Name: Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda a purificar complexos de proteínas por afinidade e separá-los por blue native PAGE com análise por espectrometria de massas. Este método simples oferece alta resolução para estudar interações proteicas.

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Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust (WT098051).

<ol><li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+%28CCM3%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li>
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<li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li>
<li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+activator+Mirk%2FDyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha%2Fbeta+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li>
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<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li>
<li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340(2013).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li>
<li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE%2FLC-MS%2FMS+and+clustering+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li>
<li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li>
<li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+%28NuRD%29+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li>
<li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+%28Wnt%29+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li>
<li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+%28NuRD%29+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li>
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<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
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<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
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<li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
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<li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, nós descrevemos o uso de purificação por afinidade, seguido por electroforese em gel nativo azul em combinação com espectrometria de massa quantitativo para resolver complexos de proteínas. Esta abordagem oferece um método para desvendar listas de interacção proteína unidimensionais em conjuntos de proteínas funcionais. Demonstramos o método baseado na utilização de proteínas marcadas no epitopo. No entanto, se uma linha celular que expressa uma proteína marcada não está disponível, uma alternativa poderia ser a utilização de anticorpos contra a proteína de interesse, desde que haja um peptídeo disponível para conseguir a eluição competitiva nativa. A quantidade de material de partida e a quantidade de grânulos pode ter de ser modificado, dependendo do nível de expressão da proteína alvo. Nós normalmente realizar este protocolo com 2-5 x 10 8 culas a partir de material, e esta é suficiente até mesmo para proteínas com baixo nível de expressão. A composição do tampão de lise deve ser escolhida empiricamente para atingirperto de completar a solubilização da isca. Este pode ser um desafio para alguns tipos de proteínas, em particular de ligao cromatina ou proteínas de membrana. Opções alternativas incluem o aumento da quantidade de sal, desde que o complexo de proteína sob estudo é estável em elevado teor de sal, ou utilizando ultra-sons e / ou tratamento com nuclease para proteínas de ligação da cromatina 20, 29. No caso de proteínas de membrana, interrupção, detergente para DDM ou digitonina 30 pode ser aconselhável. No caso de proteínas de ligação de ADN, é útil incluir uma nuclease como a Benzonase durante o passo de purificação 20. A remoção completa de ácidos nucleicos que assegura que as interacções entre proteínas detectadas ocorrer e não são mediados por ADN. Um elemento crítico para considerar quando se utiliza esta abordagem é a estabilidade do complexo sob investigação. O procedimento é longo e pode envolver preservandog a proteína durante a noite complexo. Nós conseguimos o bom sucesso com dois complexos de cromatina remodelação (D. Bode e M. Pardo, dados não mostrados), mas isso deve ser avaliada. A etapa de purificação por afinidade pode ser encurtado, se necessário. As técnicas alternativas que permitam fraccionamento nativa, tais como a cromatografia de exclusão de tamanho, têm sido amplamente utilizados durante mais de 50 anos para caracterizar os complexos de proteínas. Nós e outros autores mostraram que a resolução de PAGE nativa azul é superior à que seria possível utilizando cromatografia de exclusão por tamanhos 20, 31, 32, 33. Outra vantagem da página nativa azul é que ele não requer sistemas de cromatografia, que são caros, mas sim usa equipamento de proteína eletroforética que é generalizada em laboratórios. Em termos de hands-on tempo, este método não envolve mais trabalho do que o tradicional GELC-MS / MS aBORDAGEM ou fraccionamento cromatográfico offline. No entanto, como a maioria das técnicas de fraccionamento fazer, ele tem um limite para a sua resolução. Complexos que são muito homogénea ou perto da massa e forma podem ser para além da resolução oferecida por PAGE nativa azul, e, portanto, do protocolo, como descrito aqui pode não ser universalmente bem sucedido na resolução de complexos distintos com subunidades partilhados. Encorajadoramente, que têm tido sucesso na separação de dois complexos tetraméricos muito semelhantes que partilham três subunidades (M. Pardo, manuscrito em preparação). Uma vez que a espectrometria de massa tem se tornado cada vez mais sensível, mesmo quantidades diminutas de interactores e contaminantes não-específicos podem ser detectados em amostras de AP-MS. A abordagem aqui apresentado pode auxiliar na discriminação de interactores reais a partir de contaminação de fundo na purificação por afinidade, concentrando-se a atenção sobre as proteínas com picos de migração que coincidem com os picos de migração isca em peso molecular mais elevado do que o deas proteínas monoméricas. Diversos grupos têm usado técnicas de fraccionamento, seguido pelo perfil correlação proteína para delinear complexos de proteína à escala celular sem a necessidade de isolamento prévio 10, 11, 12, 34. No entanto, isso pode resultar em falha para detectar interacções sub-estequiométrico. A incorporação de um passo de enriquecimento através de purificação por afinidade pode ajudar a ultrapassar esta. A abordagem aqui descrita deve ser geralmente útil para explorar a topologia de complexos de proteínas e desvendar os vários complexos de uma dada proteína participa em dentro do mesmo contexto celular. A estratégia é simples e passíveis de laboratórios que não podem ter equipamentos fracionamento cromatográfico caro para resolver complexos de proteínas.

