Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling
1 de abril de 2017
Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.
O objetivo geral dessa estratégia experimental é resolver os distintos conjuntos funcionais nos quais uma proteína pode estar envolvida, por meio da fracionamento por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul de complexos proteicos purificados por afinidade e do perfil de correlação por espectrometria de massas. Este método pode ajudar a acrescentar informações organizacionais às listas de proteínas geradas por experimentos de espectrometria de massas em larga escala com purificação por afinidade. As principais vantagens deste procedimento são sua simplicidade na execução, boa resolução e o fato de exigir pouco trabalho a mais do que o CMSMS convencional em gel.
Este protocolo é otimizado para a purificação de complexos proteicos a partir de 200 a 500 milhões de células que expressam níveis endógenos de uma proteína marcada com FLAG. Após o descongelamento do pellet celular, conforme descrito no protocolo textual, adicione cinco mililitros de tampão de lise gelado contendo DTT e inibidores de protease à suspensão celular e agite suavemente para misturar. Incube a suspensão em gelo por 10 minutos.
Transfira a suspensão celular para um homogeneizador refrigerado. Lisar as células com 20 a 30 movimentos, utilizando o pistilo ajustado até que não haja viscosidade aparente, em seguida transfira o homogenato para tubos de microcentrífuga frios. Após a centrifugação dos tubos, transfira o lisado clarificado para um tubo limpo e frio, deixando aproximadamente 50 microlitros de lisado para trás.
Guarde uma alíquota de 35 microlitros do lisado para medir a concentração de proteína e monitorar a purificação. Em seguida, remova o tampão dos grânulos previamente preparados. Re-suspenda os grânulos com um mililitro do lisado e, então, misture com o restante do lisado.
Incube a mistura em uma roda rotativa a quatro graus Celsius por uma a duas horas. Colete as microesferas na parede do tubo com um ímã. Retire uma alíquota de 30 microlitros do sobrenadante e descarte o restante.
Resuspenda as microesferas em 0,5 mililitros de tampão IPP150 pipetando de quatro a seis vezes. Em seguida, transfira a suspensão para um tubo frio de 1,5 mililitro. A seguir, lave as microesferas três vezes com 0,5 mililitros de tampão nativo de eluição FLAG.
Com a última lavagem, transfira as microesferas para um novo tubo frio. Remova completamente o tampão. Resuspenda as microesferas em 100 microlitros de peptídeo 3X5 a 200 microgramas por mililitro no tampão de eluição nativo.
Em seguida, incubar a quatro graus Celsius por 10 minutos com rotação suave. Coletar as microesferas com o ímã e transferir o sobrenadante para um novo tubo frio. Repetir este passo duas vezes antes de coletar todos os eluatos.
Concentre o eluato até 25 microlitros em uma unidade de filtro centrífugo por centrifugação a 10.000 vezes G a quatro graus Celsius. Prepare a amostra adicionando tampão de carga nativo 4X e aditivo de amostra 0,5% G-250 ao eluato concentrado de 25 microlitros. Carregue a amostra e os marcadores nativos de peso molecular, deixando um poço vazio entre eles.
Em seguida, carregue de 10 a 20 microlitros de tampão de carregamento nativo 1X em todos os poços vazios. Encha cuidadosamente a câmara catódica com 200 mililitros de tampão catódico escuro azul nativo PAGE 1X, tomando cuidado para não perturbar as amostras. Encha a câmara anódica com 550 mililitros de tampão anódico nativo PAGE 1X.
Execute o gel a 150 volts por 30 minutos. Após interromper a eletroforese, remova o tampão catódico azul escuro com uma pipeta serológica e substitua por tampão catódico azul claro 1X. Após continuar a corrida por 60 minutos, abra a cassete do gel e descarte uma das placas da cassete.
O gel permanece preso à outra placa da cassete. Coloque o gel em uma bandeja contendo solução fixadora suficiente para cobri-lo e incube por 30 minutos sob agitação suave. Em seguida, remova a solução fixadora e substitua por água antes de escanear o gel.
Para preparar a espectrometria de massas, coloque primeiro uma placa de 96 poços com fundo cônico sobre outra placa de 96 poços para coletar os resíduos. Fure o fundo dos poços da placa de 96 poços com fundo cônico com uma agulha de 21 gauge. Em seguida, adicione 200 microlitros de acetonitrila 50%, ácido fórmico 0,25% aos poços da placa furada.
