Imagem latente da Live-pilha fluorescência de completa ciclo vegetativo celular do lento crescimento Social bactéria Myxococcus xanthus

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular bacteriana, como como as células replicam seu DNA, como crescem e como se dividem. A principal vantagem dessa técnica é que as células bacterianas vivas podem ser monitoradas por pelo menos 24 horas ao microscópio e a técnica não requer equipamentos especiais. Embora esse método possa fornecer informações sobre o crescimento e a divisão do Myxococcus xanthus, ele também pode ser facilmente aplicado a outras bactérias de crescimento lento.

Para começar, ressuspenda uma única colônia de M.xanthus em 500 microlitros de CTT a 1%, suplementada com antibióticos, em um tubo estéril e transfira toda a suspensão para um frasco Erlenmeyer de 50 mililitros contendo cinco mililitros de CTT a 1%. Prepare a solução de microscopia de agarose a 1% contendo 0,2% CTT misturando um grama de agarose com 80 mililitros de tampão TPM e 20 mililitros de meio CTT a 1%. Microondas a solução até que a agarose esteja derretida.

Encha uma placa de Petri com aproximadamente 60 mililitros de agarose derretida e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Pré-aqueça a almofada de agarose a 32 graus Celsius por pelo menos 15 minutos antes de usar. Em seguida, coloque uma lamínula de vidro estéril em uma moldura de plástico ou metal que tenha um orifício no meio e, em seguida, use fita adesiva para fixar a lamínula na moldura.

Adicione 10 a 20 microlitros de células M.xanthus cultivadas exponencialmente na lamínula. Para adicionar microesferas fluorescentes como marcadores fiduciais das células, use tampão TPM para diluir as microesferas para 1:100. Agite bem a suspensão do cordão e adicione cinco a 10 microlitros às células.

Da almofada grande e pré-aquecida de 1% de agarose, corte uma pequena almofada aproximadamente do tamanho da lamínula e coloque-a em cima das células. Em seguida, coloque uma lamínula em cima da almofada para evitar a evaporação e manter as células em um ambiente úmido. Incube a amostra de microscopia a 32 graus Celsius por 15 a 20 minutos para permitir que as células se fixem na parte inferior da almofada de agarose antes dos registros de microscopia de lapso de tempo.

Para realizar a microscopia de lapso de tempo, ligue o microscópio e inicie o software de controle do microscópio. Selecione a objetiva correta e os espelhos corretos e filtre para adquirir imagens de contraste de fase, bem como imagens de proteínas verde-fluorescentes, vermelhas-fluorescentes ou amarelas-fluorescentes. Adicione uma gota de óleo de imersão de alta qualidade na lente da objetiva e na parte inferior da amostra pré-incubada a 32 graus Celsius.

Com o lado do orifício voltado para a objetiva, coloque a estrutura de metal com a amostra na platina do microscópio e, em seguida, prenda a amostra firmemente no suporte da platina. Concentre-se nas células movendo o estágio na direção Z para mais perto do objetivo. Quando o óleo na objetiva e a amostra entrarem em contato, mova o estágio na direção X/Y.

Mude para o software Metamorph e abra a ferramenta Adquirir. Selecione Contraste de fase na lista suspensa Configuração e defina o Tempo de exposição para 100 milissegundos. Clique em Mostrar ao vivo, Trazer célula para o plano focal e mova o palco na direção X/Y até que várias células individuais estejam visíveis no campo de visão.

Certifique-se de que pelo menos uma microesfera fluorescente esteja na região de view para alinhar posteriormente as imagens adquiridas. Em seguida, abra o assistente de aquisição multidimensional do software de controle do microscópio para configurar um experimento de lapso de tempo que permite que o microscópio adquira imagens em vários comprimentos de onda e posições de platina, se necessário. Na guia Principal, ative o lapso de tempo e Vários comprimentos de onda.

Guias adicionais aparecerão no lado esquerdo da janela. Clique na guia Salvar e selecione Diretório para selecionar uma pasta vazia no disco rígido do computador para salvar as imagens adquiridas e, em seguida, ative Incrementar nome base se o arquivo existir para garantir que os conjuntos de dados consecutivos não substituam os anteriores. Dê ao experimento um nome com data e o nome da cepa ou título do experimento.

Clique na guia de lapso de tempo para ajustar os parâmetros de lapso de tempo, defina o intervalo de tempo para 20 minutos e defina a duração para 24 horas. O número de pontos de tempo mudará automaticamente. Agora, clique na guia Comprimentos de onda.

Selecione o número de comprimentos de onda a serem adquiridos para cada imagem em cada ponto de tempo, alterando o número. Selecione Permitir posição AF memorizada de hardware separada para cada comprimento de onda. Clique na guia Primeiro comprimento de onda na parte superior.

