Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

O objetivo geral deste procedimento é observar a montagem dinâmica de complexos de proteínas em diferentes ambientes de pH usando interferometria de biocamada e confirmar os componentes usando microscopia eletrônica e espectrometria de massa. Identificar e compreender a especificidade que rege a formação e montagem de complexos proteicos é de extremo interesse para pesquisadores bioquímicos. A metodologia de que estamos falando hoje permite que os pesquisadores montem, visualizem e validem complexos macromoleculares previstos.

A natureza complexa da superfície do biossensor permite que os pesquisadores liberem facilmente complexos montados em pequenos microvolumes para análise de microscopia eletrônica e espectrometria de massa. Nesta demonstração, seguimos a cinética dos rearranjos estruturais induzidos pelo pH do complexo da toxina do antraz e verificamos esses rearranjos por métodos de microscopia eletrônica e espectrometria de massa, evitando a agregação. Demonstrando a montagem da toxina do antraz na superfície do biossensor BLI, liberação de amostra macro e procedimentos de coloração EM-negativos estarão Alexandra Machen e Pierce O'Neil, alunos de pós-graduação do meu laboratório.

O Dr. Antonio Artigues é fundamental na análise e identificação das microamostras liberadas pelo BLI, usando o espectrômetro de massa Orbitrap Fusion Lumos. Para começar, hidrate uma ponta de biossensor BLI de segunda geração reativa de amina mergulhando-a em 250 microlitros de água e incube-a por 10 minutos. No software Blitz, programe os tempos de passo conforme listado nesta tabela.

Inicie a execução do BLI imergindo a ponta do biossensor em 250 microlitros de água por 30 segundos para medir uma linha de base inicial da espessura e densidade do biossensor. Em seguida, ative o biossensor imergindo a ponta em 250 mililitros de 50 milimolares NHS e 200 milimolares EDC por sete minutos. Em seguida, mergulhe o biossensor ativado em PDEA 50 milimolares dissolvido em tampão borato 0,1 molar, pH 8,5, por cinco minutos para gerar uma superfície biorreativa ativada.

Agora, mergulhe o biossensor biorreativo ativado em 250 microlitros de uma solução contendo 100 nanomolares E126C LFn em acetato de sódio de 10 milimolares pH cinco, tampão de cloreto de sódio de 100 milimolares por cinco minutos. Mergulhe a ponta LFn em L-cisteína 50 milimolar, cloreto de sódio 1 molar, acetato de sódio 0,1 molar pH cinco por quatro minutos para extinguir quaisquer grupos tiol-reativos livres restantes. Depois de imergir a ponta LFn temperada em Tris 50 milimolares, cloreto de sódio 50 milimolar para estabelecer a linha de base do tampão, mergulhe a ponta em um pré-poro de antígeno protetor micromolar 0,5, Tris 50 milimolar, cloreto de sódio 50 milimolar por cinco minutos para criar o complexo LFn PA-prepore.

Uma vez associado o PA-prepore, remova a ponta da solução de PA-prepore e mergulhe a ponta em Tris 50 milimolares, cloreto de sódio 50 milimolar por 30 segundos para lavar qualquer PA não especificamente ligado Mergulhe o complexo LFn PA-prepore em 0,5 micromolar CMG2 em 50 milimolares Tris, 50 milimolares de cloreto de sódio por cinco minutos. Mergulhe o complexo LFn PA-prepore CMG2 em 50 milimolares Tris, 50 milimolares cloreto de sódio por 30 segundos para lavar qualquer CMG2 não ligado para formar um complexo pré-endossômico.

Para análise EM, libere o complexo LFn PA-prepore CMG2 da ponta do biossensor imergindo a ponta em um tubo de PCR contendo cinco microlitros de 50 milimolares de DTT, 50 milimolares Tris e 50 milimolares de cloreto de sódio. Para análise em tandem MS dos peptídeos do complexo, libere o complexo LFn PA-prepore CMG2 da ponta do biossensor imergindo o biossensor em um tubo de PCR contendo cinco microlitros de DTT 50 milimolar, seis cloridrato de guanidina sem queratina molar e bicarbonato de amônio 25 milimolar, pH oito. Para visualizar o complexo após a transição de pH, monte o complexo LFn PA-prepore CMG2 no biossensor, como acabamos de demonstrar.