Em células, a maioria das proteínas de desempenhar as suas funções através de interacções proteína-proteína transitórios ou através da formação de conjuntos de proteínas estáveis. Caracterizando interações proteína é crucial para os processos celulares totalmente entendimento. A purificação por afinidade em combinação com espectrometria de massa (AP-MS) é uma das estratégias mais vulgarmente aplicados para identificar interacções proteína nativa. melhorias significativas na capacidade do instrumento alcançados na última década fizeram esta abordagem extremamente poderoso. É importante notar que as interacções identificados por experiências de AP-MS incluem uma mistura de associações directas e indirectas entre isca e presas. Além disso, muitas vezes proteínas tomar parte em vários complexos diferentes dentro do mesmo contexto celular, que pode ter diferentes papéis biológicos, e, por conseguinte, os interactores que são identificados por AP-MS pode representar uma mistura de conjuntos de proteínas distintas ou entidades funcionais. Não é possível derivartal informação topológica, a priori, a partir das listas de mono-dimensional de proteínas gerados por simples experiências de AP-MS. No entanto, a técnica pode ser explorada para definir a arquitectura de complexos de proteínas por combinação com um ou mais métodos para resolver estes conjuntos. A fim de resolver a topologia de interacções proteína identificada através de AP-EM, várias estratégias têm sido aplicadas. Uma abordagem consiste em realizar iterativos experiências AP-MS utilizando as presas identificados numa fase anterior de experiências como iscos 1. Embora muito informativo, esta é uma tarefa intensiva muito trabalho, tanto experimentalmente e analiticamente. Proteína de reticulação em combinação com a espectrometria de massa é cada vez mais utilizada para derivar informação topológica de complexos de proteína 2, 3, 4, 5. No entanto, ComputatioA análise final dos péptidos de ligação cruzada continua a ser uma tarefa difícil e, portanto, é o afunilamento no fluxo de trabalho. O advento de reagentes de ligação cruzada MS cliváveis deve facilitar o mapeamento dos resíduos de aminoácidos que estão em estreita proximidade em proteínas que interagem 6, 7. Outra alternativa é a de combinar a purificação por afinidade com técnicas de separação ortogonais anteriores 8, 9. Fraccionamento cromatográfico por filtração em gel ou de permuta iónica, ou fraccionamento em gradiente de sacarose foram também recentemente utilizado em combinação com espectrometria de massa quantitativo para descrever os complexos multiproteicos a um nível de todo o sistema, contornando o passo complexo de isolamento 10, 11, 12, 13. electroforese em gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE) tem sido amplamente aplicada parainvestigar interacções entre proteínas nativas, tipicamente as que envolvem complexos de proteína de membrana mitocondrial 14. Esta técnica de separação também foi recentemente utilizada em combinação com a quantificação de proteína livre de marcador e perfis de correlação, não só em complexos mitocondriais 15, 16, 17, mas também para desvendar outros complexos de proteínas a partir de células inteiras 18, 19. Colocámos a hipótese de que a combinação de purificação por afinidade com abordagens de fraccionamento nativas subsequentes e MS quantitativa deve fornecer uma estratégia útil para a resolução de múltiplos conjuntos de proteínas que contêm uma proteína particular. Aqui, descrevemos um método que combina a purificação por afinidade à base de epitopo genérico com electroforese em gel de poliacrilamida nativa azul dos complexos isolados, seguido por SP massa quantitativoectrometry e perfilamento correlação proteína, para resolver os vários conjuntos de uma proteína pode ser envolvidos em. Empregamos rato embrionário de células estaminais em que uma protea de interesse fundida com uma etiqueta de epítopo é expresso a partir do locus endógeno para atingir perto de abundância fisiológico e assegurar nativa eficiente isolamento complexo. Esta abordagem desvenda as múltiplas interacções uma proteína envolve, resolvê-los em conjuntos distintos com base nos seus perfis de correlação, enquanto que não exige mais trabalho do que o convencional GELC-MS 20.

