Uma imersão Ensaio: Um protocolo para avaliar Interações entre CNS fagócitos e Neurônios

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar o engolfamento de entradas pré-sinápticas pela microglia. Isso é feito injetando primeiro os traçadores fluorescentes de grau anterior nos olhos para rotular as entradas pré-sinápticas das células ganglionares da retina no núcleo do genante lateral. O segundo passo é dissecar, consertar e equilibrar o cérebro.

Em seguida, o cérebro é seccionado. A etapa final é montar as seções cerebrais em um lábio de cobertura para imagens e análises. Em última análise, a microscopia confocal é usada para avaliar o engolfamento de entradas pré-sinápticas pela microglia.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como como os solos fagocíticos contribuem para a plasticidade e remodelação do circuito sináptico. Embora esse método possa fornecer informações sobre a remodelação do circuito sináptico no cérebro saudável, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a remodelação do circuito sináptico durante a doença do sistema nervoso. Demonstrando o procedimento estarão Chris Heller, um técnico, e Emily Laman, uma estudante de pós-graduação do Laboratório Stevens.

Comece este procedimento anestesiando um camundongo com flúor 4% ISO em uma câmara de indução de plexiglass. Após um a três minutos, certifique-se de que um nível adequado de anestesia seja alcançado beliscando a cauda. Em seguida, coloque o mouse de lado sob o microscópio estéreo e coloque o cone do nariz, que fornece flúor ISO de três a 4% sobre o focinho.

Para expor a esclera, use uma pequena tesoura de mola para abrir a pálpebra e puxar a pele para trás. Para recém-nascidos, às vezes é necessário outro corte perpendicular no canto do olho. Tenha cuidado ao cortar o canto da pálpebra, pois há um vaso sanguíneo.

Use uma agulha estéril de calibre 30,5 para perfurar um pequeno orifício na lateral do olho onde a esclera começa. Tome cuidado para evitar danificar a lente inserindo a agulha apenas o suficiente para que o chanfro entre no olho. Deixe o vítreo fluir para fora do orifício e use um aplicador estéril cortado e com ponta para absorver o líquido.

Assim que o vítreo parar de fluir para fora do orifício, insira lentamente uma agulha de ponta romba presa a uma seringa Hamilton que foi pré-carregada com traçado de grau anterior. Pinte no buraco, injete lentamente o corante no olho. Normalmente, a subunidade beta da toxina da cólera conjugada a Alexa 5 94, 6 47 ou 4 88 é usada para grau anterior.

Traços tardios R Entradas GC Deixe a agulha no orifício durante alguns segundos e depois retire-a lentamente. Use um aplicador com ponta de algodão para absorver o excesso de fluido e evitar que o corante vaze. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de pomada antibiótica no olho.

Se o olho foi aberto cirurgicamente. Reposicione suavemente as pálpebras juntas após a injeção. Deixe o mouse sob uma lâmpada de calor ou em uma almofada térmica até que ele comece a se recuperar da anestesia.

Retorne o mouse para uma gaiola doméstica limpa e monitore-o para garantir que esteja totalmente acordado antes de devolvê-lo à colônia. Cerca de 24 horas após a injeção, sacrifique o camundongo e disseque o cérebro. Fixe o cérebro em um tubo Falcon cheio de 4% de PFA durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte.

Enxágue o cérebro três vezes em PBS, primeiro despejando o cérebro e o PFA em um barco de soro de leite vazio Em seguida, use uma espátula para transferir o cérebro para outro barco de soro de leite cheio de PBS. Lave o cérebro mais duas vezes em PBS antes de transferi-lo para um tubo Falcon cheio de solução de sacarose a 30%. Deixe-o em sacarose a quatro graus Celsius até que afunde no fundo do tubo.

Depois, remova todas as partes do cérebro que não são necessárias com uma lâmina de barbear. Congele o cérebro em um pedaço de papel alumínio sobre gelo seco. Enquanto isso, congele o estágio de micrótomo e encha cada poço de uma placa de 24 poços com meio mililitro de 0,1 molar PP para montar o cérebro congelado no estágio de congelamento.

Aplique uma pequena quantidade de OCT no palco. Assim que a OCT começar a congelar, coloque o cérebro nela. O lado do cérebro que será cortado deve estar voltado para cima.

Em seguida, cubra o cérebro e a OCT com gelo seco picado muito finamente. Deixe o gelo seco no cérebro por cerca de 30 segundos. Em seguida, use um pincel grande para remover o gelo seco.

Comece a seccionar as fatias com 40 mícrons de espessura. Em seguida, use um pequeno pincel úmido para remover as seções contendo a região de interesse da lâmina e transfira-as para a placa de 24 poços contendo 0,1 molar pb. Uma vez que as seções tenham sido coletadas, visualize a rotulagem de grau anterior sob um microscópio de dissecação fluorescente e escolha seções que contenham a região de interesse para montar as seções em uma lâmina.

Primeiro, aplique um pequeno pool de 0,1 molar PB a um microscópio carregado. Deslize em seguida, transfira as seções de tecido para a piscina de pb. Em seguida, use o pincel para orientar e espalhar os lenços.

Use um lenço Kim para remover o XSPB e tome cuidado para evitar que a seção seja absorvida. Deixe-os secar completamente ao ar. Em seguida, aplique uma pequena gota de meio de montagem em cada seção e monte uma lamínula na parte superior na extremidade.

Sele as bordas do slide com esmalte. Armazene a lâmina a menos 20 graus Celsius até a sessão de imagem mostrada. Aqui está um esquema da estratégia de rastreamento de grau anterior.

As entradas RGC do olho esquerdo e direito são rastreadas com CTB 6 47 e CTB 5 94, respectivamente. O engolfamento mediado pela micróglia de entradas é posteriormente avaliado. Aqui está uma imagem representativa e de baixa ampliação do DLGN de camundongo pós-natal do quinto dia após o rastreamento intergrado das entradas dos olhos esquerdo e direito.

Esta é uma microglia amostrada da região da borda das entradas do olho esquerdo e direito. Toda a fluorescência CTB fora do volume microglial foi subtraída, revelando as entradas RGC que foram engolfadas e a renderização da superfície da microglia e engolfada. As entradas RGC são mostradas aqui.

Aqui está a superfície representativa renderizada microglia de P cinco, P nove e P 30 camundongos. DLGN O engolfamento de entradas RGC é significativamente aumentado durante o pico de poda no DLGN versus idades mais avançadas. Microglia de camundongos deficientes no receptor do complemento três engolfam significativamente menos entradas de RGC em comparação com companheiros de ninhada do tipo selvagem Uma vez dominados.

Esta técnica pode ser feita em 72 horas se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como intergrade neurônios de marcação e avaliar as interações das sinapses da microglia.