A longo prazo no Vivo controle da dinâmica celular inflamatória dentro drosófila pupas

Ao explorar o potencial de imagem de longo prazo deste novo modelo de pupa, juntamente com a tratabilidade genética da Drosophila, este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave nos campos de cicatrização de feridas e imunidade inata. O estágio de pupa oferece algumas vantagens distintas para imagens ao vivo em relação aos modelos mais tradicionais de cicatrização de feridas de Drosophila. Por exemplo, as pupas podem ser visualizadas em períodos de tempo muito mais longos, mais área de tecido está disponível para manipulação experimental e mais hemócitos estão presentes neste estágio.

Além disso, a eficiência da inativação do gene mediada por RNAi é consideravelmente melhorada durante esses estágios de pupa, permitindo que muitos genes sejam derrubados de maneira específica do tecido ou do tempo. Para montar a coleção de pupas, instale frascos com 20 fêmeas virgens e 20 machos. Em seguida, 18 horas antes da sessão de imagem, colete pelo menos 10 pré-pupas brancas recém-formadas dos frascos.

Para coletar uma pupa, use uma pinça ou um pincel fino para desalojá-la da superfície interna do frasco e transfira-a cuidadosamente para o lado de um novo frasco para moscas. Depois que as pupas se desenvolverem até o ponto de tempo desejado, transfira-as para um pedaço de fita adesiva dupla face montada em uma lâmina de vidro. Agora, sob um microscópio de dissecção de campo claro, remova cuidadosamente as pupas de seus invólucros.

Posicione as pupas de forma que seus lados ventrais fiquem firmemente presos à fita. Faça a primeira incisão na região mais anterior do pupário usando a pinça. Certifique-se de que a caixa de pupa nesta área seja oca e desprovida de tecido pupal, pois as pupas terão encolhido dentro da caixa durante o desenvolvimento inicial da pupa.

Em seguida, rasgue ou corte cuidadosamente a caixa da pupa aberta na direção anterior para posterior usando uma pinça ou microtesoura até que a pupa esteja completamente livre do invólucro marrom opaco e quebradiço. Tenha cuidado, essas pupas são muito frágeis. Agora é crucial que a pinça e a microtesoura não perfurem a superfície da pupa durante esta etapa.

Tente evitar tocar na própria pupa ao remover a caixa ao redor. Agora monte as pupas não danificadas em um prato com fundo de vidro usando cola de heptano. Primeiro deposite uma linha de cola de heptano preparada a partir de uma alíquota de 10 microlitros.

Então, após cinco segundos de secagem, use uma pinça para transferir cuidadosamente as pupas dissecadas para a cola. Ao aprender, alinhe até cinco pupas. Mais pode ser preparado com a experiência adquirida.

Role as pupas usando uma pinça para montá-las de forma que a asa fique plana na lamínula com a maior parte da superfície da asa em contato direto com a lamínula. Por fim, para evitar a desidratação, adicione um pedaço de papel de filtro absorvente embebido em água destilada na lateral do prato com fundo de vidro. Em seguida, cubra o prato e prossiga com o procedimento de ferimento induzido por laser.

Transfira as pupas montadas para um microscópio de campo amplo equipado com um sistema de ablação a laser ajustável. Ajuste o laser de ablação pulsado UV refrigerado a ar e bombeado por nitrogênio para o comprimento de onda desejado usando a célula de corante apropriada. Para uma ferida ideal, defina a taxa de repetição de pulso para 40 hertz.

Agora, usando objetivas 40 ou 63 vezes e campo claro, ajuste os controles do estágio do microscópio para localizar a asa da pupa da primeira pupa a ser ferida. Concentre-se no plano do epitélio da asa de pupa mais próximo da lamínula de vidro. Alinhe a área a ser ferida com a área-alvo conhecida do laser de ablação.

Para fazer isso, aproveite o marcador de mira dentro da ocular do microscópio. Em seguida, ajuste a potência do laser ajustando a lâmina do atenuador de densidade de energia no microscópio. Aproveite as paradas de clique para tornar a configuração reproduzível.

Agora, para fazer uma ferida, ative o laser de ablação com um clique rápido de controle manual. Em seguida, verifique o aparecimento da bolha de ar transitória no local da ablação, o que é normal com ferimentos. Se o ferimento não for bem-sucedido, tente variar o plano focal.