<table><tbody><tr><td>Proteína G Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>FLAG anticorpo M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, grau proteico, solução a 10%</td><td>Millipore</td><td>655206</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil pimelimidato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80490</td><td></td></tr><tr><td>0,2 M Tampão de trietanolamina, pH 8,2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0449</td><td></td></tr><tr><td>3x Peptídeo FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 5K NMWCO, PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0112</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td><td>Life Technologies</td><td>BN1001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Catódico</td><td>Aditivo Life Technologies</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>4x Buffer de carregamento de amostra NativePAGE</td><td>Life Technologies</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NativeMARK</td><td>Life Technologies</td><td>LC0725</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 5% G-250 aditivo de amostra&nbsp;</td><td>Placa</td> de 96 poços de fundo cônico Nunc <td>BN2004</td><td></td>da Life Technologies</tr><tr><td>, polipropileno</td><td>Sistema</td><td></td> de filtragem de 96 poços Thermo 249944 <td></td></tr><tr><td>Multiscreen HTS Sistema de filtragem de 96 poços</td><td>Thermo</td><td>MSDVN6550</td><td></td></tr><tr><td>Nunc tampa de 96 poços natural</td><td>Thermo</td><td>276002</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (cloridrato de Tris(2-carboxietil)fosfina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila, grau HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, grau de sequenciamento</td><td>Roche</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant (software)</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td></tr><tr><td>Perseus (software)</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td></tr></tbody></table>

resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por azul native page e proteína correlação profiling

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

A maioria das proteínas atua em associação com outras; portanto, é crucial caracterizar essas unidades funcionais para entender completamente os processos biológicos. A purificação de afinidade acoplada à espectrometria de massas (AP-MS) tornou-se o método de escolha para identificar interações proteína-proteína. No entanto, os estudos convencionais de AP-MS fornecem informações sobre as interações proteicas, mas as informações organizacionais são perdidas. Para resolver esse problema, desenvolvemos uma estratégia para desvendar os distintos conjuntos funcionais em que uma proteína pode estar envolvida, resolvendo complexos de proteínas purificados por afinidade antes de sua caracterização por espectrometria de massa. Complexos proteicos isolados por meio da purificação por afinidade de uma proteína isca usando uma etiqueta de epítopo e eluição competitiva são separados por eletroforese nativa azul. A comparação de perfis de migração de proteínas por meio de perfis de correlação usando espectrometria de massa quantitativa permite a atribuição de proteínas de interação a entidades moleculares distintas. Este método é capaz de resolver complexos proteicos de pesos moleculares próximos que podem não ser resolvidos por técnicas cromatográficas tradicionais, como filtração em gel. Com pouco mais trabalho do que o AP-geLC-MS/MS convencional, demonstramos que essa estratégia pode, em muitos casos, ser adequada para obter informações topológicas do complexo proteico concomitantemente à identificação de interações proteicas.

