Split-BioID — Proteomic análise de complexos de proteínas específicas do contexto em seu ambiente nativo do celular

O objetivo geral deste procedimento é sondar a composição de complexos de proteínas que se montam especificamente em torno de um par de proteínas de interesse em interação usando split-BioID, um ensaio de complementação de fragmentos de proteína que induz a biotinilação de proteínas dependente de proximidade dentro de células vivas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia celular, como a forma como os complexos de proteínas se remodelam dinamicamente para regular diferentes funções celulares. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a fácil identificação de complexos proteicos específicos do contexto em seus ambientes celulares nativos e com altíssima resolução.

Para a análise espectrométrica de massa final, as etapas a seguir devem ser executadas em condições livres de queratina e todos os materiais e reagentes devem estar tão livres quanto possível. Depois de clonar as ORFs de duas proteínas de interesse no plasmídeo BioID dividido, realizar a transfecção transitória e adicionar meio suplementado com biotina de acordo com o protocolo de texto, use PBS para lavar as células duas vezes. Adicione 1,5 mililitros de PBS a cada placa e use um raspador para colher as células, depois transfira as células para cada condição para um tubo separado de 15 mililitros e gire os tubos a 1.200 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por cinco minutos.

Remova os sobrenadantes e congele os pellets em nitrogênio líquido. Em seguida, armazene os tubos a 80 graus Celsius negativos até processamento posterior. Para preparar lisados celulares, use um mililitro de tampão de lise RT para ressuspender os pellets.

Em seguida, passe as células por uma agulha de calibre 25 10 a 20 vezes. Em seguida, sonicar as amostras. Em seguida, adicione 100 microlitros de 20% Triton X-100 por 900 microlitros de lisado sonicado recuperado para uma concentração final de 2% Adicione 2,3 mililitros de Tris 50 milimolares, pH 7,4, por mililitro de lisado para ajustar a concentração de NaCl para 150 milimolares para ligação aos grânulos de estreptavidina.

Em seguida, distribua os lisados ajustados em tubos de 1,5 mililitro e centrifugue-os a 16.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por dez minutos. Transferir os sobrenadantes para um tubo de 15 mililitros e manter 50 a 100 microlitros como material de entrada. Para realizar um pulldown de estreptavidina, para cada condição, transfira 200 microlitros de suspensão de esferas magnéticas acopladas a estreptavidina para um tubo de 1,5 mililitro.

Coloque os tubos em um rack magnético e aguarde aproximadamente um minuto antes de remover o buffer de armazenamento. Com um mililitro de tampão de equilíbrio, lave as contas misturando suavemente. Em seguida, despache uniformemente as contas equilibradas no número necessário de tubos e coloque-as de volta no rack magnético.

Depois de remover o tampão de equilíbrio, ressuspenda cada conjunto de contas com quantidades iguais dos lisados celulares correspondentes. Em seguida, incube as amostras a quatro graus Celsius em uma roda giratória durante a noite. No dia seguinte, coloque os tubos em um rack magnético.

Espere até que as contas grudem na lateral dos tubos e transfira os sobrenadantes para um tubo de 15 mililitros rotulado como fluxo. Com 200 microlitros de tampão de lavagem um, ressuspenda os grânulos em cada tubo e combine cada conjunto de grânulos ressuspensos correspondentes a uma condição em tubos de 1,5 mililitro. Use um mililitro de tampão de lavagem um para lavar as contas duas vezes em uma roda giratória por oito minutos.

Em seguida, execute duas lavagens cada para os amortecedores de lavagem dois, três e quatro. Para garantir que o tampão de lavagem seja completamente eliminado após a última etapa de lavagem, depois de remover a maior parte do sobrenadante, gire as amostras. Em seguida, coloque-os de volta no rack magnético e remova o buffer restante.

Adicione 30 microlitros de tampão de eluição aos grânulos, incube as amostras a 98 graus Celsius por quinze minutos e mova imediatamente os tubos para o rack magnético. Transfira a amostra eluída para um tubo novo e armazene os tubos a 20 graus Celsius negativos até processamento posterior. Para cada amostra de entrada, prepare uma amostra PAGE misturando quantidades iguais de proteína com o volume apropriado de tampão de carga 3X SDS em um volume total de 28 microlitros.

Em seguida, prepare as amostras PAGE misturando cinco microlitros de cada amostra de eluição com 2,5 microlitros de tampão de carga 3X SDS. Carregue as amostras em um gel de poliacrilamida SDS. Em seguida, prossiga para eletroforese e western blotting de acordo com o protocolo de texto.

Para realizar a análise SDS-PAGE para MS, adicione 6,25 microlitros de tampão de amostra 4X a 18,75 microlitros de cada amostra de eluição e execute as amostras em um gel SDS pré-moldado de quatro a 20% até que migrem dois a três centímetros para dentro do gel. Em uma placa de Petri de 15 centímetros, corar o gel com o corante coloidal Coomassie Brilliant Blue G250. Use um bisturi limpo para excisar todas as faixas para cada amostra, excluindo a banda de estreptavidina, e transfira as bandas excisadas para tubos de 1,5 mililitro para análise de EM.

Além das proteínas endógenas biotiniladas identificadas em um experimento BioID, split-BioID, as principais bandas adicionais observadas pelo western blot são as proteínas de fusão que se auto-biotinilaram, o que indica que as duas proteínas testadas, neste exemplo Ago2 e TNRC6C ou Ago2 e Dicer interagiram nas células. Além disso, os resultados do western blot indicam que ter uma proteína de fusão NBirA*Ago2 emparelhada com CBirA*fusions com TNRC6C ou Dicer é mais eficiente do que as combinações opostas nas quais CBirA*Ago2 é emparelhado com NBirA*fusions das outras duas proteínas. Além disso, a ativação foi específica, pois nenhuma das fusões CBirA*foi capaz de ativar a proteína de fusão de controle NBirA*GFP em níveis apreciáveis.

Ao realizar o isolamento pela primeira vez, todas as etapas da purificação devem ser analisadas por western blotting. Conforme ilustrado aqui, a ligação aos grânulos deve ser quase quantitativa e praticamente nenhum vazamento deve ser observado nas lavagens. Quando o material eluído é executado em um gel corado com Coomassie após a expressão da proteína e a biotinilação induzida, a banda mais forte observada é de cerca de 17 kilodaltons e corresponde à estreptavidina monomérica.

A área da pista de amostra acima da banda de estreptavidina no poço de carregamento é normalmente excisada para análise de EM. Ao aplicar este procedimento a duas proteínas, é importante testar diferentes combinações de proteínas de fusão. De fato, muitas vezes observamos que a eficiência geral da biotinilação pode depender de qual proteína está anexada aos fragmentos de BirA terminais N ou C.

É igualmente importante adicionar pelo menos um experimento de BioID dividido de controle negativo. Por exemplo, em um par de proteínas que interagem que não estão relacionadas ao par de proteínas de interesse. Após este procedimento e espectrometria de massa, a análise computacional deve ser aplicada para pontuar os peptídeos identificados em relação aos experimentos de controle negativo.

Usamos, por exemplo, os softwares MaxQuant e Perseus que foram desenvolvidos pelos laboratórios Cox e Mann em Munique, Alemanha.