Na lista suspensa Iluminação, selecione Contraste de fase. Selecione 100 milissegundos para exposição e, na lista suspensa Adquirir, selecione Cada ponto de tempo. Desative a Exposição automática na lista suspensa selecionando Nunca e selecione Todas as aquisições na lista suspensa para Foco automático.

Defina a exposição para cada comprimento de onda conforme demonstrado usando os seguintes parâmetros. Em seguida, para adquirir imagens de várias posições de palco, na guia Principal, ative Várias posições de palco. Clique na guia Palco e clique no botão Ao vivo para ver o campo de visão.

Mova o palco na direção X/Y até que um ROI esteja no campo de visão. Salve as coordenadas X e Y na guia Palco clicando no sinal de mais. Mova o palco novamente na direção X/Y até que um novo ROI seja encontrado e salve as coordenadas novamente clicando no sinal de mais.

Continue até que o número desejado de regiões seja salvo. Verifique mais uma vez se as células estão em foco clicando nas diferentes posições X e Y salvas e inicie o foco automático do hardware clicando em AFC hold para manter a posição Z salva constante ao longo do experimento. Inicie o registro de lapso de tempo no assistente de aquisição multidimensional do software de controle do microscópio clicando em Adquirir.

Verifique se as células ainda estão em foco após os primeiros pontos de tempo nas gravações de lapso de tempo para maximizar a qualidade das imagens e refocar, se necessário. Para gerar filmes time-lapse e realizar o alinhamento da imagem, inicie o software de análise e processamento de imagem. Abra as imagens como uma pilha clicando em Revisar dados multidimensionais, Selecionar arquivo base, Selecionar diretório e abra a pasta com os dados multidimensionais.

Verifique o conjunto de dados e clique em Exibir. O conjunto de dados será mostrado como imagens únicas do Ponto de Tempo Um até o final. Ative o comprimento de onda para criar uma pilha, selecione todas as imagens que devem estar na pilha e clique em Carregar imagens.

Repita esta etapa para todos os comprimentos de onda e salve as pilhas concluídas. Ative a pilha de imagens que precisa ser corrigida para desvios. Abra a ferramenta de alinhamento usando Aplicativos, Alinhamento automático.

Marque Pilha como a origem das imagens e Primeiro plano/Ponto de tempo como o plano de referência, selecione a pilha com o botão Pilha de origem e clique em Aplicar. Quando o alinhamento automático estiver concluído, salve a pilha alinhada. Para gerar um filme nos formatos MOV ou AVI, abra a função Make Movie via Stack, Make Movie.

Selecione as gravações de lapso de tempo com o botão Source Stack, selecione o formato de saída, a taxa de quadros, o número de quadros e clique em Salvar. Neste experimento de lapso de tempo com células móveis do tipo selvagem DK1622, as imagens de contraste de fase foram adquiridas a cada cinco minutos por 24 horas. Como esperado, as células eram móveis e predominantemente movidas em grupos.

Na imagem de células vivas de contraste de fase com células Delta-mgIA não móveis, o crescimento e a divisão de células individuais foram acompanhados durante a formação da microcolônia. Quando as imagens foram adquiridas a cada cinco minutos por 24 horas, foi possível quantificar o tempo de interdivisão de 235 mais ou menos 50 minutos na resolução de célula única. Para investigar se as células crescem normalmente enquanto rastreiam proteínas marcadas com yfp por longos períodos, as células de M. xanthus expressando ParB-YFP foram rastreadas.

ParB-YFP inicialmente formou um único aglomerado na região da célula subpolar. Pouco antes ou depois da divisão celular, o aglomerado se duplicou, com um aglomerado permanecendo no pólo celular antigo e o segundo translocando para o novo pólo celular. Neste experimento, células imóveis expressando FtsZ-gfp mostraram forte acúmulo de FtsZ-gfp na célula média, o que dita a posição da divisão celular.

FtsZ-gfp formou um aglomerado na célula média, predominantemente em células mais longas. Duas horas após a divisão celular, FtsZ-gfp se acumulou na célula média nas células-filhas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita rotineiramente em Myxococcus xanthus, bem como em qualquer outra bactéria de crescimento lento.

Ao configurar este procedimento para uma bactéria, é importante ajustar a composição do meio de crescimento na placa de ágar para atender aos requisitos específicos de crescimento dessa bactéria. Para qualquer bactéria, é importante determinar as condições ideais de imagem, como tempo de exposição, intensidade da luz e frequência de imagem, para evitar fototoxicidade. Além disso, para qualquer proteína marcada com fluorescência, as condições de imagem precisam ser ajustadas para evitar fototoxicidade e também fotobranqueamento.