Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

O objetivo geral desta estratégia experimental é resolver os distintos conjuntos funcionais em que uma proteína pode estar envolvida por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida nativa azul, fracionamento de complexos de proteínas purificadas por afinidade e perfil de correlação de espectrometria de massa. Este método pode ajudar a adicionar informações organizacionais às listas de proteínas geradas por experimentos de espectrometria massiva de purificação de afinidade. As principais vantagens deste procedimento são que é simples de executar, tem boa resolução e requer pouco mais trabalho do que o CMSMS de gel convencional.

Este protocolo é otimizado para a purificação de complexos proteicos de 200 a 500 milhões de células que expressam níveis endógenos de uma proteína marcada com FLAG. Depois de descongelar o pellet celular, conforme descrito no protocolo de texto, adicione cinco mililitros de tampão de lise gelada contendo DTT e inibidores de protease à suspensão celular e agite para misturar. Incube a suspensão no gelo por 10 minutos.

Transferir a suspensão celular para um homogeneizador a frio. Lisar as células com 20 a 30 golpes, usando o pilão apertado até que não haja viscosidade perceptível, depois transfira o homogeneizado para tubos de microcentrífuga frios. Depois de centrifugar os tubos, transfira o lisado limpo para um tubo limpo e frio, deixando aproximadamente 50 microlitros de lisado para trás.

Guarde uma alíquota de 35 microlitros de lisado para medir a concentração de proteínas e monitorar a purificação. Em seguida, remova o tampão das contas preparadas anteriormente. Ressuspenda as contas com um mililitro do lisado e misture com o restante do lisado.

Incube a mistura em uma roda giratória a quatro graus Celsius por uma a duas horas. Colete as contas na lateral do tubo com um ímã. Recolha uma alíquota de 30 microlitros de sobrenadante e descarte o restante.

Ressuspenda os grânulos em 0,5 mililitros de tampão IPP150 pipetando quatro a seis vezes. Em seguida, transfira a suspensão para um tubo frio de 1,5 mililitro. Em seguida, lave as esferas três vezes com 0,5 mililitros de tampão nativo de eluição FLAG.

Com a última lavagem, transfira as contas para um novo tubo frio. Remova bem o buffer. Ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de 200 microgramas por mililitro de peptídeo 3X5 em tampão de eluição nativo.

Em seguida, incube a quatro graus Celsius por 10 minutos com rotação suave. Colete as contas com o ímã e transfira o sobrenadante para um novo tubo frio. Repita esta etapa duas vezes antes de puxar todos os eluatos.

Concentre o eluído até 25 microlitros em uma unidade de filtro centrífugo por centrifugação a 10.000 vezes G a quatro graus Celsius. Prepare a amostra adicionando 4X tampão de carregamento de amostra nativa e aditivo de amostra 0,5% G-250 ao eluato concentrado de 25 microlitros. Carregue a amostra e os marcadores de peso molecular nativos, deixando um poço vazio entre eles.

Em seguida, carregue de 10 a 20 microlitros de tampão de carregamento de amostra nativa 1X em todos os poços vazios. Encha a câmara catódica com 200 mililitros de tampão catódico azul escuro 1X PAGE nativo com cuidado, para não perturbar as amostras. Encha a câmara do ânodo com 550 mililitros de tampão de ânodo 1X PAGE nativo.

Execute o gel a 150 volts por 30 minutos. Depois de interromper a corrida, remova o tampão catódico azul escuro com uma pipeta sorológica e substitua por um tampão catódico azul claro 1X. Depois de continuar a execução por 60 minutos, abra o de gel e descarte uma das placas do.

O gel permanece preso à outra placa de. Coloque o gel em uma bandeja contendo solução fixadora suficiente para cobri-lo e incube por 30 minutos com agitação suave. Em seguida, remova a solução fixadora e substitua por água antes de escanear o gel.