O fluxo de trabalho da purificação por afinidade azul perfis Correlação proteína nativa por Espectrometria de Massa de estratégia (ABC-MS) é representado na Figura 7. complexos de proteínas nativas em torno de uma proteína de interesse é isolado por purificação de afinidade utilizando anticorpos contra um marcador epitico (neste caso FLAG) e eluição competitiva. Os complexos são resolvidos por BN-PAGE, e toda a pista de gel é excisado em 48 secções, e preparado para a espingarda LC-MS / MS. MS informação quantitativa é utilizado para gerar um perfil de migração para cada proteína identificada através da separação nativa azul. As proteínas que interagem para formar um complexo de exibição distintos perfis de migração similares com picos sobreponíveis. Quando uma proteína de interesse participa em mais do que um conjunto, picos múltiplos são observados no seu perfil de migração, dadas as sub-complexos estão dentro da potência de resolução do gel nativo azul. Uma comparação sistemática do migperfis de ração pode ser realizada através de correlação de perfil proteína usando agrupamento hierárquico. O dendrograma e as intensidades dos picos para todas as fracções são visualizados num mapa-calor, facilitando a identificação de proteínas que interagem que pertencem a complexos de proteínas distintas (Figura 8). Nós usamos esta estratégia para analisar os parceiros interagindo de MTA2, uma subunidade núcleo da cromatina NURD remodelação complexo 20. Como mostrado na Figura 9, o perfil de migração de MTA2 exibidos dois picos de diferentes intensidades entre 700 kDa e 1,2 MDa, com o pico de massa mais baixa exibindo maior abundância. Outras subunidades de núcleo NURD, incluindo mta1 / 3, HDAC1 / 2 e Mbd3, apresentaram um padrão de separação idênticas, embora os picos de alguns dos sub-unidades, nomeadamente CC4, Gatad2a / b e Rbbp4 / 7, teve a distribuição abundância inversa (Figura 9A, B). Em contraste, o perfil de Cdk2ap1, um factor regulador que recruta o complexo NURD a promotores de genes Wnt 23, é indicado apenas o maior pico de massa (Figura 9C), e por isso, Sall4, um repressor transcricional que também tem sido demonstrado que se ligam NURD 20, 24, 25. Assim, o fraccionamento de proteínas associadas a MTA2 purificados por afinidade por PAGE nativa azul era capaz de resolver duas formas diferentes do complexo NURD. ABC-MS também permite a identificação de novos interactores enquanto atribuindo-lhes a entidades proteína particular. Através da análise dos agregados de proteínas e intensidades fracção representados num mapa de calor-se detectou uma forte correlação entre as subunidades e NURD Wdr5, uma subunidade reguladora do complexo metiltransferase MLL 26, com Wdr5 exibindo dois picos de migração coincidentes com os dois p NURDeaks (Figura 8), sugerindo uma interacção entre romance Wdr5 e NURD. Nós confirmamos essa interação por co-imunoprecipitação e co-migração na cromatografia de exclusão de tamanho 20. A escolha de cálculo da métrica de distância no agrupamento hierárquico irão influenciar a forma dos aglomerados e, consequentemente, as correlações. Recomendamos experimentar com as diferentes métricas para conseguir o melhor ajuste com o conhecimento interação existente da proteína ou complexo de interesse. Geralmente conseguimos melhores resultados com a Manhattan (L1) métrica de distância 20. De correlação de Pearson ou métrica de distância Euclidiana também têm sido relatados para a identificação de complexos baseados em técnicas alternativas de fraccionamento 10, 11, 12. a quandados titativo MS obtidos a partir das fracções nativas azul também podem ser usadas para determinar a estequiometria de complexos de proteínas. O valor iBAQ (intensidade baseado absoluto quantificação) proporciona uma medida da abundância relativa de proteínas identificadas 27, 28. Os valores iBAQ para os membros de proteínas complexas em todas as fracções dentro de um perfil de migração de pico são normalizados para que a proteína de isco para obter quantidades relativas. Os iBAQs normalizados através de um pico de perfil para um membro do complexo dada proteína deve seguir uma tendência horizontal, e os valores de tendência reflectir a estequiometria das proteínas que interagem relativos à proteína de isco. Para uma representação mais detalhada de cálculos estequiometria, ver 20. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> Figura 7: fluxo de trabalho resumindo esquemática a ABC-MS sSTRATÉGIA. Este valor é modificado a partir do 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> Figura 8. agrupamento hierárquico dos perfis de migração BN-PAGE de interactores MTA2. proteínas associadas a MTA2 foram agrupados com base na similaridade das suas perfis de migração. Apenas um subconjunto de o-mapa de calor contendo o complexo NURD é mostrado (fechado na caixa azul). A caixa amarela destaca a forte correlação de Wdr5 com o complexo NURD. Os pesos moleculares foram estimados a partir anotadas as distâncias de migração dos padrões de proteínas são executados no mesmo gel. Esta pesquisa foi originalmente publicado em Molecular e Celular Proteomics 20 da Sociedade Americana de Bioquímica e Mo<html> Biologia lecular. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> Figura 9. Perfil de migração BN-PAGE de subunidades NURD e proteínas associadas. A) MTA2 e NURD subunidades presentes em um padrão de intensidade semelhante. B) MTA2 e NURD subunidades com o padrão de intensidade inversa. C) MTA2 e Cdk2ap1, que está presente apenas na entidade NURD peso molecular mais elevado. Os pesos moleculares foram estimados a partir anotados o perfil de migração dos padrões de proteínas. Esta pesquisa foi originalmente publicado em Molecular e Celular Proteomics 20 da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular._blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Arquivo suplementar" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> Dados Suplementar: conjunto de dados de amostra. arquivo proteingroups.txt contendo identificações de proteínas e os valores de quantificao a partir de um experimento ABC-MS MaxQuant-derivado. Esta pesquisa foi originalmente publicado em Molecular e Celular Proteomics 20 da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a>