Mergulhe a ponta do biossensor em acetato de 10 milimolares pH cinco por cinco minutos para iniciar a transição do PA-preporo para o PA-poro. Essa transição é indicada pelo aumento da amplitude, seguido por um declínio de amplitude maior que se acredita ser substancial para a dissociação completa do receptor devido à diminuição da afinidade de ligação. Para análise EM, mergulhe a ponta do biossensor em uma solução contendo micelas milimolares de 1,25 milimolares por cinco minutos, para evitar a agregação em solução após a liberação de dissulfeto.

Para realizar a microscopia eletrônica de coloração negativa, comece descarregando uma grade de cobre 300 revestida de carbono a 0,38 milibar de pressão atmosférica estável e menos 15 miliamperes por 20 segundos e, em seguida, ventile o dispositivo com ar. Prenda a grade entre uma pinça limpa. Em seguida, pipetar quatro microlitros de amostra complexa liberada na grade e permitir a adsorção por 60 segundos.

Com uma cunha de papel de filtro, retire o líquido restante. Em seguida, manche a grade pipetando cinco microlitros de formato de uranila filtrado a 0,75% ponto zero dois mícrons e, após cinco segundos, remova o excesso de mancha. Deixe a grelha secar à temperatura ambiente enquanto estiver coberta.

Em seguida, use o microscópio eletrônico de transmissão para visualizar a amostra. Finalmente, depois de preparar amostras para espectrometria de massa de acordo com o protocolo de texto, opere o espectrômetro de massa usando CID e uma energia de colisão normalizada de 35 sob controle automático para realizar continuamente uma varredura MS, seguida pelo maior número possível de varreduras MS-MS em tandem em um período de três segundos. O traço sensograma BLI é uma leitura em tempo real das mudanças de amplitude devido à adição específica dos componentes da toxina do antraz.

O primeiro aumento é o carregamento LFn na ponta. Após a têmpera e a linha de base, o PA-preporo se liga ao LFn, seguido pela adição de CMG2 solúvel, resultando no complexo pré-endossômico montado. O complexo é então submetido a um pH baixo que enfraquece a ligação ao receptor e resulta na transição do preporo para sua confirmação de poro estendido que é confirmada pela adição de micelas.

Aqui são mostradas imagens EM de coloração negativa de complexos após a liberação do biossensor. As grades de amostras pré-endossômicas mostraram densidades consistentes com complexos ternários intactos consistindo de LFn PA-prepore CMG2. Grades complexas pós-acidificação mostram PA em transição para poro e solubilizado por inclusão de micelas sem densidade óbvia de CMG2.

Como visto pela EM, que confirmou os complexos proteicos, as amostras pré-endossômicas de EM continham peptídeos de todos os três componentes da toxina com 60,46, 67,97 e 54,15% de cobertura para LFn, PA e CMG2, respectivamente. As amostras pós-endossômicas continham apenas peptídeos de LFn e PA. A falta de CMG2 é consistente com a diminuição nanométrica BLI observada durante a formação dos poros. A capacidade de monitorar e validar a montagem de grandes complexos de macromoléculas é um passo crucial para entender a especificidade e a funcionalidade de grandes conjuntos biomoleculares.

Nossa capacidade de liberar complexos macromoleculares pré-montados de biossensores em microvolumes para visualização de microscopia eletrônica será extremamente útil para análise de estrutura. Nossa análise da composição dos complexos de montagem do biossensor usou apenas 0,04 femtomoles do complexo de liberação para identificar seus componentes antes e depois da acidificação endossômica assimilada. O protocolo de liberação de montagem do biossensor pode ser adaptado para seguir transições endossômicas naturais, mas indescritíveis, induzidas pelo pH de outras toxinas bacterianas em estruturas de proteínas virais, com o bônus adicional de evitar a agregação de proteínas.