas (Apis mellifera) onde RNAi mediada por esgotamento de Vg foi observada em adultos e ovos22. RNAi mediada silenciamento posttranscriptional de Vg foi testado porque pensava que seu esgotamento conduziria a um efeito fenotípico observável como reduzida fertilidade e fecundidade, potencialmente ajudar no controle BMSB. O gene JHAMT que codifica a S-adenosyl-L-metionina (SAM)-dependente JH ácido O-Metiltransferase, catalisa a etapa final da biossíntese JH via58. Neste caminho Farnesil pirofosfato (FPP) sequencialmente é transformado de farnesol, ao ácido farnesoic, seguido por conversão de metil farnesoate JH por JHAMT. Esta via é conservada em insetos e artrópodes especificamente para a metamorfose, um processo que mentalmente é regulamentado por hormônios59,60,61. Em b. mori, expressão do gene JHAMT e a atividade biossintética de JH na Corpora allata sugerem que a supressão transcricional do gene JHAMT é crucial para a rescisão de JH biossíntese58. Portanto, os genes JHAMT e Vg foram selecionados para esgotamento alvo usando RNAi. RNAi também foi testado em árvores de citrinos para controle da ACP e GWSS. Árvores cítricas foram tratadas com dsRNA através de embebe de raiz, da haste da torneira (injeções de tronco), assim como pulverizações foliares com dsRNAs contra inseto específico arginina quinase (AK) transcrições42,44. A aplicação tópica de dsRNA foi detectada na Copa das árvores de citrinos, indicando uma entrega eficiente através dos tecidos vasculares de plantas e resultou em aumento da mortalidade em ACP e GWSS41,42, 45.
No estudo atual, nós identificamos um método de entrega de dieta natural para tratamentos como dsRNA. Esta técnica recentemente desenvolvida foi posteriormente usada para silenciar o JHAMT e o Vg mRNA usando o gene específico dsRNAs em ninfas BMSB como demonstrado anteriormente62. Estes novos protocolos de entrega demonstrados aqui substituem sistemas convencionais da entrega do RNA que usar sprays tópicos ou microinjeções. Legumes e frutas, haste da torneira, encharcando o solo e absorventes de argila em podem ser utilizados para entrega de dsRNA, que é fundamental para o desenvolvimento contínuo de Biopesticida gestão de pragas e patógenos.

<table><tbody><tr><td>Insetos BMSB (H. halys)&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACP (D. citri) insetos&nbsp;</td>Feijão verde orgânico <td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plantas cítricas</td><td>Solução de</td> hipoclorito de sódio USDA <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corante alimentar verde J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>McCormick & Co., Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmaras Thermo Forma&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magenta vessel (Cultura)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers&nbsp;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiMix SYBR</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR ABI 7500</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frasco de spray</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American Can Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

métodos de entrega double-stranded rna oral para induzir a interferência do rna no floema e insetos hemipteran planta-sap-alimentação

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Floema e planta seiva alimentação insetos invadem a integridade das culturas e frutas para recuperar nutrientes, no processo de danificar as culturas alimentares. Hemipteran insetos são responsáveis por uma série de pragas economicamente substanciais de plantas que causam danos a culturas alimentando na seiva do floema. O marrom marmorated percevejo (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) e os asiáticos citrinos psilídeos (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) são pragas hemipteran introduzidas na América do Norte, onde eles são uma praga agrícola invasiva da especialidade de alto valor, linha e culturas descontínuas e frutas cítricas, bem como uma praga de incômodo quando eles agregam dentro de casa. Resistência de inseticida em muitas espécies tem levado ao desenvolvimento de métodos alternativos de estratégias de manejo de pragas. Double-stranded do RNA (dsRNA)-mediada de RNA de interferência (RNAi) é um mecanismo para estudos de genômicos funcionais que tem aplicações potenciais como uma ferramenta para o manejo de insetos-praga de silenciamento do gene. DsRNA exogenamente sintetizado ou RNA de interferência pequeno (siRNA) pode desencadear silenciamento de genes altamente eficiente através da degradação do RNA endógeno, que é homólogo ao apresentado. Utilização eficaz e ambiental de RNAi como biopesticidas moleculares para biocontrole de insetos hemipteran exige a entrega na vivo de dsRNAs através da alimentação. Aqui podemos demonstrar métodos para a entrega do dsRNA aos insetos: carregamento do dsRNA em feijão verde por imersão e absorção de dsRNA gene-específico com entrega oral através da ingestão. Descrevemos também plantas não-transgênicas entrega abordagens utilizando pulverizadores foliares, embebe de raiz, injeções de tronco, bem como grânulos de argila, que pode ser essencial para liberação sustentada do dsRNA. Entrega eficiente por dsRNA ingerida por via oral foi confirmada como uma dosagem eficaz para induzir uma redução significativa na expressão de genes alvo, tais como o hormônio juvenil ácido O-Metiltransferase (JHAMT) e vitellogenin (Vg). Estes métodos inovadores representam estratégias para entrega do dsRNA para uso em proteção de cultivos e superar os desafios ambientais para a gestão de pragas.

