Name: A longo prazo no Vivo controle da dinâmica celular inflamatória dentro drosófila pupas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprenda a realizar imagens de longo prazo da resposta inflamatória em pupas de Drosophila. Este método permite rastrear hemócitos em tempo real e estudar a cicatrização de feridas e imunidade inata.

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Gostaríamos de agradecer aos membros do Martin, Nobes, Richardson e laboratórios de madeira para discussão útil. Agradecemos também a facilidade de Bioimaging Wolfson (Universidade de Bristol, UK), o centro de estoque de Bloomington (Universidade de Indiana, EUA) e Viena Drosophila Resource Centre (para estoques de Drosophila ) e Flybase (para até à data da drosófila anotação de gene). Este trabalho foi apoiado por uma concessão do projeto MRC-horas e W.W. (Sr/J002577/1), um Wellcome Trust Senior Fellowship para W.W. e um Wellcome Trust Investigator Award-horas.

Este protocolo é composto por quatro principais etapas sequenciais: (1) preparação de estoques de Drosophila e encenação de pupas de Drosophila , (2) dissecação Pupal e montagem, ferindo Pupal (3), (4) na vivo imagiologia confocal lapso de tempo.
1. preparação de estoques de Drosophila e encenação de pupas
<ol><li>Obter o apropriado estoques de Drosophila (ver Tabela de materiaise introdução).</li>
	<li>Recolha o jovens saudáveis moscas adultas do genótipo adequado.<ol>
<li>Selecione adulto voa usando almofadas de gás de dióxido de carbono para anestesiar brevemente as moscas e um pincel fino para transferir voa do genótipo apropriado ou gênero para um frasco de recolha.</li>
		<li>Adicionar 20 virgens fêmeas e 20 machos para cada frasco contendo mídia padrão alimentar voar (uma mistura de farinha de milho-melaço-agar, consulte Tabela de materiais) suplementado com fermento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para a geração de pupa ideal, ponta do adulto voa diariamente sobre novos alimentos em frascos de frescos, mantendo todos os frascos a 25 ° C. Nota: Se o sistema de Gal4-UAS31 está sendo usada para dirigir a expressão gênica de linhagem específica, todas as etapas devem ser executadas a 25 ° C ou acima, como o sistema de Gal4-UAS é sensível à temperatura.</li>
	<li>18 h antes da sessão de imagem programada, selecione pelo menos 10 recém-formado brancos pré-pupas (figura 1A) os frascos (ou seja, 0 h depois da formação do casulo, APF) usando fórceps ou um pincel fino para desalojar pupas da superfície interior do frasco e pupas de transferência com cuidado ao lado de um frasco de plástico limpo, vazio. Nota: Errante 3rd ínstar larvas rastejam para cima fora o meio comida submeter-se a pupa; recém-formado pré-pupa branca é facilmente identificadas como eles possuem sempre espiráculos anteriores e são estacionários (ao contrário de 3rd ínstar larvas). A cutícula transforma-se o 'casulo' (no caso de pupa) que é inicialmente suave e branca17. Deve ter cuidado para não danificar as pupas, pois isso pode levar não só a uma resposta inflamatória induzida por lesão indesejada, mas também para um atraso significativo no desenvolvimento.</li>
	<li>Idade as pupas selecionadas para a fase do desenvolvimento apropriada (18 h APF dará resultados optimal) no frasco a 25 ° C. Nota: Como as pupas desenvolvem-se, no caso de pupa se tornará progressivamente mais escura e mais frágeis.</li>
	<li>Prepare outros reagentes para a próxima etapa antes do tempo. Para fazer o heptano cola, combinar um comprimento de 20 cm de fita dupla-face enrolado com heptano 20 mL em um tubo de centrífuga de 50 mL, sele com a parafina cinema e do rock na temperatura durante a noite no banco.</li>
</ol>2. preparação e dissecção das pupas de Drosophila 
<ol><li>Transferi as pupas de Drosophila encenadas para um pedaço de fita adesiva dupla-face, montado sobre uma lâmina de vidro. Posicione as pupas de modo que o lado ventral é firmemente preso à fita e o lado dorsal é virada para cima (figura 1B). Nota: O anterior da pupa será identificável dos dois espiráculos salientes da extremidade anterior do caso pupal.</li>
	<li>Retire cuidadosamente pupas de sua embalagem protetora casulo sob um microscópio de dissecação brightfield usando fórceps e microtesoura (figura 1B-D).<ol>
<li>Inicialmente, fazer uma incisão na região anterior-a maioria do casulo usando a pinça (figura 1B). Certifique-se de que o caso pupal nesta área é oco e desprovida de tecido pupal, porque as pupas vão ter encolhido dentro o caso durante o desenvolvimento precoce de pupa.</li>
		<li>Após esta incisão inicial, cuidadosamente rasgar ou abrir o caso pupal em um anterior para posterior direção usando fórceps ou micro-tesouras (Figura 1) até que a pupa é completamente grátis do invólucro frágil marrom opaco (Figura 1). Nota: Pupas nesta fase são muito frágeis e deve ter cuidado para evitar perfurar a superfície pupa; punção é óbvia como hemolinfa rapidamente vazamentos para fora do local da punção. Pupas com punções, porém pequenas, devem ser descartadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte as pupas em um prato com fundo de vidro, usando cola de heptano.<ol>
<li>Use uma ponta de pipeta de 20 mL para colocar uma gota 10 mL de cola heptano pré-preparadas (consulte a secção 1.6 acima) em uma linha sobre o prato com fundo de vidro.</li>
		<li>Permitir que a cola secar por 5 s antes de transferir as pupas dissecadas cuidadosamente sobre a colagem de heptano usando fórceps (Figura 1E).</li>
		<li>Para facilidade de ferimento e de imagem, alinhe as pupas seguidas; aproximadamente 5 pupas são sugeridas, mas existirá mais gerenciável com experiência. Nota: O uso de cola de heptano é recomendado quando usando sistemas de imagem vertical mas não é necessário quando se utiliza um sistema invertido. Se a cola cria ótica aberrações durante pupas de imagem, podem ser colocadas diretamente sobre a lamela em vez disso – a adesão natural entre o tecido pupal e vidro será suficiente na maioria dos casos para tratamento de imagens estável, enquanto cuidado ao mover a imagem prato entre microscópios.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para melhores resultados, monte as pupas de modo que a asa é plana sobre a lamela com a maioria da superfície da asa, em contato direto com a lamela (Figura 1F). Role as pupas usando fórceps para mudar sua posição para garantir que a ala está montada corretamente.</li>
	<li>Para evitar a desidratação da amostra durante o período de geração de imagens, adicione um pedaço de papel de filtro absorvente embebido em água destilada para o lado do prato com fundo de vidro no final da montagem, tomando cuidado para não perturbar as pupas (Figura 1E). Cubra o prato com uma tampa. Nota: Pupas estão agora prontas para ferir e imagem.</li>
</ol>3. induzida por laser ferindo de Drosophila asas Pupal
<ol><li>Transferi o prato com fundo de vidro contendo as pupas montadas a um microscópio de campo amplo, equipado com um sistema de ablação do laser sintonizável.<ol>
<li>Uso de um laser pulsado-UV refrigerado a ar nitrogênio-bombeado ablação sintonizado com 435 nm – consulte Tabela de materiais para detalhes11; o comprimento de onda preciso da luz usado para a iluminação é selecionado pelo usuário através de uma célula de corante apropriado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando brightfield óptica, ajuste os controles de fase de microscópio para localizar a ala pupal da pupa primeiro ser ferido (Figura 1F).</li>
	<li>Para obter melhores resultados, use uma lente de objetiva de imersão 40 X ou 63 X óleo para ambas as imagens e laser ablação; Certifique-se de que o líquido de imersão usado (óleo ou glicerol) é consistente entre sistemas de imagem e ablação. Ajustar o microscópio para se concentrar no avião do epitélio pupal asa mais próximo a lamela de vidro (ou seja, o foco sobre a região do epitélio estar ferido) usando o botão de controle de foco fino.</li>
	<li>Usando os ajustes de fase de microscópio, posicione a pupa asa para que a área a ser ferido é alinhada diretamente com a área de alvo conhecido do laser ablação.</li>
	<li>Use um slide de atenuador de densidade de energia cabido para o microscópio para ajustar manualmente o nível de potência da luz ablação. Nota: O controle deslizante atenuador tem clique paradas e decisões para identificar o nível relativo de atenuação e permitir o uso de configurações pode ser reproduzidos.</li>
	<li>Usando um controle manual externa gatilho , ative o laser ablação usando um único clique breve do gatilho para fazer uma ferida. Lá pelo aparecimento da bolha de ar transitória no local da ablação desde ferindo normalmente será acompanhado. Verifique se o ferimento induzida por laser tem sido bem sucedido usando os filtros fluorescentes apropriados para visualizar o epitélio pupal. Nota: tenha cuidado para evitar a exposição acidental para os raios laser como as reflexões do feixe podem causar graves ou danos de pele.</li>
	<li>Se o ferimento não for bem sucedida, variar o plano focal (movendo o foco do microscópio ligeiramente acima ou abaixo do nível atual de focal) e repetir o único clique de gatilho a ablação. Alternativamente, gradualmente aumente a potência do laser usando o slide atenuador até o tamanho da ferida desejada seja alcançado.</li>