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

O objetivo geral dessa estratégia experimental é resolver os distintos conjuntos funcionais nos quais uma proteína pode estar envolvida, por meio da fracionamento por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul de complexos proteicos purificados por afinidade e do perfil de correlação por espectrometria de massas. Este método pode ajudar a acrescentar informações organizacionais às listas de proteínas geradas por experimentos de espectrometria de massas em larga escala com purificação por afinidade. As principais vantagens deste procedimento são sua simplicidade na execução, boa resolução e o fato de exigir pouco trabalho a mais do que o CMSMS convencional em gel.Este protocolo é otimizado para a purificação de complexos proteicos a partir de 200 a 500 milhões de células que expressam níveis endógenos de uma proteína marcada com FLAG. Após o descongelamento do pellet celular, conforme descrito no protocolo textual, adicione cinco mililitros de tampão de lise gelado contendo DTT e inibidores de protease à suspensão celular e agite suavemente para misturar. Incube a suspensão em gelo por 10 minutos.Transfira a suspensão celular para um homogeneizador refrigerado. Lisar as células com 20 a 30 movimentos, utilizando o pistilo ajustado até que não haja viscosidade aparente, em seguida transfira o homogenato para tubos de microcentrífuga frios. Após a centrifugação dos tubos, transfira o lisado clarificado para um tubo limpo e frio, deixando aproximadamente 50 microlitros de lisado para trás.Guarde uma alíquota de 35 microlitros do lisado para medir a concentração de proteína e monitorar a purificação. Em seguida, remova o tampão dos grânulos previamente preparados. Re-suspenda os grânulos com um mililitro do lisado e, então, misture com o restante do lisado.Incube a mistura em uma roda rotativa a quatro graus Celsius por uma a duas horas. Colete as microesferas na parede do tubo com um ímã. Retire uma alíquota de 30 microlitros do sobrenadante e descarte o restante.Resuspenda as microesferas em 0,5 mililitros de tampão IPP150 pipetando de quatro a seis vezes. Em seguida, transfira a suspensão para um tubo frio de 1,5 mililitro. A seguir, lave as microesferas três vezes com 0,5 mililitros de tampão nativo de eluição FLAG.Com a última lavagem, transfira as microesferas para um novo tubo frio. Remova completamente o tampão. Resuspenda as microesferas em 100 microlitros de peptídeo 3X5 a 200 microgramas por mililitro no tampão de eluição nativo.Em seguida, incubar a quatro graus Celsius por 10 minutos com rotação suave. Coletar as microesferas com o ímã e transferir o sobrenadante para um novo tubo frio. Repetir este passo duas vezes antes de coletar todos os eluatos.Concentre o eluato até 25 microlitros em uma unidade de filtro centrífugo por centrifugação a 10.000 vezes G a quatro graus Celsius. Prepare a amostra adicionando tampão de carga nativo 4X e aditivo de amostra 0,5% G-250 ao eluato concentrado de 25 microlitros. Carregue a amostra e os marcadores nativos de peso molecular, deixando um poço vazio entre eles.Em seguida, carregue de 10 a 20 microlitros de tampão de carregamento nativo 1X em todos os poços vazios. Encha cuidadosamente a câmara catódica com 200 mililitros de tampão catódico escuro azul nativo PAGE 1X, tomando cuidado para não perturbar as amostras. Encha a câmara anódica com 550 mililitros de tampão anódico nativo PAGE 1X.Execute o gel a 150 volts por 30 minutos. Após interromper a eletroforese, remova o tampão catódico azul escuro com uma pipeta serológica e substitua por tampão catódico azul claro 1X. Após continuar a corrida por 60 minutos, abra a cassete do gel e descarte uma das placas da cassete.O gel permanece preso à outra placa da cassete. Coloque o gel em uma bandeja contendo solução fixadora suficiente para cobri-lo e incube por 30 minutos sob agitação suave. Em seguida, remova a solução fixadora e substitua por água antes de escanear o gel.Para preparar a espectrometria de massas, coloque primeiro uma placa de 96 poços com fundo cônico