Métodos de entrega Double-stranded RNA Oral para induzir a interferência do RNA no floema e insetos Hemipteran planta-sap-alimentação

O objetivo geral desses procedimentos é demonstrar um método de administração oral natural. Para dsRNAs específicos de genes, para induzir interferência de RNA in vivo e pragas de insetos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como entregar biomoléculas dentro de insetos, elucidar o efeito de biopesticidas moleculares baseados em RNAi e controlar insetos no meio ambiente.

A principal vantagem desta técnica é que esta entrega através do silenciamento gênico mediado por ácido nucleico pode ser aplicada à alimentação de seiva de plantas, bem como a insetos mastigadores. Embora os métodos aqui demonstrem a entrega de RNA de fita dupla a pragas hemípteras, como o percevejo marrom marmorizado, o inseto arlequim e o psilídeo cítrico asiático. Eles podem ser aplicados a outros insetos.

Para iniciar o protocolo, selecione o percevejo marmorizado marrom do 4º Instar, ou ninfas BMSB, eclodidas da massa de ovos e deixe-as morrer de fome por 24 horas antes da alimentação com dsRNA. Em seguida, selecione feijão verde orgânico fino e certificado e lave-o com solução de hipoclorito de sódio a 0,2% por cinco minutos. Siga com três lavagens de H2O duplamente destiladas e deixe os grãos secarem ao ar.

Quando estiverem secos, corte o feijão verde da extremidade do cálice até um comprimento total de 7,5 centímetros usando uma lâmina de barbear limpa. Mergulhe o feijão verde lavado e aparado em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros sem tampa contendo 300 microlitros de solução de controle. Faça diluições dos lac Z, JHAMT ou VGDSRNAs sintetizados in vitro, diluindo 5 microgramas ou 20 microgramas e 300 microlitros de RNAs, água livre de DNAs para produzir concentrações finais de 0,017 microgramas por microlitro ou 0,067 microgramas por microlitro, respectivamente.

Mergulhe o feijão verde lavado e aparado em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros sem tampa, contendo 300 microlitros de solução de dsRNA. Enrole e sele as bordas dos tubos da microcentrífuga, envolvendo os grãos imersos para evitar a evaporação da solução de dsRNA e para evitar que os animais entrem no tubo da microcentrífuga. Posicione os tubos na vertical à temperatura ambiente por três horas, para permitir que a solução de dsRNA seja carregada por todo o feijão verde por ação capilar.

Coloque os tubos em recipientes de cultura de polipropileno limpos e coloque 3 ninfas BMSB de 4º Instar famintas nos vasos de cultura. Trate três insetos por vaso de cultura. Cada um contendo três feijões verdes com corante alimentar verde ou solução de dsRNA.

Manter os insetos a 25 graus Celsius e 72% de umidade relativa, sob um 16L, 8D fotoperíodo em incubadora. Permita que os insetos se alimentem do feijão verde imerso e absorvido em dsRNA por cinco dias e reabasteça-o com dietas frescas de feijão verde tratado com dsRNA após três dias. Selecione plantas ou mudas e não as regue por dois a três dias antes do uso, para deixar o solo secar até ficar úmido, mas não completamente seco.

Usando um borrifador bombeado manualmente, aplique 200 mililitros de solução de dsRNA no dossel inferior. Amostra do novo crescimento de árvores previamente cobertas após 25 a 40 dias, coletando aproximadamente 10 folhas das pontas de quatro galhos. Extraia o RNA total e analise-o por RT-PCR e qPCR para a presença do gatilho de dsRNA aplicado.

Da mesma forma, pulverize topicamente 10 mililitros de dsRNA na região inferior de uma muda ou folhagem de árvore em pequenos vasos. Selecione plantas ou mudas e não as regue por dois a três dias antes do uso, para deixar o solo secar, umedecer, mas não completamente seco. Em seguida, adicione um litro de solução de dsRNA ao solo de plantas em vasos grandes.

Adicione um litro de água após uma hora. Aplique 100 mililitros de solução de dsRNA no solo de vasos de árvores de um metro de altura em solos parcialmente secos. Deixe as plantas receberem a solução de dsRNA como um encharcamento do solo, para embeber por 30 minutos.

Em seguida, aplique um tratamento puro apenas com água para ajudar na absorção pelas raízes. Selecione mudas de frutas cítricas, plantas novas ou com aproximadamente 3,5 anos de idade para injetar dsRNA usando o stap do caule, também conhecido como método de injeções no tronco. Enrole a ponta de cobre de cada injetor quatro a seis vezes com uma tira de filme de teto de 0.6 centímetro de largura para evitar vazamentos perto da ponta.

Em seguida, encha os injetores de tronco de árvore com seis mililitros de solução de dsRNA diluída com DNAs, água livre de RNAs. Faça furos nas plantas cítricas usando uma broca de 10 mililitros e tome cuidado para não exceder dois centímetros, ou cerca de metade do diâmetro do caule. Em seguida, injete a solução no tronco da árvore e deixe o injetor no tronco por seis a 10 horas para permitir a absorção da solução de dsRNA.

Deixe os insetos se alimentarem das mudas das árvores tratadas aos 3, 10 e 30 dias após o tratamento. Despeje 30 gramas do absorvente de argila em um tubo cônico de 50 mililitros até a marca de 35 mililitros. Despeje 20 mililitros de solução de dsRNA diluída em DNAs, água livre de RNAs no tubo para molhar todo o absorvente.

Tampe o tubo cônico, incline o tubo para ajudar a remover o ar e coloque o tubo na posição vertical e deixe-o repousar por um a dois minutos enquanto as partículas de argila absorvem a solução. Adicione argila embebida em dsRNA suficiente na mistura de solo para encher um pote de um galão. Misture e vire o solo manualmente para misturar completamente a argila embebida em dsRNA no solo.

Use o solo para replantar mudas selecionadas para o tratamento com dsRNA. Regue o solo com 200 mililitros de água pura, sem dsRNA, após 30 minutos a uma hora. Siga com 100 mililitros de água pura.

Após 24 horas, coloque a planta em um cronograma normal de rega. Teste de quatro a seis folhas dos vasos de plantas tratadas com absorventes de argila e dsRNA a cada mês, pós-tratamento para dsRNA, coletando as folhas mais apicais do crescimento de novas plantas. QPCR de segmentos de feijão verde imersos em dsRNA sintetizado in vitro, específico para percevejo marrom marmorizado, ou mRNA BMSB, indicou a indução bem-sucedida de RNAi, pois a expressão dos alvos JHAMT e Vg foi significativamente reduzida in vivo.

Este método de entrega também é eficaz em outra praga de hemípteros, o inseto arlequim. Conforme indicado por seus excrementos de cor verde. Depois de assistir a essas demonstrações visuais, você deve ter uma boa compreensão de como fornecer RNA de fita dupla a insetos por meio de ingestão oral para induzir insetos de RNAi in vivo.

Os avanços feitos na tecnologia de nucelotídeos de RNAi continuam a expandir as capacidades dos pesquisadores de modular os níveis de RNA, expressão gênica e proteínas em uma ampla gama de organismos vivos. Isso vai de plantas a insetos e os microrganismos mais difíceis. Portanto, enquanto o custo de produção de RNA de fita dupla continua a diminuir e os métodos de entrega e estabilidade continuam a melhorar, o futuro das tecnologias de RNAi continuará a ser usado para resolver problemas emergentes e complexos.