	<li>Para variar a taxa de repetição do pulso de laser ablação, utilize o botão de taxa de repetição do painel traseiro (que altera a taxa de pulso de menos de 1/s até 60 Hz). Para ferindo ideal, defina a taxa de repetição de pulso de 40 Hz.</li>
	<li>Para gerar feridas de tamanhos diferentes, use o slide de atenuador de densidade de energia para ajustar manualmente o nível de potência da luz ablação.</li>
	<li>Abster-se de todas as pupas montadas ferindo e usar estes pupas não retirado como controles intacta.</li>
	<li>Para resultados consistentes, realinhe regularmente o sistema de ablação (usando o manual de instruções relevante). Também, limpe e volte a encher a célula de ressonador de tintura que controla o comprimento de onda de saída do laser.</li>
</ol>4. in Vivo imagiologia Confocal lapso de tempo
<ol><li>Transfira rapidamente o prato com fundo de vidro para um microscópio apropriado para a imagem latente de lapso de tempo. Nota: Para obter melhores resultados, use uma alta especificação confocal ou microscópio de disco girando equipados com detectores sensíveis que podem detectar fluorophores tanto GFP e mCherry.</li>
	<li>Para a ala pupal de imagem, use uma lente objetiva de baixa ampliação (por exemplo, 20 X) (Figura 2A). Em ordem para a reparação de imagem ferida e a resposta inflamatória que acompanha com alta resolução espacial, use a imersão de óleo 40 X (at 1.3) ou 63 X lentes de objetivas (at 1.4) (ver imagens representativas na Figura 2B-D).</li>
	<li>Abra o software de captura de imagem apropriado associado com o microscópio.</li>
	<li>Usando o software de captura de imagem, ligue o laser adequado , por exemplo, a 488 nm e 561 lasers de nm para visualizar fluorophores GFP e mCherry, respectivamente (clicando nas caixas pertinentes) e ajustar a potência do laser e ganho/deslocamento configurações para dar suficiente sinal fluorescente, evitando a saturação do pixel; Use o poder do laser possível menor (na faixa 5-20%) para minimizar fotobranqueamento e fototoxicidade.</li>
	<li>Para capturar os dois a reparação epitélio e recrutamento de células inflamatórias, definir o microscópio para gravar uma z-pilha usando os botões de ajuste de foco fino no painel de controle; para obter melhores resultados, definir o software (usando cliques de botão manuais) para registro z-corta a asa pupal (mínimo de 3 mm cada), da parte superior do epitélio ferido através para o espaço extracelular abaixo (contendo migrando hemócitos) para alcançar um grande z-pilha (na faixa de 50-100 mm).</li>
	<li>Para a imagem latente de lapso de tempo, gravar z-pilhas em intervalos de tempo regulares (mínimo cada 30 s) pelo menos 1 h pós-ferindo. Nota: O intervalo de tempo exato entre z-pilhas escolhido representa um trade-off entre capturar a dinâmica celular rápida mutação e evitando foto-branqueamento das amostras.</li>
	<li>Para simultaneamente múltiplos pupas (incluindo controles intacta não retirado) de imagem, use um palco motorizado (anexada ao microscópio) e o recurso de multi-posição aquisição disponível dentro do software da imagem latente. Definir manualmente a posição de cada pupa individual dentro do software usando os botões de controle de posição de palco e defina manualmente os limites de z-pilha apropriada (superior e inferior) para cada individual crisálidas.</li>
	<li>Visualize as imagens de lapso de tempo durante a captura de imagem, ou mais tarde, com software de análise de imagem de especialista (como ImageJ32) usando projeções z-pilha ou renderização 3D. Por exemplo, para acompanhar os movimentos de hemócitos individuais (como na Figura 2' e D'), faixa hematócito núcleos usando o acesso aberto ImageJ plug-ins "TrackMate" ou "Controle Manual" (métodos publicados em 33, 34).</li>
	<li>Usar sondas de photoconvertible (como Kaede30) para seletivamente photoconvert e rotular um subconjunto de células epiteliais ou imunes durante a imagem latente.<ol>
<li>Abrir os módulos apropriados dentro do software de imagem para executar o photoconversion (tais como o FRAP, recuperação de fluorescência após o clareamento foto módulo) e ativar a 405nm laser (clicando na caixa de software relevantes)35.</li>
		<li>Selecione as células para ser photoconverted dentro do software FRAP usando a ferramenta Seleção quadrada, circular ou freehand. Dentro do software FRAP, defina o tempo-curso para photoconversion (branqueamento) para um único iteração/quadro e 405 nm laser no poder do laser de 20%. Manualmente, clique em iniciar o experimento para executar photoconversion.</li>
		<li>Sair o módulo FRAP (clique perto) e retornar para a tela de imagem original dentro do software; uso o 488 nm e 561 lasers de nm para o comportamento de células photoconverted e não-photoconverted de imagem, definindo uma z-pilha e gravação de lapso de tempo, como acima. Nota: Photoconverted sondas permanecem estáveis por muitas horas após o photoconversion inicial, permitindo que o comportamento das células photoconverted para ser seguido ao longo do tempo (pelo menos 5 h). Por exemplo, células inflamatórias na ferida podem ser seletivamente photoconverted (Figura 2F) e seu comportamento seguido como eles determinação do local da lesão (Figura 2 e H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+metabolism+in+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration.</a> Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).</li>
<li>Crusz, S. M., Balkwill, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cancer%3A+advances+and+new+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cancer: advances and new agents.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).</li>
<li>Martin, P., Nunan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+repair+in+acute+and+chronic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 370-378 (2015).</li>
<li>Razzell, W., Wood, W., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swatting+flies%3A+modelling+wound+healing+and+inflammation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+and+Mechanism%22%5BJournal%5D)">Swatting flies: modelling wound healing and inflammation in Drosophila.</a> Disease Model and Mechanism. 4 (5), 569-574 (2011).</li>
<li>Wood, W., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Functions+in+Tissue+Patterning+and+Disease%3A+New+Insights+from+the+Fly%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophage Functions in Tissue Patterning and Disease: New Insights from the Fly.</a> Development Cell. 40 (3), 221-233 (2017).</li>
<li>Mohr, S. E., Smith, J. A., Shamu, C. E., Neumüller, R. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+comes+of+age%3A+improved+techniques+and+complementary+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 591-600 (2014).</li>
<li>Muñoz-Soriano, V., López-Domenech, S., Paricio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+mammalian+wound-healing+researchers+may+wish+to+turn+to+Drosophila+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Why mammalian wound-healing researchers may wish to turn to Drosophila as a model.</a> Experimental Dermatology. 23 (8), 538-542 (2014).</li>
<li>Weavers, H., Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+Buzz+about+Macrophages%3A+The+Fly+as+an+In+Vivo+Model+for+Studying+Immune+Cell+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Creating a Buzz about Macrophages: The Fly as an In Vivo Model for Studying Immune Cell Behavior.</a> Developmental Cell. 38 (2), 129-132 (2016).</li>
<li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> Journal of Cell Biology. 168 (4), 567-573 (2005).</li>
<li>Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+regulate+hemocyte+chemotaxis+during+development+and+wound+healing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biolog%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Cell Biolog. 173 (3), 405-416 (2006).</li>
<li>Razzell, W., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+flashes+orchestrate+the+wound+inflammatory+response+through+DUOX+activation+and+hydrogen+peroxide+release%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium flashes orchestrate the wound inflammatory response through DUOX activation and hydrogen peroxide release.</a> Current Biology. 23 (5), 424-429 (2013).</li>
<li>Weavers, H., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corpse+Engulfment+Generates+a+Molecular+Memory+that+Primes+the+Macrophage+Inflammatory+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Corpse Engulfment Generates a Molecular Memory that Primes the Macrophage Inflammatory Response.</a> Cell. , (2016).</li>
<li>Stramer, B., Winfield, M., Shaw, T., Millard, T. H., Woolner, S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+induction+following+wounding+of+wild-type+versus+macrophage-deficient+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Gene induction following wounding of wild-type versus macrophage-deficient Drosophila embryos.</a> EMBO Reports. 9 (5), 465-471 (2008).</li>
<li>Matsubayashi, Y., Coulson-Gilmer, C., Millard, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis-dependent+coordination+of+multiple+actin+regulators+is+required+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Bioliogy%22%5BJournal%5D)">Endocytosis-dependent coordination of multiple actin regulators is required for wound healing.</a> Journal of Cell Bioliogy. 210 (3), 419-433 (2015).</li>