Incube a pilha de placas em um agitador durante 10 minutos. Em seguida, centrifugue a placa a 500 vezes G durante um minuto, para que o líquido passe pelos orifícios e vá para a placa de coleta de resíduos. Após repetir os passos de lavagem duas vezes, preencha os poços da placa de 96 poços perfurada com 150 microlitros de bicarbonato de amônio 50 milimolar.
Em seguida, coloque o gel sobre uma superfície limpa. Corte a fileira contendo a amostra em 48 fatias idênticas. Corte cada fatia em dois ou três pedaços menores, exceto as últimas cinco fatias na parte superior do gel.
Coloque cada fatia sequencialmente em um poço de uma placa de 96 poços com a extremidade perfurada previamente lavada. Adicione 50 microlitros de acetonitrila a cada poço e incube a placa sob agitação por 30 a 60 minutos. Após a remoção do líquido por centrifugação, adicione 200 microlitros de TSEB 2 milimolar e bicarbonato de amônio 50 milimolar a cada poço.
Incube a placa com agitação por 30 minutos à temperatura ambiente antes de remover o líquido por centrifugação, como anteriormente. Desidrate os pedaços de gel adicionando 200 microlitros de acetonitrila pura e incube com agitação à temperatura ambiente por 20 minutos, até que os pedaços de gel fiquem brancos e opacos. Após a remoção da acetonitrila, adicione 150 microlitros de tripsina em bicarbonato de amônio frio a cada poço.
Incube a placa com agitação a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, posicione uma placa limpa de fundo cônico sob a placa contendo o gel, garantindo a orientação correta das placas. Depois, colete o líquido contendo os peptídeos por centrifugação a 200 vezes G por um minuto.
Coloque a placa contendo os peptídeos em um evaporador centrífugo e evapore o líquido enquanto realiza o próximo passo. Adicione 150 microlitros de acetonitrila 50%, ácido fórmico 0,25% aos fragmentos de gel. Incube sob agitação a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Coletar o líquido na placa parcialmente seca por centrifugação a 200 vezes G durante um minuto. Continuar evaporando a placa contendo os peptídeos enquanto realiza o próximo passo. Transferir as soluções de peptídeos para a placa de filtração centrífuga lavada.
Coloque uma placa limpa de fundo cônico abaixo para coletar os peptídeos e centrifugue a pilha de placas como antes. Evapore o líquido da placa de fundo cônico até que os poços estejam completamente secos. Uma vez secos, a placa pode ser coberta com uma tampa de silicone e armazenada a menos 20 graus Celsius até a realização da espectrometria de massas e análise de dados conforme descrito no protocolo textual.
Resultados representativos da agrupamento hierárquico de perfis de migração em eletroforese nativa azul de Mta2 e proteínas copurificadas são mostrados aqui como um dendrograma e um mapa de calor representando as intensidades proteicas. O perfil de migração de Mta2 mostra dois picos indicativos de dois complexos distintos. Algumas subunidades do NuRD exibem um padrão semelhante, com maior abundância no complexo de menor peso molecular.
Por outro lado, outras subunidades do NuRD são mais abundantes no complexo NuRD de alto peso molecular. Por outro lado, o interagente de Mta2, Cdk2ap1, está presente apenas no complexo NuRD de alto peso molecular. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois dias e meio.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter todas as amostras e reagentes em gelo para evitar a dissociação dos complexos proteicos. Este procedimento pode ser aplicado a qualquer proteína de interesse, desde que possa ser analisada a partir do meio de afinidade por eluição competitiva em condições nativas. Após este procedimento, outros métodos como co-imunoprecipitação reversa ou sequencial podem ser realizados para validar os subcomplexos identificados.
Visão Geral
Este artigo apresenta protocolos para purificação por afinidade de complexos proteicos seguida por eletroforese nativa em gel azul e espectrometria de massas. O método resolve efetivamente os interatomas em complexos proteicos distintos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Bioquímica
- Proteômica
Antecedentes
- A purificação por afinidade é essencial para o estudo de interações proteicas.
- A eletroforese nativa azul permite a separação de complexos proteicos.
- A espectrometria de massas fornece análise quantitativa de proteínas.
- Este método aprimora a compreensão das funções e interações proteicas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo simplificado para a purificação de complexos proteicos.