Entrega de vegetais dsRNA mediada através da alimentação em BMSB 4th ínstar ninfas foi testada para o desenvolvimento de biopesticidas moleculares usando RNAi para pragas invasoras. BMSBs alimentação usando seus estiletes de agulha através de um mecanismo conhecido como dilacerar e flush, que provoca danos consideráveis para as culturas. Delgados feijão verde orgânico, p. vulgaris L., foram usado para testar se a nutrientes ou dsRNA pôde ser entregue na vivo a...

Este artigo demonstra novas técnicas desenvolvidas para entrega oral de RNA double-stranded (dsRNA) através dos tecidos vasculares das plantas para o RNA de interferência (RNAi) na seiva do floema alimentação de insetos.

Métodos de entrega Double-stranded RNA Oral para induzir a interferência do RNA no floema e insetos Hemipteran planta-sap-alimentação

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

O objetivo geral desses procedimentos é demonstrar um método de administração oral natural. Para dsRNAs específicos de genes, para induzir interferência de RNA in vivo e pragas de insetos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como entregar biomoléculas dentro de insetos, elucidar o efeito de biopesticidas moleculares baseados em RNAi e controlar insetos no meio ambiente.A principal vantagem desta técnica é que esta entrega através do silenciamento gênico mediado por ácido nucleico pode ser aplicada à alimentação de seiva de plantas, bem como a insetos mastigadores. Embora os métodos aqui demonstrem a entrega de RNA de fita dupla a pragas hemípteras, como o percevejo marrom marmorizado, o inseto arlequim e o psilídeo cítrico asiático. Eles podem ser aplicados a outros insetos.Para iniciar o protocolo, selecione o percevejo marmorizado marrom do 4º Instar, ou ninfas BMSB, eclodidas da massa de ovos e deixe-as morrer de fome por 24 horas antes da alimentação com dsRNA. Em seguida, selecione feijão verde orgânico fino e certificado e lave-o com solução de hipoclorito de sódio a 0,2% por cinco minutos. Siga com três lavagens de H2O duplamente destiladas e deixe os grãos secarem ao ar.Quando estiverem secos, corte o feijão verde da extremidade do cálice até um comprimento total de 7,5 centímetros usando uma lâmina de barbear limpa. Mergulhe o feijão verde lavado e aparado em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros sem tampa contendo 300 microlitros de solução de controle. Faça diluições dos lac Z, JHAMT ou VGDSRNAs sintetizados in vitro, diluindo 5 microgramas ou 20 microgramas e 300 microlitros de RNAs, água livre de DNAs para produzir concentrações finais de 0,017 microgramas por microlitro ou 0,067 microgramas por microlitro, respectivamente.Mergulhe o feijão verde lavado e aparado em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros sem tampa, contendo 300 microlitros de solução de dsRNA. Enrole e sele as bordas dos tubos da microcentrífuga, envolvendo os grãos imersos para evitar a evaporação da solução de dsRNA e para evitar que os animais entrem no tubo da microcentrífuga. Posicione os tubos na vertical à temperatura ambiente por três horas, para permitir que a solução de dsRNA seja carregada por todo o feijão verde por ação capilar.Coloque os tubos em recipientes de cultura de polipropileno limpos e coloque 3 ninfas BMSB de 4º Instar famintas nos vasos de cultura. Trate três insetos por vaso de cultura. Cada um contendo três feijões verdes com corante alimentar verde ou solução de dsRNA.Manter os insetos a 25 graus Celsius e 72% de umidade relativa, sob um 16L, 8D fotoperíodo em incubadora. Permita que os insetos se alimentem do feijão verde imerso e absorvido em dsRNA por cinco dias e reabasteça-o com dietas frescas de feijão verde tratado com dsRNA após três dias. Selecione plantas ou mudas e não as regue por dois a três dias antes do uso, para deixar o solo secar até ficar úmido, mas não completamente seco.Usando um borrifador bombeado manualmente, aplique 200 mililitros de solução de dsRNA no dossel inferior. Amostra do novo crescimento de árvores previamente cobertas após 25 a 40 dias, coletando aproximadamente 10 folhas das pontas de quatro galhos. Extraia o RNA total e analise-o por RT-PCR e qPCR para a presença do gatilho de dsRNA aplicado.Da mesma forma, pulverize