Utilização do ultra-som guiado implantação celular tecido-dirigido para o estabelecimento de Xenografts biologicamente relevantes Tumor metastático
25 de maio de 2018
Aqui, apresentamos um protocolo utilizar injeção guiada por ultra-som de neuroblastoma (NB) e células (ES) de sarcoma de Ewing (estabeleceu linhas celulares e células tumorais do paciente-derivado) biologicamente relevantes locais para criar modelos pré-clínicos confiáveis para câncer pesquisa.
O objetivo deste método é estabelecer xenoenxertos ortotópicos de câncer biologicamente relevantes para estudos pré-clínicos. As células de neuroblastoma derivadas do paciente são injetadas na glândula adrenal murina por orientação por ultrassom sem cirurgia aberta ou recuperação prolongada. Este método pode ajudar a responder a questões críticas na biologia do câncer e na pesquisa translacional, como estudos de evolução tumoral, respostas terapêuticas no microambiente nativo e metástases.
Tal conhecimento melhoraria muito a confiabilidade dos estudos pré-clínicos e facilitaria a descoberta de medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é derivada do paciente, direcionada ao tecido, eficiente e confiável na produção de um modelo xenografado ortotópico para pesquisa de terapia do câncer. Demonstrando as etapas críticas do procedimento estará Sahiti Chukkapalli, técnico sênior e gerente de laboratório, junto com Tina Thomas, pesquisadora em nosso laboratório.
Gere uma única suspensão de células cancerígenas derivadas do paciente a partir do tecido tumoral usando um kit de dissociação tumoral. Comece transferindo aproximadamente meio grama de tecido tumoral para uma placa de cultura de células de 100 milímetros contendo cinco mililitros de tampão RPMI suplementado com enzima. Em seguida, use tesouras e pinças de tecido para picar o tumor em pequenos pedaços de dois a quatro milímetros.
Pipete a mistura tumoral em um tubo dissociador e feche o tubo. Inverta o tubo, prenda na manga de um dissociador de tecido e dissocie o tecido usando o programa apropriado. Após a dissociação, incube a suspensão de células tumorais em uma prateleira rotativa a 37 graus Celsius por uma hora.
Triturar a suspensão celular a cada 15 minutos durante a incubação. Após a incubação, transfira a suspensão celular para um novo tubo cônico de 50 mililitros e adicione 10 mililitros de RPMI. Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 314g por cinco minutos.
Após a centrifugação, remover o sobrenadante e suspender o pellet em cinco mililitros de RPMI. Passe a suspensão celular por um filtro de células de 40 mícrons e colete a solução coada em um tubo novo de 50 mililitros. Depois de lavar o filtro com cinco mililitros de mídia RPMI, centrifugue a suspensão da célula a 314g por cinco minutos para coletar um pellet.
Conte as células usando um hemocitômetro. Em seguida, suspenda o pellet em RPMI para obter uma concentração final de quatro vezes 10 elevado a cinco células por volume de 10 microlitros. Transfira cinco microlitros desta suspensão celular por injeção para um tubo novo e o mesmo volume de matriz da membrana basal para fazer 10 microlitros de solução celular para cada injeção e coloque-a no gelo.
Transfira o mouse para a plataforma de imagem com o lado abdominal voltado para baixo. Ajuste e prenda o cone do nariz para manter a anestesia com isoflurano. Comece o procedimento de implantação usando loção depilatória e um barbeador para depilar as costas e o flanco de um camundongo NSG imunodeficiente de seis a oito semanas devidamente anestesiado.
Aplique pomada óptica sobre os olhos do animal para evitar o ressecamento. Em seguida, prenda o mouse no lugar para evitar qualquer movimento inadvertido. Em seguida, use a visualização por ultrassom para identificar o fígado murino, a veia cava, o baço, o rim esquerdo e a glândula adrenal esquerda adjacente.
Carregue uma seringa Hamilton gelada, equipada com uma agulha de pequeno calibre, com 10 microlitros de solução celular. Em seguida, sob orientação de ultrassom, insira suavemente um cateter de calibre 22 resfriado através da pele e do músculo das costas, diretamente na glândula adrenal esquerda para fornecer um canal para injeção celular. Remova a agulha e deixe o cateter no lugar.
A visualização da glândula adrenal durante toda a inserção do cateter, juntamente com a agulha e seu trajeto, é imperativa para garantir o mínimo de lesão às estruturas e órgãos circundantes e menor morbidade murina. Em seguida, guie a seringa através do cateter posicionado no centro da glândula adrenal. Como a seringa é guiada através do cateter, é importante manter a estabilidade do cateter e observar o avanço da agulha.
Observe que a agulha em si se estende aproximadamente dois milímetros além da terminação do cateter, sua posição facilmente vista no ultrassom. Injete as células no tecido adrenal alvo. Deixe a agulha no lugar por um a dois minutos para permitir que a matriz da membrana basal endureça.
Após a fixação da matriz da membrana basal, remova lentamente a agulha, seguida pela remoção do cateter. Finalmente, coloque o camundongo em uma gaiola de recuperação até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal antes de retornar à gaiola de origem. A imagem de ultrassom monitora a progressão do tumor in vivo.
Esta imagem mostra uma imagem de ultrassom da glândula adrenal, uma semana após a injeção. Aqui, a imagem de luminescência de um camundongo injetado com neuroblastoma uma semana após a injeção mostra leituras não indicativas de enxerto tumoral. Após duas semanas, a ultrassonografia mostra enxerto tumoral e progressão para uma área de aproximadamente 40 milímetros quadrados.