<li>Evans, I. R., Rodrigues, F. S. L. M., Armitage, E. L., Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draper%2FCED-1+Mediates+an+Ancient+Damage+Response+to+Control+Inflammatory+Blood+Cell+Migration+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Draper/CED-1 Mediates an Ancient Damage Response to Control Inflammatory Blood Cell Migration In Vivo.</a> Current Biology. 25 (12), 1606-1612 (2015).</li>
<li>Zanet, J., Stramer, B., Millard, T., Martin, P., Payre, F., Plaza, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin+is+required+for+blood+cell+migration+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fascin is required for blood cell migration during Drosophila embryogenesis.</a> Development. 136 (15), 2557-2565 (2009).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6802923">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Ninov, N., Martín-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+epidermal+morphogenesis+during+the+development+of+the+adult+abdominal+epidermis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3074-3080 (2007).</li>
<li>Gho, M., Bellaïche, Y., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+Drosophila+microchaete+lineage%3A+a+novel+intrinsically+asymmetric+cell+division+generates+a+glial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell.</a> Development. 126 (16), 3573-3584 (1999).</li>
<li>Puah, W. C., Wasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+muscles+in+Drosophila+metamorphosis%3A+Towards+high-throughput+gene+identification+and+function+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis.</a> Methods. 96, 103-117 (2016).</li>
<li>Berh, D., Scherzinger, A., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C., Risse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+non-invasive+heartbeat+quantification+of+Drosophila+pupae%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Automatic non-invasive heartbeat quantification of Drosophila pupae.</a> Computers in Biology and Medicine. 93, 189-199 (2018).</li>
<li>Sander, M., Squarr, A. J., Risse, B., Jiang, X., Bogdan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+pupal+macrophages--a+versatile+tool+for+combined+ex+vivo+and+in+vivo+imaging+of+actin+dynamics+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila pupal macrophages--a versatile tool for combined ex vivo and in vivo imaging of actin dynamics at high resolution.</a> European Journal of Cell Biology. 92 (10-11), 349-354 (2013).</li>
<li>Weavers, H., Liepe, J., Sim, A., Wood, W., Martin, P., Stumpf, M. P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+Analysis+of+the+Dynamic+Inflammatory+Response+to+Tissue+Damage+Reveals+Spatiotemporal+Properties+of+the+Wound+Attractant+Gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient.</a> Current Biology. 26 (15), 1975-1989 (2016).</li>
<li>Fristrom, D., Wilcox, M., Fristrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+PS+integrins%2C+laminin+A+and+F-actin+during+key+stages+in+Drosophila+wing+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The distribution of PS integrins, laminin A and F-actin during key stages in Drosophila wing development.</a> Development. 117 (2), (1993).</li>
<li>Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rørth, P., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PDGF%2FVEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Cell%22%5BJournal%5D)">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Development Cell. 7 (1), 73-84 (2004).</li>
<li>Berg, H. Random Walks in Biology. , Princeton University Press. Available from:
 <a target="_blank" href="http://press.princeton.edu/titles/112.html">http://press.princeton.edu/titles/112.html</a> (1993).</li>
<li>Diehl, H., Ihlefield, H., Schwegler, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDiehl%2C+H+%22Physik+fur+Biologen%22">Physik fur Biologen</a>. , Springer-Verlag. (1991).</li>
<li>Stewart, P. S., McFeters, G. A., Huang, C. T. Biofilm control by antimicrobial agents. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStewart%2C+PS+%22Biofilms+II+Process+Analysis+and+Application%22">Biofilms II Process Analysis and Application</a>. , 373-405 (2000).</li>
<li>Milo, R., Phillips, R. Cell Biology by the Numbers. , Garland Science. Available from:
 <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=9NPRCgAAQBAJ&pgis=1">https://books.google.com/books?id=9NPRCgAAQBAJ&pgis=1</a> (2015).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceeding of National Academy of Science U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Cordelières, F. Manual tracking. National Institutes of Health. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf</a> (2015).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Grueber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134 (1), 55-64 (2007).</li>
<li>Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+regulate+hemocyte+chemotaxis+during+development+and+wound+healing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Cell Biology. 173 (3), 405-416 (2006).</li>
<li>Wood, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+recapitulates+morphogenesis+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos.</a> Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).</li>
<li>Franz, A., Wood, W., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+Body+Cells+Are+Motile+and+Actively+Migrate+to+Wounds+to+Drive+Repair+and+Prevent+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Developmetal+Cell%22%5BJournal%5D)">Fat Body Cells Are Motile and Actively Migrate to Wounds to Drive Repair and Prevent Infection.</a> Developmetal Cell. 44 (4), 460-470 (2018).</li>
<li>del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2012).</li>
<li>Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidization+and+Cell+Fusion+Contribute+to+Wound+Healing+in+the+Adult+Drosophila+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Polyploidization and Cell Fusion Contribute to Wound Healing in the Adult Drosophila Epithelium.</a> Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).</li>
<li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+blood+cells+function+as+a+surveillance+system+for+damaged+tissue+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 105 (29), 10017-10022 (2008).</li>
<li>Galko, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Genetic+Analysis+of+Wound+Healing+in+Drosophila+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular and Genetic Analysis of Wound Healing in Drosophila Larvae.</a> PLoS Biology. 2 (8), e239(2004).</li>
<li>Brock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+Profilin+during+wound+closure+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of Profilin during wound closure in Drosophila larvae.</a> Journal of Cell Science. 125 (23), (2013).</li>
<li>Wu, Y., Brock, A. R., Wang, Y., Fujitani, K., Ueda, R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blood-borne+PDGF%2FVEGF-like+ligand+initiates+wound-induced+epidermal+cell+migration+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A blood-borne PDGF/VEGF-like ligand initiates wound-induced epidermal cell migration in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 19 (17), 1473-1477 (2009).</li>
<li>Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+Larvae+to+Study+Epidermal+Wound+Closure+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila Larvae to Study Epidermal Wound Closure and Inflammation.</a> Methods in Molecular Biology. 1037, 449-461 (2013).</li>
<li>Kakanj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+and+TOR+signal+in+parallel+through+FOXO+and+S6K+to+promote+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insulin and TOR signal in parallel through FOXO and S6K to promote epithelial wound healing.</a> Nature Communications. 7, 12972(2016).</li>
</ol>

Os autores declaram que têm sem concorrentes conflitos de interesses.

A resposta inflamatória aguda ao dano tecidual é um processo complexo e altamente dinâmico que é essencial para orquestrar a reparação dos tecidos feridos, incluindo o apuramento dos detritos necróticos e a luta contra a infecção. Para inteiramente compreender e desvendar os aspectos fundamentais desta resposta, é fundamental que estudos são realizados na vivo em amostras de 3-dimensional vivos em ordem para o comportamento exato e interações das várias linhagens envolvidas para ser seguido da pilha com precisão ao longo do tempo. Análise em tempo real destas dinâmicas de célula permite uma caracterização mais detalhada dos fenótipos mutantes do que estático único-pontos de tempo de amostras fixas usando técnicas de imuno-histoquímica clássico. Tradicionalmente, a maioria dos estudos de imagem ao vivo usando o modelo de Drosophila geneticamente tractable utilizaram fase embrionária de desenvolvimento fruitfly devido à sua translucidez óptico e imobilidade em comparação com os estádios de desenvolvimento mais tarde4 , 5. no entanto, mais recentemente o nosso grupo e outros desenvolveram a pupa drosófila como um novo modelo para executar a alta resolução e imagem a longo prazo de reparação da ferida e inflamação simultaneamente na vivo8,22 ,23. Esta abordagem emergente oferece um excitante potencial a longo prazo para unraveling os aspectos fundamentais do comportamento celular inflamatória e pode ser ainda mais adaptada para investigar o comportamento dinâmico de outras linhagens de células (por exemplo, Drosophila adipócitos 38) após a lesão tecidual.
