Microscopia de dois fótons para estudar a atração do processo microglial em direção a um composto em uma fatia de cérebro de camundongo

Coloque uma fatia de cérebro de camundongo em uma câmara de perfusão contendo aCSF sob um microscópio de dois fótons.

O camundongo é geneticamente modificado para expressar GFP na microglia, permitindo o rastreamento do movimento microglial.

Prenda a fatia com um suporte.

Usando iluminação de campo claro, localize a região de interesse.

Mude para iluminação de fluorescência para visualizar a micróglia.

Encha uma micropipeta com o composto de teste, monte-a em um suporte de seringa e abaixe-a para tocar a fatia.

Ative o modo de imagem de dois fótons, focalizando a luz infravermelha próxima de baixa energia no tecido.

No ponto focal do laser, dois fótons combinam sua energia para excitar a GFP, emitindo fluorescência.

Capture imagens em vários planos Z para focar nos processos microgliais.

Registre a atividade da linha de base, injete o composto e continue gravando.

O composto se liga aos receptores microgliais, desencadeando vias de sinalização que impulsionam a extensão do processo microglial em direção à fonte do composto.

Monitore o aumento da fluorescência perto do local da injeção ao longo do tempo para rastrear o movimento.

30 minutos antes de iniciar a gravação, conecte a bomba peristáltica a uma câmara de gravação personalizada com perfusão superior e inferior para otimizar a oxigenação e a viabilidade das fatias de tecido e limpe todo o sistema de perfusão com 50 mililitros de água ultrapura. No final do ciclo de limpeza, iniciar a perfusão da câmara de registo com 50 mililitros de aCSF num copo de vidro sob carbogenação constante e utilizar uma pipeta de transferência descartável de boca larga para transferir a primeira fatia a ser fotografada para o copo para remover o papel da lente.

Quando a seção tiver afundado na parte inferior do béquer, transfira a seção para a câmara de registro e posicione o suporte da fatia na fatia para minimizar o movimento induzido pelo fluxo de perfusão. Use a iluminação de campo claro para atingir a região do cérebro de interesse com uma ampliação de 5 a 10 vezes. Em seguida, use uma objetiva de 25 vezes com uma lente de imersão em água de 0.35 vezes para ajustar a posição do campo de visão.

Use a iluminação de fluorescência para localizar as células microgliais fluorescentes e preencha a pipeta com 10 microlitros de aCSF contendo o composto de interesse em sua concentração final. Aponte a ponteira para baixo com uma agitação suave para remover quaisquer bolhas de ar presas na ponteira e monte a pipeta cheia em um porta-pipetas conectado a uma seringa de 5 mililitros, com um êmbolo posicionado na posição de 5 mililitros e montado em um micromanipulador de três eixos.

Abaixe a pipeta suavemente em direção à fatia, controlando e ajustando a objetiva ao mesmo tempo, até que a ponta da pipeta toque levemente a superfície da fatia. Agora sintonize o laser e mude o microscópio para o modo multifóton. Certifique-se de que a câmara esteja protegida de qualquer fonte de luz e ligue os detectores não digitalizados. Defina o ganho e use uma tabela de pesquisa com um limite superior codificado por cores para evitar saturar os pixels na imagem.

Em seguida, comece a gravar por um período total de pelo menos 30 minutos, pressionando lentamente o êmbolo da seringa da posição de 5 para 1 mililitro após cinco minutos durante um período de 5 segundos para aplicar o composto na seção. Para análise de imagem, primeiro execute a projeção Z e a correção de desvio com ImageJ no arquivo de interesse. Em seguida, abra o arquivo modificado no Icy e desenhe uma região circular de 35 micrômetros de diâmetro de interesse centralizada sobre o local da injeção.

Execute o filme novamente com o ROI para garantir que está bem posicionado. Em seguida, use o plug-in Intensity Evolution da região de interesse para medir a intensidade média ao longo do tempo na região de interesse e salve os resultados como um arquivo .xls.