topicamente 10 mililitros de dsRNA na região inferior de uma muda ou folhagem de árvore em pequenos vasos. Selecione plantas ou mudas e não as regue por dois a três dias antes do uso, para deixar o solo secar, umedecer, mas não completamente seco. Em seguida, adicione um litro de solução de dsRNA ao solo de plantas em vasos grandes.Adicione um litro de água após uma hora. Aplique 100 mililitros de solução de dsRNA no solo de vasos de árvores de um metro de altura em solos parcialmente secos. Deixe as plantas receberem a solução de dsRNA como um encharcamento do solo, para embeber por 30 minutos.Em seguida, aplique um tratamento puro apenas com água para ajudar na absorção pelas raízes. Selecione mudas de frutas cítricas, plantas novas ou com aproximadamente 3,5 anos de idade para injetar dsRNA usando o stap do caule, também conhecido como método de injeções no tronco. Enrole a ponta de cobre de cada injetor quatro a seis vezes com uma tira de filme de teto de 0.6 centímetro de largura para evitar vazamentos perto da ponta.Em seguida, encha os injetores de tronco de árvore com seis mililitros de solução de dsRNA diluída com DNAs, água livre de RNAs. Faça furos nas plantas cítricas usando uma broca de 10 mililitros e tome cuidado para não exceder dois centímetros, ou cerca de metade do diâmetro do caule. Em seguida, injete a solução no tronco da árvore e deixe o injetor no tronco por seis a 10 horas para permitir a absorção da solução de dsRNA.Deixe os insetos se alimentarem das mudas das árvores tratadas aos 3, 10 e 30 dias após o tratamento. Despeje 30 gramas do absorvente de argila em um tubo cônico de 50 mililitros até a marca de 35 mililitros. Despeje 20 mililitros de solução de dsRNA diluída em DNAs, água livre de RNAs no tubo para molhar todo o absorvente.Tampe o tubo cônico, incline o tubo para ajudar a remover o ar e coloque o tubo na posição vertical e deixe-o repousar por um a dois minutos enquanto as partículas de argila absorvem a solução. Adicione argila embebida em dsRNA suficiente na mistura de solo para encher um pote de um galão. Misture e vire o solo manualmente para misturar completamente a argila embebida em dsRNA no solo.Use o solo para replantar mudas selecionadas para o tratamento com dsRNA. Regue o solo com 200 mililitros de água pura, sem dsRNA, após 30 minutos a uma hora. Siga com 100 mililitros de água pura.Após 24 horas, coloque a planta em um cronograma normal de rega. Teste de quatro a seis folhas dos vasos de plantas tratadas com absorventes de argila e dsRNA a cada mês, pós-tratamento para dsRNA, coletando as folhas mais apicais do crescimento de novas plantas. QPCR de segmentos de feijão verde imersos em dsRNA sintetizado in vitro, específico para percevejo marrom marmorizado, ou mRNA BMSB, indicou a indução bem-sucedida de RNAi, pois a expressão dos alvos JHAMT e Vg foi significativamente reduzida in vivo.Este método de entrega também é eficaz em outra praga de hemípteros, o inseto arlequim. Conforme indicado por seus excrementos de cor verde. Depois de assistir a essas demonstrações visuais, você deve ter uma boa compreensão de como fornecer RNA de fita dupla a insetos por meio de ingestão oral para induzir insetos de RNAi in vivo.Os avanços feitos na tecnologia de nucelotídeos de RNAi continuam a expandir as capacidades dos pesquisadores de modular os níveis de RNA, expressão gênica e proteínas em uma ampla gama de organismos vivos. Isso vai de plantas a insetos e os microrganismos mais difíceis. Portanto, enquanto o custo de produção de RNA de fita dupla continua a diminuir e os métodos de entrega e estabilidade continuam a melhorar, o futuro das tecnologias de RNAi continuará a ser usado para resolver problemas emergentes e complexos.

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Research

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Environment

Ambiente

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RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

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Métodos de entrega Double-stranded RNA Oral para induzir a interferência do RNA no floema e insetos Hemipteran planta-sap-alimentação (Vídeo) | JoVE Journal

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