Há um número de fatores críticos durante a preparação e imagem latente de pupas de Drosophila feridas que vai determinar a qualidade dos resultados de imagem descritos acima. Sem dúvida o passo mais difícil do protocolo descrito é a dissecção cuidadosa e posicionamento preciso das pupas antes da imagem e ferindo. Pupas nesta fase do desenvolvimento são extremamente frágeis e até mesmo pequenos danos acidentais para as pupas durante as fases de preparação prejudicará significativamente a experiência; qualquer pupas que podem ter danos não intencionais devem ser descartadas do experimento, desde que este dano pode ativar sua própria resposta inflamatória, que pode levar a mais difundida (ou mesmo sistêmicos) efeitos sobre o comportamento de células inflamatórias em outro lugar no a pupa. Devido ao desenvolvimento contínuo das pupas utilizados nesses experimentos (que estão passando por rearranjos de tecido significativa para preparar os tecidos para a idade adulta), ocasionalmente pupas moverá durante o curso da imagem latente. Rolling pupal é, no entanto, mais provável de ocorrer se pupas não foram montadas corretamente com a superfície plana da asa (ou de outro tecido para ser fotografada) em contato direto com a lamela; uso de cola de heptano para estabilizar as pupas no vidro tampa deve minimizar este movimento indesejável. Por este motivo, muito cuidado também deve ser tomado para evitar a desalojar as pupas de suas posições cuidadosamente alinhadas ao mover as amostras entre microscópios; Idealmente, o laser ferindo será anexado ao mesmo microscópio para ser usado para imagens de lapso de tempo subsequente e foto-conversão.
Além da proficiência da dissecação pupal e passos de montagem, o genótipo exato das pupas de Drosophila usado terá um efeito significativo sobre a qualidade dos dados gerados. Por exemplo, o número de cópias do driver Gal4 e construções UAS (por exemplo, UAS-GFP ou UAS-Kaede) dentro de um genótipo individual pupal determinará a relação sinal-ruído durante a imagem latente subsequente. Como regra geral, as mais cópias de um Gal4 ou UAS constroem presente, maior o nível total de proteína fluorescente (por exemplo, GFP ou Kaede) dentro do tecido. O nível ideal de proteína fluorescente, no entanto, será um equilíbrio cuidadoso entre elevação da fluorescência de tecido suficiente para permitir que a alta qualidade de imagem (permitindo o uso de baixas potências do laser, redução fotobranqueamento e imagem ao longo do tempo estendido períodos), mas sem causar toxicidade celular induzida por fluoróforo; o número ideal de Gal4 e UAS construções em cada experimento irá variar de acordo com os motoristas particulares e fluorophores sendo usado. Tenha cuidado para elevar as pupas a 25 ° C (ou acima, até 29 ° C), porque o sistema de Gal4-UAS é sensível à temperatura e será ineficaz em baixa temperaturas31. Para alcançar níveis adicionais de controle sobre o tecido ou tempo-especificidade de Gal4 -conduzido a expressão, o repressor do sistema Gal4-UAS Gal80 também pode ser incluído dentro o genótipo pupal39. Gal80 também pode ser usado para reprimir a atividade de Gal4 dentro de um determinado tecido (usando um Gal80 de tecido-específica) ou em um determinado momento (usando uma temperatura sensível Gal80). O sistema de Gal4-UAS pode ainda ser combinado com outros sistemas binários independentes (tais como os sistemas de QF -QUAS e LexA -lexAop ) para gerar a drosófila , que tem várias construções (por exemplo, fluorophores, linhas de RNAi ou outras construções genéticas) expressa simultaneamente em uma variedade de diferentes tecidos39.
Uso desse novo modelo pupal Drosophila oferece uma série de vantagens sobre a abordagem mais tradicional do embrião. Em comparação com a imagem de curto prazo (até 3 h) disponível em embriões de estágio 15 (a fase em que mais embrionárias ferindo estudos são executadas), pupas podem ser imaginadas durante significativamente mais longos períodos de tempo (em princípio, até a idade adulta após 96 h de desenvolvimento pupal ). Além disso, um número muito maior de hemócitos (células do sistema imunológico inatosDrosophila ) está presentes dentro de tecidos pupal (e disponível para a imagem latente) em relação ao número mais limitado presente dentro do embrião e isto permitiu-nos recolher significativamente mais dados sobre o comportamento do hematócito usando o mesmo número total de espécimes. Fundamentalmente, este, por sua vez, permitiu-nos aplicar mais sofisticada modelagem matemática para analisar o comportamento de hemócitos e extrair características inovadoras da ferida atrativos e resposta inflamatória que seria caso contrário permaneceram experimentalmente inacessível,23. Outra vantagem do modelo pupal é que aquele knockdown RNAi-mediada do gene é consideravelmente mais eficiente do que no anteriores estágios embrionários, permitindo análise melhorada de tecido ou inativação de genes específicos de tempo usando sistemas binários, tais como o sistema de Gal4-UAS 39. a eficiência de RNAi, nesta fase, portanto, abre-se o potencial para realizar em larga escala (ou até mesmo imparcial todo o genoma) telas de RNAi para procurar novos jogadores envolvidos no reparo de ferida ou comportamento de células inflamatórias.
No entanto, Drosophila pupas claramente não podem ser usadas para estudar os fenótipos resultantes de mutações genéticas que são embrionárias letal; estudos funcionais e geração de imagens ao vivo de genes que são essenciais para o desenvolvimento embrionário, portanto, ainda devem ser realizados em embriões, a menos que o knockdown RNAi-mediada do gene em um tempo ou forma tecido-específica permite desenvolvimento ocorra através de estágios pupal. O embrião também continua a ser o modelo de escolha para estudar e viver-imagem certas características do comportamento de células imunes, incluindo a dispersão do desenvolvimento das células do sistema imunológico de sua origem, contato-inibição de locomoção e fagocitose de corpos apoptotic gerados durante o desenvolvimento tecido escultura5,8 , que ainda não foram observadas em modelos pupal. Embora estudos em Drosophila larvas e adultos forneceram uma visão importante sobre os mecanismos subjacentes a ferida reparo e inflamação40,41,42,43, estudos de imagem ao vivo 44 estas fases têm provado difícil devido à natureza inerentemente móvel das amostras. Enquanto as larvas podem ser anestesiadas para permitir breves períodos de geração de imagens ao vivo, devido à natureza temporária da anestesia, só curtos instantâneos da ferida ao vivo reparar ou resposta inflamatória pode ser visualizado45. Um estudo recente desenvolveu um protocolo melhorado que permite imagens de longo prazo de larval ferida cura46, apesar de preparação e imagem ainda permanecem consideravelmente mais desafiador do que em embriões ou pupas. A longo prazo, nós encaramos isso utilizando a fase de desenvolvimento mais adequado para resolver cada questão específica, estudos em todos os quatro destes estágios diferentes de Drosophila - de embriões através de períodos larvas e pupal, à idade adulta (cada um com suas próprias vantagens exclusivas e limitações) - irá fornecer insights complementares sobre o mecanismo molecular e celular, dirigindo a reparação da ferida e inflamação.