sobre outra placa de 96 poços para coletar os resíduos. Fure o fundo dos poços da placa de 96 poços com fundo cônico com uma agulha de 21 gauge. Em seguida, adicione 200 microlitros de acetonitrila 50%, ácido fórmico 0,25% aos poços da placa furada.Incube a pilha de placas em um agitador durante 10 minutos. Em seguida, centrifugue a placa a 500 vezes G durante um minuto, para que o líquido passe pelos orifícios e vá para a placa de coleta de resíduos. Após repetir os passos de lavagem duas vezes, preencha os poços da placa de 96 poços perfurada com 150 microlitros de bicarbonato de amônio 50 milimolar.Em seguida, coloque o gel sobre uma superfície limpa. Corte a fileira contendo a amostra em 48 fatias idênticas. Corte cada fatia em dois ou três pedaços menores, exceto as últimas cinco fatias na parte superior do gel.Coloque cada fatia sequencialmente em um poço de uma placa de 96 poços com a extremidade perfurada previamente lavada. Adicione 50 microlitros de acetonitrila a cada poço e incube a placa sob agitação por 30 a 60 minutos. Após a remoção do líquido por centrifugação, adicione 200 microlitros de TSEB 2 milimolar e bicarbonato de amônio 50 milimolar a cada poço.Incube a placa com agitação por 30 minutos à temperatura ambiente antes de remover o líquido por centrifugação, como anteriormente. Desidrate os pedaços de gel adicionando 200 microlitros de acetonitrila pura e incube com agitação à temperatura ambiente por 20 minutos, até que os pedaços de gel fiquem brancos e opacos. Após a remoção da acetonitrila, adicione 150 microlitros de tripsina em bicarbonato de amônio frio a cada poço.Incube a placa com agitação a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, posicione uma placa limpa de fundo cônico sob a placa contendo o gel, garantindo a orientação correta das placas. Depois, colete o líquido contendo os peptídeos por centrifugação a 200 vezes G por um minuto.Coloque a placa contendo os peptídeos em um evaporador centrífugo e evapore o líquido enquanto realiza o próximo passo. Adicione 150 microlitros de acetonitrila 50%, ácido fórmico 0,25% aos fragmentos de gel. Incube sob agitação a 37 graus Celsius por 30 minutos.Coletar o líquido na placa parcialmente seca por centrifugação a 200 vezes G durante um minuto. Continuar evaporando a placa contendo os peptídeos enquanto realiza o próximo passo. Transferir as soluções de peptídeos para a placa de filtração centrífuga lavada.Coloque uma placa limpa de fundo cônico abaixo para coletar os peptídeos e centrifugue a pilha de placas como antes. Evapore o líquido da placa de fundo cônico até que os poços estejam completamente secos. Uma vez secos, a placa pode ser coberta com uma tampa de silicone e armazenada a menos 20 graus Celsius até a realização da espectrometria de massas e análise de dados conforme descrito no protocolo textual.Resultados representativos da agrupamento hierárquico de perfis de migração em eletroforese nativa azul de Mta2 e proteínas copurificadas são mostrados aqui como um dendrograma e um mapa de calor representando as intensidades proteicas. O perfil de migração de Mta2 mostra dois picos indicativos de dois complexos distintos. Algumas subunidades do NuRD exibem um padrão semelhante, com maior abundância no complexo de menor peso molecular.Por outro lado, outras subunidades do NuRD são mais abundantes no complexo NuRD de alto peso molecular. Por outro lado, o interagente de Mta2, Cdk2ap1, está presente apenas no complexo NuRD de alto peso molecular. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois dias e meio.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter todas as amostras e reagentes em gelo para evitar a dissociação dos complexos proteicos. Este procedimento pode ser aplicado a qualquer proteína de interesse, desde que possa ser analisada a partir do meio de afinidade por eluição competitiva em condições nativas. Após este procedimento, outros métodos como co-imunoprecipitação reversa ou sequencial podem ser realizados para validar os subcomplexos identificados.

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