Utilização do ultra-som guiado implantação celular tecido-dirigido para o estabelecimento de Xenografts biologicamente relevantes Tumor metastático

O objetivo deste método é estabelecer xenoenxertos ortotópicos de câncer biologicamente relevantes para estudos pré-clínicos. As células de neuroblastoma derivadas do paciente são injetadas na glândula adrenal murina por orientação por ultrassom sem cirurgia aberta ou recuperação prolongada. Este método pode ajudar a responder a questões críticas na biologia do câncer e na pesquisa translacional, como estudos de evolução tumoral, respostas terapêuticas no microambiente nativo e metástases.

Tal conhecimento melhoraria muito a confiabilidade dos estudos pré-clínicos e facilitaria a descoberta de medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é derivada do paciente, direcionada ao tecido, eficiente e confiável na produção de um modelo xenografado ortotópico para pesquisa de terapia do câncer. Demonstrando as etapas críticas do procedimento estará Sahiti Chukkapalli, técnico sênior e gerente de laboratório, junto com Tina Thomas, pesquisadora em nosso laboratório.

Gere uma única suspensão de células cancerígenas derivadas do paciente a partir do tecido tumoral usando um kit de dissociação tumoral. Comece transferindo aproximadamente meio grama de tecido tumoral para uma placa de cultura de células de 100 milímetros contendo cinco mililitros de tampão RPMI suplementado com enzima. Em seguida, use tesouras e pinças de tecido para picar o tumor em pequenos pedaços de dois a quatro milímetros.

Pipete a mistura tumoral em um tubo dissociador e feche o tubo. Inverta o tubo, prenda na manga de um dissociador de tecido e dissocie o tecido usando o programa apropriado. Após a dissociação, incube a suspensão de células tumorais em uma prateleira rotativa a 37 graus Celsius por uma hora.

Triturar a suspensão celular a cada 15 minutos durante a incubação. Após a incubação, transfira a suspensão celular para um novo tubo cônico de 50 mililitros e adicione 10 mililitros de RPMI. Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 314g por cinco minutos.

Após a centrifugação, remover o sobrenadante e suspender o pellet em cinco mililitros de RPMI. Passe a suspensão celular por um filtro de células de 40 mícrons e colete a solução coada em um tubo novo de 50 mililitros. Depois de lavar o filtro com cinco mililitros de mídia RPMI, centrifugue a suspensão da célula a 314g por cinco minutos para coletar um pellet.

Conte as células usando um hemocitômetro. Em seguida, suspenda o pellet em RPMI para obter uma concentração final de quatro vezes 10 elevado a cinco células por volume de 10 microlitros. Transfira cinco microlitros desta suspensão celular por injeção para um tubo novo e o mesmo volume de matriz da membrana basal para fazer 10 microlitros de solução celular para cada injeção e coloque-a no gelo.

Transfira o mouse para a plataforma de imagem com o lado abdominal voltado para baixo. Ajuste e prenda o cone do nariz para manter a anestesia com isoflurano. Comece o procedimento de implantação usando loção depilatória e um barbeador para depilar as costas e o flanco de um camundongo NSG imunodeficiente de seis a oito semanas devidamente anestesiado.

Aplique pomada óptica sobre os olhos do animal para evitar o ressecamento. Em seguida, prenda o mouse no lugar para evitar qualquer movimento inadvertido. Em seguida, use a visualização por ultrassom para identificar o fígado murino, a veia cava, o baço, o rim esquerdo e a glândula adrenal esquerda adjacente.

Carregue uma seringa Hamilton gelada, equipada com uma agulha de pequeno calibre, com 10 microlitros de solução celular. Em seguida, sob orientação de ultrassom, insira suavemente um cateter de calibre 22 resfriado através da pele e do músculo das costas, diretamente na glândula adrenal esquerda para fornecer um canal para injeção celular. Remova a agulha e deixe o cateter no lugar.

A visualização da glândula adrenal durante toda a inserção do cateter, juntamente com a agulha e seu trajeto, é imperativa para garantir o mínimo de lesão às estruturas e órgãos circundantes e menor morbidade murina. Em seguida, guie a seringa através do cateter posicionado no centro da glândula adrenal. Como a seringa é guiada através do cateter, é importante manter a estabilidade do cateter e observar o avanço da agulha.

Observe que a agulha em si se estende aproximadamente dois milímetros além da terminação do cateter, sua posição facilmente vista no ultrassom. Injete as células no tecido adrenal alvo. Deixe a agulha no lugar por um a dois minutos para permitir que a matriz da membrana basal endureça.

Após a fixação da matriz da membrana basal, remova lentamente a agulha, seguida pela remoção do cateter. Finalmente, coloque o camundongo em uma gaiola de recuperação até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal antes de retornar à gaiola de origem. A imagem de ultrassom monitora a progressão do tumor in vivo.

Esta imagem mostra uma imagem de ultrassom da glândula adrenal, uma semana após a injeção. Aqui, a imagem de luminescência de um camundongo injetado com neuroblastoma uma semana após a injeção mostra leituras não indicativas de enxerto tumoral. Após duas semanas, a ultrassonografia mostra enxerto tumoral e progressão para uma área de aproximadamente 40 milímetros quadrados.

A bioluminescência duas semanas após a injeção mostrou radiância medindo 10 elevado a sétimo, o que sugere captação celular e crescimento tumoral correlacionado com achados ultrassonográficos. A ultrassonografia oito semanas após a injeção mostrou crescimento contínuo do tumor com uma medição de área superior a 100 milímetros quadrados. Mais uma vez, a bioluminescência confirmou os achados do ultrassom com níveis de radiância aumentados de 10 a nove.

A ultrassonografia 3D do tumor mostrou um volume superior a 100 milímetros cúbicos, a linha de base que nosso laboratório utiliza para o início de ensaios terapêuticos pré-clínicos. O tumor excisado mediu macroscopicamente mais de um centímetro de tamanho, correlacionando-se com medidas de ultrassom e sinais de luminescência. Esta mídia fornece demonstração de como estabelecer com sucesso xenógrafos ortotópicos adrenais com células de neuroblastoma derivadas do paciente, utilizando orientação por ultrassom.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de 12 minutos por injeção, se for realizada corretamente.