No futuro, este protocolo para a imagem a longo prazo da drosófila pupas e ferindo pode ser facilmente adaptado para estudar uma variedade de fenômenos relacionados com inflamação e tem um potencial de longo alcance para descobrir características inovadoras da resposta inflamatória ferida. A combinação da imagem a longo prazo, juntamente com o pedido de photoconvertible fluorophores (tais como Kaede), são de grande valia para a compreensão da dinâmica do comportamento celular imune inata e em particular, o mais distante menos entendido fase de resolução de a resposta inflamatória da ferida. Etiquetando especificamente qualquer indivíduo ou subpopulações de células do sistema imunológico (tais como aqueles recrutados para uma ferida) será possível analisar como a exposição a uma sinalização ambiental (como um cadáver ou lesão) afeta a resposta subsequente da célula imune a uma posterior sugestão. O comportamento inflamatório de hemócitos de Drosophila pode ser alterado por experiências anteriores - por exemplo, eles são pré-pintados para responder à lesão tecidual por fagocitose prévia dos corpos apoptotic durante desenvolvimento12 , mas ela continua a ser visto se outras pistas ambientais induzem eventos similares de escorva. Embora estudos de pupa feridas até agora têm-se centrado sobre a resposta inflamatória inata, o modelo de asa pupal também oferece uma oportunidade ideal para ambos viver-imagem e dissecar os mecanismos subjacentes a reparação epitelial ferida. Além disso, este método de imagem pupal também poderia ser adaptado para investigar o comportamento dinâmico de outras linhagens de células em resposta ao tecido danos38, na ala pupal propriamente dito ou outros tecidos pupal facilmente acessíveis (por exemplo, olhos, pernas e tórax). Finalmente, combinando a rastreabilidade genética da Drosophila juntamente com a facilidade de imagiologia pupal a longo prazo, romance reparação epitelial ou reguladores inflamatórios podem ser descobertos através da aplicação de imparcial todo o genoma knock-down aproxima-se.

Uma resposta inflamatória eficaz e eficiente é crucial para qualquer organismo combater a infecção, limpar escombros e orquestrar a reparação de tecidos feridos1. Embora esta resposta é um resultado inevitável de maior dano de tecido, inflamação requer uma regulamentação estrita porque uma resposta inflamatória inadequada tem sido associada a uma variedade de diferentes doenças humanas (incluindo não-cura feridas crônicas, excessivo de cicatrizes e predisposição ao câncer)1,2,3. Dada esta relevância clínica, é crucial obter uma compreensão mais detalhada dos mecanismos moleculares e celulares de condução a resposta inflamatória, a fim de desenvolver novos indicadores prognósticos e estratégias para tratar uma variedade de crônica inflamatória condições, que podem proteger a reparação de tecidos de inflamação prolongada e desnecessária.
Nos últimos anos, a Drosophila tornou-se um sistema bem estabelecido e valioso modelo para dissecar as características fundamentais da resposta inflamatória conservada de insetos para humano4,5. Actualmente, a drosófila oferece rastreabilidade genética muito maior do que é actualmente possível em outros modelos experimentais (como ratos ou zebrafish), permitindo a manipulação genética espácio-temporais precisos na vivo (para inactivar ou excesso expressar qualquer gene de interesse dentro de tipos de células específicas em um tempo-ponto do desenvolvimento definido) e facilidade de todo o genoma telas6,7. Tradicionalmente, a maioria das imagens ao vivo da cicatrização da ferida e inflamação na Drosophila foram efectuados estudos em estágios embrionários, como embriões são opticamente translúcido e imóvel (ao contrário de Drosophila larvas ou adultos) que permite inigualável de alta resolução na vivo de imagem8. Isto permitiu que os pesquisadores a visualização rápido e robusto recrutamento de células do sistema imune inatos drosófila (hemócitos) para o local da ferida, em resposta a ferimentos mecânicos ou induzida por laser para o epitélio embrionário9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. combinando estes estudos de imagem ao vivo com a manipulação genética, estudos em embriões da drosófila tem descoberto muitas proteínas importantes células imunes que controlam o comportamento de células inflamatórias em vivo. Por exemplo, o homólogo do CED-1 Draper (uma ITAM domínio-contendo proteínas) foi identificado como uma importante «receptor de dano» que medeia as células imunitárias drosófila de recrutamento em um H2O2-forma dependente de sites de danificar a15. Níveis de Draper dentro de células do sistema imunológico são por sua vez regulados pela induzida por cálcio sinalização JNK e elevado a jusante de apoptotic cadáver captação12. Motilidade hematócito mais requer complexas alterações do citoesqueleto para coordenar a migração dirigida para a ferida e é dependente na atividade dos reguladores do citoesqueleto tais como a actina-empacotamento proteína Fascin16 e a família Rho pequena As GTPases Rac e Rho9.
Drosófila é um inseto holometábolos que atravessa os estágios larvas e pupal adicionais embriogênese, antes de atingir a idade adulta17a seguir. A pupa drosófila foi desenvolvida como um modelo adicional para a não-invasiva ao vivo-imagem latente de uma variedade de eventos celulares dinâmicos, incluindo divisão celular19de migração no desenvolvimento celular18, crescimento de célula20e músculo contração de21. Mais recentemente, ele foi estabelecido como um novo modelo em que para estudar a dinâmica da ferida reparo e inflamação na vivo22,23.
Assim como em estágios embrionários, Drosophila pupas são imóveis e opticamente translúcido, após dissecção cuidadosa de seus casos pupal opaco18. Explorando essa transparência óptica, um pode seguir o comportamento na vivo de células do sistema imune inatos (hemócitos) em resposta ao dano de tecido dentro drosófila pupal tecidos, tais como a asa pupal22. A ala pupal existe como uma estrutura de bilayered simples, consistindo de dois grandes folhas plana epiteliais que estão conectadas em torno da periferia da asa; o espaço extracelular entre estas duas camadas epiteliais está repleto de hemolinfa (sangue inseto) e um grande número de hemócitos motile24. Assim como em embriões, ferimentos mecânicos ou induzida por laser para o epitélio da asa desencadeia um rápido recrutamento de hemócitos a lesão local23. No entanto, nesta fase pupal oferece algumas vantagens distintas para a imagem latente sobre anteriormente estágios embrionários. Pupas lesionadas podem ser imaginadas durante períodos de tempo muito mais longos (pelo menos 5 h), mais área de tecido está disponível para a perturbação experimental (tais como a geração de múltiplos ferimentos) e há um número significativamente maior de hemócitos presentes no (fase fornecendo mais trajetórias de célula de distâncias mais potência estatística melhorada durante a análise matemática). Além disso, a eficiência de inativação de genes mediada por RNAi é consideravelmente melhorada em estágios pupal, permitindo que muitos genes ser 'knocked-down' em um tecido ou o modo de tempo específico, em comparação com a abordagem mais tradicional de todo mutante de embriões.
Para seguir a dinâmica da ferida re-epitelização e a resposta inflamatória que acompanha dentro deste novo modelo pupal, duas populações de células diferentes devem ser rotuladas: o epitélio pupal e as células do sistema imunológico inatas (Drosophila hemócitos). Um número de diferentes marcadores (Tabela de materiais) está disponível para rotular estas duas populações de células diferentes - a escolha do marcador varia de acordo com o processo específico a ser estudado. Para marcar o epitélio pupal, linhas de Drosophila , contendo também um ubiquitously expressa GFP-com a tag E-caderina (que rotula entroncamentos adherens) rotineiramente são utilizados para indicar as posições das margens de célula, ou alternativamente, um GFP-etiquetado Domínio de ligação de actina de Moesin (que rotula o citoesqueleto de actina) para visualizar as saliências de anel e ponta de ferida-borda contrátil actina. Para rotular os hemócitos de Drosophila , um específico hematócito srp-Gal425 a expressão de unidade de RFP nuclear (para rastreamento nuclear), GFP citoplasmática ou GFP-etiquetado Moesin (para rotular o citoesqueleto citoplasma ou actina, respectivamente) ou um fluoróforo photoconvertible (tais como Kaede) são utilizados. Na verdade, muitas vezes é vantajoso usar vários marcadores de células imunes em combinação, para permitir a análise simultânea do movimento nuclear e a morfologia da célula (veja resultados representativos). No entanto, desde que este protocolo envolve o uso de pupas de Drosophila , apenas combinações de marcadores genéticos que são viáveis até meados-pupal estágios podem ser utilizados. Além disso, estoques letais embrionários não será apropriados. Isso é pouco provável que seja um problema quando o controle de imagem (ou tipo selvagem) pupas mas é importantes considerar quando os genes estão para ser derrubado ou overexpressed, para avaliar seus efeitos sobre o fechamento de ferida ou inflamação. No caso de letalidade precoce causada por gene nocaute (ou superexpressão), um Gal80ts construção pode ser usada para induzir o nocaute Gal4-conduzido mais tarde no desenvolvimento (ver discussão).