- Aprimorar a resolução e a organização dos dados de interação proteica.
- Facilitar a análise de complexos proteicos provenientes de grandes populações celulares.
Métodos Utilizados
- Purificação por afinidade de proteínas com marcação FLAG a partir de lisados celulares.
- PAGE nativo azul para a separação de complexos proteicos.
- Espectrometria de massas quantitativa sem marcação para perfis de correlação proteica.
- Otimização da purificação a partir de 200 a 500 milhões de células.
Resultados Principais
- Resolução bem-sucedida de complexos proteicos distintos.
- Dados de alta qualidade obtidos por espectrometria de massas.
- O protocolo demonstrou simplicidade e boa resolução.
- Compreensão aprimorada das interações e funções proteicas.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido é eficaz para o estudo de complexos proteicos.
- Ele fornece um método confiável para análise por espectrometria de massas.
- Essa abordagem pode contribuir significativamente para a pesquisa proteômica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A resolução da topologia de complexos proteicos aprimora a validação de alvos ao revelar montagens funcionais para além das interações binárias. Este método auxilia na redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta, distinguindo complexos distintos que podem conduzir a resultados de sinalização divergentes. Ele permite maior confiança preditiva na seleção de alvos ao vincular dados do interatoma à organização estrutural.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas ao determinar se uma proteína isca interage com complexos funcionais distintos em condições nativas.
- Valor Operacional: Acrescenta uma dimensão organizacional aos dados de AP-MS sem exigir reestruturação extensiva dos fluxos de trabalho existentes.
- Valor Preditivo: Permite discriminar entre interações transitórias de sustentação e complexos efetores estáveis para a priorização de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera perfis complexos de migração quantitativamente distinguíveis, adequados para perfis baseados em correlação em cascatas de triagem.
- Reprodutibilidade: A separação por eletroforese nativa azul fornece comportamento eletroforético consistente entre réplicas, favorecendo a padronização do ensaio.
- Escalabilidade: Compatível com entrada de 200 a 500 milhões de células, alinhando-se à produção em escala industrial de cultivos celulares para campanhas de validação de alvos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Complexos resolvidos podem ser rastreados entre modelos para avaliar alterações na montagem relevantes para doenças, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Redução de Riscos Mecanísticos: A distinção entre isoformas de complexos reduz o risco de atribuir incorretamente efeitos fenotípicos a parceiros de interação errados.
- Modelagem Pré-clínica: Permite a validação de perturbações específicas de complexos em modelos de doenças onde a composição das subunidades influencia a resposta terapêutica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra a purificação por afinidade com separação ortogonal para enriquecer mapas do interatoma em estágio de descoberta com contexto estrutural antes dos esforços de identificação de compostos iniciais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao determinar se as interações observadas ocorrem dentro de entidades moleculares discretas, em vez de associações promíscuas.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios com base em desvios de migração específicos de complexos como leituras quantitativas para remodelamento induzido por compostos.
- Análises: O perfil de correlação gera perfis quantitativos de migração que permitem a atribuição bioinformática de proteínas a complexos distintos.
- Pesquisa Translacional: Facilita a continuidade da resolução de complexos até a validação pré-clínica, preservando a organização em estado nativo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada para análise de topologia de complexos, aplicável a múltiplos alvos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em dados de interatoma ao atribuir proteínas a montagens específicas de complexos.
- Valor Operacional: Aproveita a infraestrutura existente de AP-MS com etapas adicionais mínimas, melhorando a produtividade sem necessidade de reestruturação significativa.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de prosseguir ou não ao revelar se o engajamento do alvo ocorre em complexos relevantes para a doença ou em complexos incidentais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em evidências funcionais específicas de complexos, e não apenas em contagens de interações.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de complexos proteicos nativos e na otimização de eletroforese nativa azul.
- Depende do acesso a sistemas de eletroforese de alta resolução e plataformas de espectrometria de massa quantitativa.
- Necessita protocolos padronizados para preservação dos complexos durante a lise e purificação, a fim de evitar dissociações artifatuais.
- Envolve considerações de adaptação quanto à estabilidade variável dos complexos, sensibilidade a detergentes e acessibilidade de epítopos entre diferentes classes de alvos.
- Limitação prática: A resolução depende das diferenças de massa dos complexos; montagens muito semelhantes podem exigir métodos complementares.