Como alternativa, aumente gradualmente a potência do laser usando a lâmina do atenuador até atingir os tamanhos de ferida desejados. Depois de ferir as margens da asa da pupa, transfira rapidamente o prato com fundo de vidro para um microscópio apropriado para imagens de lapso de tempo. Em seguida, abra o software de captura de imagem apropriado.

No software, ligue os lasers apropriados e ajuste sua potência e ganho/deslocamento para obter sinal fluorescente suficiente sem saturação de pixels. Geralmente, a menor potência de laser possível na faixa de cinco a 20% funciona melhor para minimizar o fotobranqueamento. Concentre-se em toda a asa da pupa sob baixa ampliação ou concentre-se na ferida sob alta ampliação para investigar o reparo da ferida.

Para capturar o epitélio reparador e o recrutamento de células inflamatórias, primeiro configure o microscópio para registrar uma pilha z usando o ajuste de foco fino no painel de controle. Escaneie do epitélio ferido até o espaço extracelular abaixo contendo hemócitos migratórios. Em seguida, configure o software para registrar fatias z através da asa da pupa a cada três mícrons ou em intervalos ainda mais apertados.

Para imagens de lapso de tempo, registre z-stacks pelo menos a cada 30 segundos por pelo menos uma hora. Ao usar as sondas fotoconversíveis para fotoconverter e rotular seletivamente um subconjunto de células durante a geração de imagens, abra os módulos apropriados no software de imagem para realizar a conversão de fotos e ativar o laser de 405 nanômetros. Em seguida, selecione as células a serem fotoconvertidas no software FRAP usando uma ferramenta de seleção.

Em seguida, defina o curso de tempo para a conversão de fotos para um único quadro de iteração e defina o laser de 405 nanômetros para 20% de potência do laser. Em seguida, clique em Iniciar o experimento para realizar a conversão de fotos. Depois de concluído, saia do módulo FRAP e retorne à tela de imagem original.

Lá, sintonize os lasers com os fluoróforos em uso e obtenha imagens das células fotoconvertidas e não fotoconvertidas usando gravações de lapso de tempo. As asas feridas das pupas de Drosophila 18 horas após a formação do pupário foram fotografadas usando microscopia de lapso de tempo confocal. A lesão induzida por laser no epitélio da asa da pupa estimulou uma rápida migração de células imunes inatas de Drosophila chamadas hemócitos para o local da ferida.

Os hemócitos foram marcados com um marcador nuclear e um marcador citoplasmático ou citoesquelético para permitir o rastreamento e a visualização de sua morfologia, respectivamente. O rastreamento das trajetórias nucleares dos hemócitos demonstra a complexa dinâmica espaço-temporal da resposta inflamatória. Dentro de 30 minutos após a ferida, os hemócitos localizados mais próximos do local da lesão começaram a migração direcionada para a ferida.

Eventualmente, os hemócitos localizados progressivamente mais distantes da lesão começam a migrar em direção à ferida. Ao utilizar o fluorophor fotoconversível, as subpopulações Kaede desses hemócitos de asas migratórias foram rotuladas seletivamente. Este método tem sido usado para mostrar que os hemócitos recrutados para uma ferida inicial são temporariamente dessensibilizados para uma segunda ferida gerada 90 minutos depois.

Ao rotular a E-caderina nas junções aderentes celulares com GFP, a borda da ferida é facilmente identificável e isso permite a análise da dinâmica de cicatrização de feridas. A maioria das feridas começa a reepitelizar dentro de uma hora após a lesão. A borda da ferida avança para dentro e as feridas cicatrizam em três horas.

Uma vez que essa técnica tenha sido dominada, várias pupas podem ser preparadas para imagens ao vivo em apenas 10 minutos, mas ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que, uma vez dissecadas de seu caso de pupa, as pupas de Drosophila são extremamente vulneráveis a danos e desidratação. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores no campo da imunidade inata colaborassem com biólogos computacionais e aplicassem modelagem matemática mais sofisticada para explorar o comportamento dos sinais atrativos de feridas responsáveis pelo recrutamento de células inflamatórias. E ainda mais recentemente, tipos de células alternativas também foram rotulados para seguir sua resposta a lesões induzidas por laser e isso revelou que as células dos adipócitos, as células do corpo adiposo da Drosophila, também respondem a feridas dentro desse sistema.