Em estudos recentes, movendo-se para a fase de pupa nos permitiu coletar dados de trajetória de célula imune suficiente para analisar o comportamento inflamatório usando modelagem matemática sofisticada, que por sua vez nos permitiu deduzir novos detalhes da ferida attractant inflamatória sinaliza23. Por exemplo, esta abordagem revelou que a ferida quimiotático espalha-se lentamente através do tecido inflamado em 200/min2μm, um ritmo muito mais lento do que o sugerido anteriormente moléculas pequenas candidato como o ATP ou H2O2 são relatados para difusa de28,de27,26,29; Estas moléculas pequenas "danos" em vez disso são prováveis que atuam como sinais permissivos. Além disso, como eles resolver longe uma ferida inicial e estão expostos a um segundo (feito em vários momentos após a primeira), seguindo o comportamento a longo prazo das células do sistema imune inatos, nós descobrimos um período temporário 'dessensibilização' durante a quais as células imunes são cegos para lesões subsequentes23. Explorando o potencial a longo prazo da imagem latente do modelo pupal, juntamente com rastreabilidade genética da Drosophila , um pode acompanhar o comportamento de populações de células imunes específicas (por exemplo, somente as células imunes, recrutadas para o local da ferida) no resposta aos insultos subsequentes, usando o photoconvertible fluoróforo30 que pode ser expresso exclusivamente dentro a linhagem de células imunes23.
Aqui descrevemos um protocolo para visualizar a dinâmica da reparação da ferida e a resposta inflamatória associada em alta resolução espácio-temporais usando vivos pupas de Drosophila . Nós fornecemos uma metodologia detalhada para cobrir as etapas necessárias para a preparação de pupas inicial (dissecção e montagem) e a subsequente mediada por laser ferindo e a imagem latente de lapso de tempo. Descrevemos também o uso de foto-conversível fluorophores para permitir a rotulagem de célula imune específica subconjuntos no vivo. A longo prazo, vislumbramos que este novo modelo pupal Drosophila vai abrir possibilidades excitantes para dissecar a complexa dinâmica de sinalização subjacentes a resposta inflamatória ao dano tecidual. Aplicando mais sofisticadas análises estatísticas um pode descobrir características de resposta que caso contrário permaneceria experimentalmente inacessíveis, enquanto a eficiência melhorada de RNAi poderia emprestar-se a aplicação de todo o genoma de rastreio dentro células do sistema imunológico na vivo para identificar novos jogadores que regulam o comportamento de células imunes.

<table><tbody><tr><td>Drosophila stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ; Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)</td><td>Kyoto Stock Center,</td> <td>DGRC#109007</td><td>As sequências promotoras Ubi-p63E conduzem a expressão de Drosophila E-caderina (shotgun) marcada na extremidade C-terminal com GFP.</td></tr><tr><td>ubíquo E-caderina marcada com GFP ;; Ubi-p63E-shg.GFP (III)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#58742</td><td>As sequências promotoras Ubi-p63E conduzem a expressão de Drosophila E-caderina (shotgun) marcadas na extremidade C-terminal com GFP.</td></tr><tr><td>onipresente Moesin P{sGMCA}3.1</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#59023</td><td>O promotor/intensificador sqh onipresente expressa impulsiona a expressão de um fragmento de Moesin (que inclui as sequências de ligação à actina) marcado com GFPS65T.</td></tr><tr><td>condutor de serpente específico de hemócitos-Gal4 ; srp-Gal4; </td><td>Gerado por Katja Bruckner</td><td>Gerado por Katja Bruckner</td><td>A expressão de Scer\GAL4 fundida a uma cauda poliA está sob o controle de 2 sequências genômicas a montante da serpente Drosophila. Referência: Br&uuml; ckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., R&oslash; rth, P., Perrimon, N. O receptor PDGF / VEGF controla a sobrevivência das células sanguíneas em Drosophila. Célula de desenvolvimento. 7 (1), 73&ndash; 84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).</td></tr><tr><td>UAS-nuclearRFP w1118;; P {UAS-RedStinger}6</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td> <td># 8545 ou # 8547</td><td>As sequências regulatórias de UAS conduzem a expressão da forma DsRed.T4 de RFP que é marcada na extremidade C-terminal com um sinal de localização nuclear</td></tr><tr><td>UAS-cytoplasmicGFP ;; P{UAS-GFP. S65T}</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>Vários estoques disponíveis (por exemplo, #1522)</td><td>Expressão da versão S65T de GFP por sequências regulatórias de UAS; a variante S65T exibe maior brilho.</td></tr><tr><td>UAS-fotoconversívelKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#26161</td><td>A proteína Kaede emite fluorescência verde brilhante após a síntese, mas muda eficientemente para uma fluorescência vermelha estável brilhante na irradiação com UV.</td></tr><tr><td>GFP-tagged espaguete squash w1118;; P{sqh-GFP.RLC}</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#57145</td><td>A região de codificação sqh, que é marcada na extremidade C-terminal com uma tag T:Avic\GFPS65T, é expressa sob o controle do promotor sqh natural.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Ingredientes para meios alimentares para moscas</td><td></td><td></td><td>Os meios alimentares para moscas são feitos de acordo com procedimentos padrão (ver Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: A Teoria e a Prática da Genética da Drosophila. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.)</td></tr><tr><td>milho</td><td>Wild Oats, Bristol, UK (ou fornecedor equivalente)</td><td>Contatar fornecedor farinha de</td> soja <td>orgânica</td>direta</tr><tr><td></td><td>Wild Oats, Bristol, UK (ou fornecedor equivalente)</td><td>Contatar fornecedor extrato de</td><td></td></tr><tr><td>malte</td> orgânico direto <td>Wild Oats, Bristol, UK (ou fornecedor equivalente)</td><td>Contatar fornecedor melaço orgânico direto</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wild Oats, Bristol, UK (ou fornecedor equivalente)</td><td>Contato fornecedor</td><td>direto orgânico</td></tr><tr><td>Difco ágar</td><td>BD Biosciences, Fisher Scientific</td><td>DF0142-15-2</td><td>Para preparação de alimentos</td>para</tr><tr><td>moscas Ácido propiônico</td><td>Sigma</td><td>402907</td><td>Para preparação de alimentos para moscas</td></tr><tr><td>Nipagen</td><td>Sigma</td><td>79721</td><td>Para preparação de alimentos</td>para</tr><tr><td>moscas Fermento de padeiro seco</td><td>Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD</td><td>Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD</td><td>Para preparação de alimentos para</td></tr> <tr><td>moscasNome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários<</td></tr><tr><td>strong>Preparação e montagem de amostras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>Para preparação de cola de heptano</td></tr><tr><td>Zibelina fina pincel</td><td>Daler-Rowney (ou equivalente)</td> <td># 0 ou 1</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fisher Scientific (ou Ferramentas de Ciência Fina)</td> <td>NC9404145</td><td>Dumont # 5</td></tr><tr><td>Pratos com fundo de vidro para imagens</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>Sugerimos o uso de placas de Petri de 35 mm, com pelo menos um Microwell de 10 mm, vidro de cobertura de 0,085-0,13 mm, não revestido. Placas com micropoços maiores permitirão que um número crescente de pupas seja montado e fotografado em um único experimento.