Para se preparar para a espectrometria de massa, primeiro coloque uma placa cônica de 96 poços em cima de outra placa de 96 poços para coletar os resíduos. Perfure o fundo dos poços da placa de fundo cônico de 96 poços com uma agulha de calibre 21. Em seguida, adicione 200 microlitros de acetonitrila a 50% e ácido fórmico a 0,25% aos poços da placa perfurada.

Incube a pilha de placas em uma coqueteleira por 10 minutos. Em seguida, centrifugue a placa a 500 vezes G por um minuto, de modo que o líquido flua pelos orifícios para a placa de coleta de resíduos. Depois de repetir as etapas de lavagem duas vezes, encha os poços da placa perfurada de 96 poços com 150 microlitros de bicarbonato de amônio 50 milimolares.

Em seguida, coloque o gel em uma superfície limpa. Corte a pista que contém a amostra em 48 fatias idênticas. Corte cada fatia em dois ou três pedaços menores, exceto as últimas cinco fatias na parte superior do gel.

Coloque cada fatia sequencialmente em um poço da placa de 96 poços lavada com a extremidade perfurada. Adicione 50 microlitros de acetonitrila a cada poço e incube a placa agitando por 30 a 60 minutos. Depois de remover o líquido por centrifugação, adicione 200 microlitros de TSEB de dois milímetros e bicarbonato de amônio 50 milimolares a cada poço.

Incubar a placa agitando por 30 minutos à temperatura ambiente antes de remover o líquido por centrifugação como antes. Desidrate os pedaços de gel adicionando 200 microlitros de acetonitrila pura e incube agitando em temperatura ambiente por 20 minutos até que os pedaços de gel fiquem brancos e opacos. Depois de remover a acetonitrila, adicione 150 microlitros de tripsina em bicarbonato de amônio frio a cada poço.

Incube a placa com agitação a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, coloque uma placa inferior cônica limpa sob a placa contendo gel, garantindo a orientação correta das placas. Em seguida, colete o líquido contendo os peptídeos por centrifugação a 200 vezes G por um minuto.

Coloque a placa contendo peptídeos em um evaporador centrífugo e evapore o líquido enquanto executa a próxima etapa. Adicione 150 microlitros de 50% de acetonitrila, 0,25% de ácido fórmico aos pedaços de gel. Incubar com agitação a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Recolher o líquido para a placa parcialmente seca por centrifugação a 200 vezes G durante um minuto. Continue evaporando os peptídeos contendo a placa enquanto executa a próxima etapa. Transfira as soluções peptídicas para a placa de filtração centrífuga lavada.

Coloque uma placa inferior cônica limpa embaixo dela para coletar os peptídeos e centrifugue a pilha de placas como antes. Evapore o líquido na placa inferior cônica até que os poços estejam completamente secos. Depois de seca, a placa pode ser coberta com uma tampa de silicone e armazenada a menos 20 graus Celsius até realizar espectrometria de massa e análise de dados conforme descrito no protocolo de texto.

Resultados representativos do agrupamento hierárquico de perfis de migração PAGE nativos azuis de Mta2 e proteínas copurificadoras são mostrados aqui como um dendrograma e um mapa de calor representando intensidades de proteínas. O perfil de migração de Mta2 mostra dois picos indicativos de dois complexos distintos. Algumas subunidades NuRD mostram um padrão semelhante com maior abundância no conjunto de menor peso molecular.

Por outro lado, outras subunidades NuRD são mais abundantes na montagem NuRD de maior peso molecular. Por outro lado, o interagente Mta2, Cdk2ap1, está presente apenas na montagem NuRD de maior peso molecular. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias e meio.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todas as amostras e reagentes no gelo para evitar a dissociação de complexos de proteínas. Este procedimento pode ser aplicado a qualquer proteína de interesse, desde que possa ser analisado a partir do meio de afinidade por eluição competitiva em condições nativas. Após este procedimento, outros métodos como co-imunoprecipitação reversa ou sequencial podem ser realizados para validar os subcomplexos identificados.