A bioluminescência duas semanas após a injeção mostrou radiância medindo 10 elevado a sétimo, o que sugere captação celular e crescimento tumoral correlacionado com achados ultrassonográficos. A ultrassonografia oito semanas após a injeção mostrou crescimento contínuo do tumor com uma medição de área superior a 100 milímetros quadrados. Mais uma vez, a bioluminescência confirmou os achados do ultrassom com níveis de radiância aumentados de 10 a nove.
A ultrassonografia 3D do tumor mostrou um volume superior a 100 milímetros cúbicos, a linha de base que nosso laboratório utiliza para o início de ensaios terapêuticos pré-clínicos. O tumor excisado mediu macroscopicamente mais de um centímetro de tamanho, correlacionando-se com medidas de ultrassom e sinais de luminescência. Esta mídia fornece demonstração de como estabelecer com sucesso xenógrafos ortotópicos adrenais com células de neuroblastoma derivadas do paciente, utilizando orientação por ultrassom.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de 12 minutos por injeção, se for realizada corretamente.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para injeção guiada por ultrassonografia de células de neuroblastoma e sarcoma de Ewing em modelos murinos. Esta técnica tem como objetivo estabelecer modelos pré-clínicos confiáveis de câncer que reflitam o microambiente tumoral nativo.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Pesquisa Pré-clínica
Antecedentes
- Células tumorais derivadas de pacientes fornecem um modelo mais preciso para o estudo do câncer.
- Xenografias ortotópicas são essenciais para compreender o comportamento tumoral em um contexto nativo.
- A orientação por ultrassom permite injeção precisa sem cirurgia invasiva.
- Este método pode aumentar a confiabilidade de estudos pré-clínicos.
Objetivo do Estudo
- Criar modelos de câncer biologicamente relevantes para pesquisa.
- Investigar a evolução tumoral e as respostas terapêuticas.
- Facilitar a descoberta de fármacos por meio de modelos pré-clínicos aprimorados.
Métodos Utilizados
- Injeção guiada por ultrassom de células de neuroblastoma.
- Injeção na glândula adrenal de camundongos.
- Uso de células tumorais derivadas de pacientes.
- Técnica não invasiva para minimizar o tempo de recuperação.
Resultados Principais
- Estabelecimento bem-sucedido de xenografias ortotópicas.
- Comprovada eficiência e confiabilidade do método.
- Fornecimento de informações sobre o comportamento tumoral em um microambiente nativo.
- Facilitação de estudos adicionais sobre respostas terapêuticas e metástase.
Conclusões
- O método de injeção guiado por ultrassom é eficaz para a pesquisa de câncer.
- Modelos derivados de pacientes melhoram a relevância dos estudos pré-clínicos.
- Essa técnica pode auxiliar significativamente os esforços de descoberta de fármacos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de xenografias de tumores metastáticos biologicamente relevantes utilizando implante celular direcionado por tecido e guiado por ultrassom aborda uma lacuna crítica nos modelos pré-clínicos de oncologia, permitindo a recapitulação precisa dos microambientes tumorais e do comportamento metastático. Essa abordagem minimamente invasiva aumenta a confiabilidade preditiva para estudos de resposta terapêutica e metástase, apoiando decisões de portfólio ajustadas ao risco no descobrimento de fármacos oncológicos. A reprodutibilidade e a adequação translacional do método o posicionam como um ativo estratégico para pipelines de P&D empresariais que buscam reduzir os riscos associados a ativos oncológicos em estágios iniciais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em um microambiente tumoral nativo.
- Apóia a validação funcional de alvos ao modelar a disseminação metastática e a evolução tumoral.
- Melhora a confiança preditiva na seleção de candidatos e na triagem de portfólios.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Facilita a preparação de modelos de xenotransplante ortotópico validados para testes de eficácia posteriores.
- Fornece leituras reprodutíveis e quantitativas de crescimento tumoral e metástase por meio de ultrassonografia e imagem de bioluminescência.
- Permite o estabelecimento escalonável e minimamente invasivo de modelos para avaliação de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos pré-clínicos à biologia da doença humana utilizando células derivadas de pacientes e implantação em tecidos específicos.
- Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo avaliação longitudinal da progressão tumoral e da resposta terapêutica.
- Reduz o risco translacional ao modelar comportamentos metastáticos clinicamente relevantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de xenotransplante guiado por ultrassom se integra ao continuum de descoberta em oncologia, desde a validação inicial de alvos até estudos pré-clínicos de eficácia, permitindo a geração robusta de modelos para identificação de compostos líderes e pesquisas translacionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a redução de riscos mecanicistas ao modelar o crescimento tumoral em contextos teciduais nativos.
- Triagem: Fornece modelos padronizados e reprodutíveis com saídas quantitativas de imagem para triagem de compostos.
- Análises: Fornece medições longitudinais de tamanho tumoral e bioluminescência para comparar condições terapêuticas.
- Pesquisa Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao permitir sistemas de modelos derivados de pacientes e relevantes para a doença.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma adaptável a múltiplos tipos de câncer e fontes celulares para ampla utilidade em P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em modelos de oncologia.
- Valor Operacional: Padroniza e simplifica o estabelecimento de modelos com mínima morbidade animal e recuperação rápida.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao aumentar a relevância do modelo.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos em oncologia com base em dados alinhados à translação clínica.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em imagem por ultrassom e técnicas cirúrgicas em pequenos animais.
- Requer acesso a plataformas de imagem, kits de dissociação celular e infraestrutura para análise de bioluminescência.
- Exige padronização entre equipes para reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Adaptável a diversos tipos de câncer e linhagens celulares estabelecidas ou derivadas de pacientes.
- Limitado pela necessidade de treinamento especializado e equipamentos de imagem para implante e monitoramento precisos.