</td></tr><tr><td>Heptano</td><td>Sigma</td><td>51730-5ML</td><td>Para preparação de cola de heptano</td></tr><tr><td>Fita adesiva dupla face (por exemplo, Scotch)</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG263</td><td>Para preparação de cola de heptano Tubo</td></tr><tr>de<td>50ml (para cola de heptano)</td><td>Tubos Falcon da Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Para preparação de cola de heptano</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de vidro</td><td>Agar Scientific</td><td>AGL4244</td><td>Para dissecação de Drosophila pupas</td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico de dissecação com campo claro</td><td>Leica (ou equivalente)</td><td>M50</td><td>Para dissecação de pupas Drosophila</td></tr><tr><td>Microtesoura John</td><td>Weiss International</td><td>103123</td><td>Tesoura de Pesquisa em Miniatura (reta)</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Empresa</forte></td><td><forte> Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Ablação e imagem a laser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser de ablação Nitogen</td><td>Spectra-Physics (ou equivalente Andor)</td><td>Modelo VSL-337ND-S</td><td>Para ferimentos, este deve ser conectado a um sistema de imagem de campo amplo</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser multilaser (CLSM)</td><td>Leica (ou equivalente)</td><td>TCS AOBS SP8 ou SP5-II conectado a um microscópio de epifluorescência invertida Leica DMi8 (ou equivalente)</td><td>Idealmente, incluindo uma platina motorizada para varredura em vários locais e 'mosaico', além de ' híbrido' Detectores GaAsP (que oferecem sensibilidade muito maior e aumento de sinal baixo) Serviços de</td></tr> <tr>imagem de vida da <td>câmara ambiental</td><td>(ou equivalente)</td> <td>"Sistema de controle de temperatura do microscópio"</td> <td>Conectado ao microscópio confocal para controle de temperatura durante a imagem</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td> Comentários</td></tr><tr><td>Software de análise de imagem</td>Módulo de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>software FRAP</td><td>Leica (ou equivalente)</td><td>Módulo de software CLSM FRAP</td><td>Para realizar a fotoconversão de fluoróforos fotoconversíveis, como Kaede</td></tr><tr><td>ImageJ (software de análise de imagem)</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td>Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 anos de análise de imagem". Métodos da Natureza 9, 671-675, 2012.</td></tr><tr><td>Plug-in ImageJ "Rastreamento manual"</td><td>Institutos Nacionais de Saúde (NIH)</td><td>https://imagej.net/Manual_Tracking</td><td></td></tr><tr><td>Plug-in ImageJ "TrackMate"</td><td>ImageJ, NIH</td><td>https://imagej.net/TrackMate</td><td>Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: Uma plataforma aberta e extensível para rastreamento de partícula única.", Métodos 115: 80-90, PMID 27713081</td></tr><tr><td>Volocity (software de imagem 3D de alto desempenho)</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Para análise de imagem</td></tr><tr><td>IMARIS (software de análise de imagem)</td><td>Bitplane</td><td>IMARIS para biólogos celulares</td><td>Para análise de imagem</td></tr></tbody></table>

a longo prazo no vivo controle da dinâmica celular inflamatória dentro drosófila pupas

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Durante a rápida resposta inflamatória ao dano tecidual, células do sistema imunológico inato são rapidamente recrutadas para o local da lesão. Uma vez na ferida, células do sistema imune inatas realizar um número de funções essenciais, tais como o combate à infecção, limpando os restos necróticos e estimulando a deposição de matriz. Para melhor entender os eventos de sinalização diversos que regulam esta resposta imune, é crucial observar os comportamentos complexos de (e interações que ocorrem entre) várias células linhagens in vivo e em tempo real, com a alta resolução espaço-temporal. A translucidez óptico e a rastreabilidade genética de embriões da drosófila estabeleceram drosófila como um modelo de valor inestimável para viver-imagem e dissecam aspectos fundamentais do comportamento de células inflamatórias, incluindo mecanismos de dispersão do desenvolvimento, liberação de corpos apoptotic e/ou patógenos microbianos e recrutamento para feridas. No entanto, trabalhos mais recentes agora demonstrou que empregar um estágio muito posterior do ciclo de vida de drosófila – a pupa drosófila – oferece uma série de vantagens distintas, incluindo eficiência melhorada de RNAi, mais longa períodos, de imagem e significativamente maior número de células imunes. Aqui descrevemos um protocolo para o reparo de ferida de imagens e a resposta inflamatória associada com a alta resolução espaço-temporal em pupas de Drosophila ao vivo. Para acompanhar a dinâmica de re-epitelização e inflamação, usamos um número específico no vivo marcadores fluorescentes para o epitélio e células do sistema imunológico inatas. Nós também demonstrar a eficácia da foto-conversível fluorophores, tais como Kaede, por seguir os subconjuntos de célula imune específica, para controlar seu comportamento como migram para e resolver partir, local da lesão.

Este protocolo descreve a preparação de pupas de drosófila para a imagem latente de lapso de tempo ao vivo do ferimento reparação e inflamação na vivo. Usando este método, é possível gerar vários filmes de alta resolução de fechamento da ferida pupal e recrutamento de células inflamatórias com facilidade e as pupas para longos períodos de tempo (pelo menos 5h) pós-ferindo sem fotobranqueamento significativo de imagem.
Um esquema geral para a preparação de pupa de Drosophila 
A Figura 1 ilustra o método ideal para a preparação de pupas de drosófila para a imagem latente na vivo . Drosófila branca 'pré-pupa' é recolhidas em '0 h' após a formação do casulo (APF), como as larvas rastejantes cessam motilidade e adotam a forma de pupa estereotipada com evertido apêndices respiratórios (espiráculos) visíveis na sua extremidade anterior-a maioria ( Figura 1A). O branco h 0 pré-pupa APF poderão desenvolver por 18 h a 25 ° C, altura em que tornou-se o casulo marrom (figura 1B) e são então dissecado usando pinça fina e/ou micro-tesouras (Figura 1, para remover a caixa protetora pupa) para revelar a opticamente translúcido pupa dentro (Figura 1). Após dissecação, as asas pupal será visíveis no lado lateral do tórax pupal (esboçado em azul, Figura 1-D). Nesta fase, outras partes do corpo pupal também são facilmente perceptíveis, incluindo os olhos, pernas e abdômen (rotulada na Figura 1). As pernas também são adequadas para estudos de inflamação da ferida e podem estar feridas, usando o mesmo método de laser descrito acima. Múltiplos de 18 h pupas APF podem ser montadas simultaneamente dentro do prato de imagem (Figura 1E, usando cola de heptano e um papel de filtro embebido de água para minimizar a desidratação) com a parte plana da asa (contorno azul) em contacto com a lamela ( Figura 1F); Isto é particularmente vantajoso se a imagem do microscópio é equipado com um palco motorizado para permitir que vários pupas ser gravado durante um único período de imagem. Quaisquer que tenham sido danificadas durante a montagem ou dissecação pupas devem ser descartadas (por exemplo, a pupa localizado a terceira na sequência, seta na Figura 1E). Outras partes do corpo (por exemplo, olhos e pernas, delineada rosa) também podem contatar a lamela e estão disponíveis para ferir e subsequente de imagem (Figura 1-F). Para experiências estudando único ferimentos, danos induzida por laser são geralmente melhor infligidos centralmente na ala (asterisco, Figura 1F), embora outros locais podem ser utilizados se múltiplas feridas estão a ser estudadas.
Ferindo estéril ativa uma resposta inflamatória robusta na ala pupal drosófila 
Para seguir a reparação da ferida e o acompanhamento resposta inflamatória in vivo, as asas feridas de pupas APF Drosophila 18 h foram fotografada usando microscopia confocal de lapso de tempo (Fig. 2A-H). Nesta fase pupal, o epitélio da asa é simples folhas lisas de células (rotuladas aqui usando E-caderina GFP-etiquetado para marcar limites de célula individual, a margem de asa descritas na Figura 2A). Mesmo nas asas intacta (baixa ampliação, figuras 2A e 2A'), um grande número de células do sistema imunológico inatos migratórias (hemócitos, rotulados usando srp-Gal4 conduzido GFP citoplasmática, verde e nuclear RFP, magenta) encontram-se dentro a hemolinfa ( sangue de insetos) ocupando o espaço extracelular intermediárias (Figura 2A e 2A'). Lesão induzida por laser para o epitélio pupal asa (margem ferida delineado em branco, Figura 2B-D) estimula uma rápida migração de hemócitos ao local da ferida (Figura 2B-D e do núcleo de células imunes na Figura 2B '-D'). Rotulagem de hemócitos com ambos um nuclear marcador (por exemplo, o nuclear RFP 'vermelho-ferrão') em combinação com um marcador citoplasmático ou do citoesqueleto (por exemplo, GFP citoplasmática ou GFP-etiquetado Moesin) é particularmente vantajoso, pois permite a monitoramento simultâneo de hematócito núcleos (para análise automatizada de hematócito comportamento por exemplo, migração de velocidade e direção) e a visualização da morfologia hematócito. O último é importante, pois permite-nos determinar se hemócitos são fagocitose detritos necróticos (Figura 2, inset) na borda da ferida (ou micróbios no caso de infecção)12,23 e também nos permite seguir seu comportamento cêntrica como eles se estendem bem filopodia ou lamellipodia em sua ponta como elas migram em direção ou para longe da ferida.
Simples de monitoramento de trajetórias nuclear hematócito, uso de software de análise de imagem apropriado32 (Tabela de materiais) demonstra a complexa dinâmica espaço-temporal da resposta inflamatória, semelhante ao relatado anteriormente para ferido embriões9,36 (faixas coloridas, Figura 2' e D'). Dentro de apenas 30 min do ferimento, hemócitos localizados mais próximo ao local da lesão começam a migração dirigida em direção a ferida (Figura 2'). No entanto, com o aumento da pós-lesão tempo, hemócitos localizados progressivamente mais longe do local da lesão também começam migração dirigida para a ferida (Figura 2D'). Desta forma, uma 'onda' de capacidade de resposta imune celular que se espalha para fora da borda da ferida é observada, que montamos para refletir a difusão da ferida quimiotático longe do local da lesão. Estas dinâmicas espácio-temporais imune celular fornecido um ponto de partida útil para nosso estudo recente que empregavam sofisticada análise matemática ('inferência Bayesiana') de modelagem para inferir Propriedades romance do sinal attractant ferida (métodos de detalhadas Publicado em23). Por calibrar nossos modelos computacionais (que vinculada o ferida attractant gradiente ao viés hematócito) para caber as trajetórias imune observados na vivo , um poderia extrair características detalhadas da attractant a ferida de nossa trajetória hematócito dados (como a taxa de difusão do sinal, a fonte e a duração da produção de sinal)23.
Além disso, pela expressão do fluoróforo photoconvertible Kaede dentro da linhagem de células imunes usando srp-Gal4 (verde, Figura 2E) também fomos capazes de seletivamente rotular uma subpopulação de hemócitos estes asa migratórias (tais como de condução os recrutaram para o local da ferida; E, antes de photoconversion induzida por UV e F, post-photoconversion). Então, seguimos o comportamento desses hemócitos ao longo do tempo (magenta, Figura 2-H) como eles resolver longe do local da ferida (setas, Figura 2 e H) e comparam como seu comportamento é diferente dos não-photoconverted células que não atingem o local da lesão. Nós usamos esta na vivo técnica de rotulagem para demonstrar que hemócitos recrutados para uma inicial ferida são insensíveis temporariamente para uma segunda ferida gerada 90 minutos mais tarde,23, embora esta técnica de rotulagem diferencial poderia também tem muitas outras aplicações perspicazes no futuro (ver discussão).
Usando essa abordagem, também simultaneamente, seguimos a dinâmica espaço-temporal de reparação da ferida ou contraste está ' (Fig. 2B-D). Aqui ubiquitously expressa GFP-com a tag E-caderina rotula as junções adherens celular em todo o epitélio da asa e permite que as formas das células epiteliais individuais a serem seguidas ao longo do tempo. A borda da ferida é facilmente identificada como a junção entre as células epiteliais GFP-etiquetado intactas e detritos sem rótulo (linha branca tracejada, Figura 2B-D). Para a maioria das feridas, a ferida começa a re-epithelialize dentro de 1 h da lesão e os ferida borda avanços para dentro (Figura 2D); feridas deste tamanho vão sarar normalmente dentro de 2-3 h de lesão23. Fechamento da ferida em embriões e pupas é impulsionado por um cabo de actomyosin contrátil juntamente com ponta rica em actina filopodia23,37; Estas dinâmicas do citoesqueleto podem ser visualizadas diretamente durante o reparo de ferida usando apropriado na vivo repórteres, tais como a GFP-etiquetado Spaghetti squash (cadeia leve reguladora de miosina) ou de Moesin do emperramento do actínio GFP-etiquetado23. Para algumas feridas particularmente grandes, no entanto, o cabo de actomyosin e filopodia de vanguarda não persistem - estas feridas se tornar 'crônicas' e nunca completamente re-epithelialize23 , mesmo após períodos muito mais longos (superior a 24 h) in vivo imagem latente. Curiosamente, a resposta inflamatória associada com estas feridas não CICATRIZÁVEIS é marcadamente diferente da associada com feridas agudas normal23 , sugerindo que o comportamento anormal de células imunes pode ser um marcador prognóstico útil na clínica . No futuro, ainda mais na vivo análise de feridas crônicas, utilizando imagens de longo prazo (mais de 24 h) no modelo de pupa pode fornecer importante visão mecanicista sobre esta condição debilitante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57871/57871fig1.jpg"> Figura 1: Preparação de pupa drosófila para ferir e geração de imagens ao vivo. (A) drosófila pré-pupa branca recolhidas às 0h APF, com extremidade anterior indicado pelo evertido respirando apêndices (espiráculos). (B) depois de criar a pré-pupa APF branco 0 h para 18 h a 25 ° C, o casulo aparece marrom. Dissecação do caso pupal deve começar na região mais anterior (seta), indicado pelos espiráculos sempre como adequada a pupa é ausente desta região e a pinça fina e/ou micro-tesouras usadas para remover a caixa protetora de pupa (C). As asas pupal será visíveis no lado lateral do tórax pupal (contornos azuis). (D) caso Pupal completamente retirados 18 h crisálidas APF, aqui a pupa tem sido rolada 90º para mostrar o lado lateral, com a asa para ser fotografada delineadas em azul. (E-F) Pupas APF 18h cinco montagem na lamela de vidro dentro de imagem prato usando cola de heptano, com papel de filtro embebido de água para minimizar a desidratação (E). Pupa terceiro localizado na sequência (seta) deve ser descartado como dano ocorreu durante a preparação. Pupas são montadas com a parte plana da asa (contorno azul) em contacto com a lamela (F) e feridas induzida por laser são geradas centralmente na ala (asterisco, F), embora outros locais podem ser utilizados se forem múltiplos ferimentos a ser estudado. A imagem em (D) adaptada com permissão de tecelões et al, 201623. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57871/57871fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57871/57871fig2.jpg"> Figura 2: Dinâmica na vivo análise da resposta inflamatória ao dano tecidual. Pupas dissecado de capas protetoras pupal e montado na lamela de vidro (A) estão feridas e posteriormente fotografaram usando microscopia confocal de lapso de tempo (B-H). Baixa visão de ampliação da ala pupal intacta (A, margem de asa em branco) que contém um grande número de hemócitos migratórios (A'). Lesão induzida por laser para o epitélio pupal asa (B-D, limites da célula rotulados usando GFP-etiquetado Drosophila E-caderina; ferida margem delineada em branco) ativa uma resposta inflamatória rápida com a migração de vários hemócitos ( SRP-Gal4 conduzido a expressão de RFP nuclear, GFP citoplasmática e magenta, verde) em direcção ao local da ferida (B-D; quadros representativos de um filme lapso de tempo em que cada quadro é uma projeção de 25 fatias 3 μm cada). Controle manual de trajetórias hematócito (faixas coloridas, C' e D') indicam a complexa dinâmica espaço-temporal da resposta inflamatória, semelhante ao relatado para embriões feridos. Hemócitos também fagocitam restos celulares necróticos no local da ferida (ponta de seta, C e também de encastrar). Expressão do fluoróforo photoconvertible Kaede na linhagem de células imunes (verde, E, usando o srp-Gal4) permite que a ferida-recrutados hemócitos (seta, E) ser diferencialmente rotulado (magenta, F) e seguido ao longo do tempo como eles determinação do local da lesão (setas, G e H). Foram utilizados os seguintes genótipos pupal: (A-D) w1118; ubi-DE-cad-GFP, srp-Gal4 &gt; UAS-GFP(II); UAS-nRFP(III) e (E-H) w1118; srp-Gal4(II); UAS-Kaede(III). Imagens adaptadas com permissão de tecelões et al, 201623. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57871/57871fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui nós apresentamos um protocolo para a reparação de ferida de geração de imagens ao vivo e a resposta inflamatória associada à alta resolução espaço-temporal na vivo. Este método utiliza o estágio de pupa de Drosophila desenvolvimento para habilitar a longo prazo de imagem e rastreamento de populações de células específicas ao longo do tempo e é compatível com a inativação de genes mediada por RNAi eficiente.

A longo prazo no Vivo controle da dinâmica celular inflamatória dentro drosófila pupas

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Ao explorar o potencial de imagem de longo prazo deste novo modelo de pupa, juntamente com a tratabilidade genética da Drosophila, este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave nos campos de cicatrização de feridas e imunidade inata. O estágio de pupa oferece algumas vantagens distintas para imagens ao vivo em relação aos modelos mais tradicionais de cicatrização de feridas de Drosophila. Por exemplo, as pupas podem ser visualizadas em períodos de tempo muito mais longos, mais área de tecido está disponível para manipulação experimental e mais hemócitos estão presentes neste estágio.Além disso, a eficiência da inativação do gene mediada por RNAi é consideravelmente melhorada durante esses estágios de pupa, permitindo que muitos genes sejam derrubados de maneira específica do tecido ou do tempo. Para montar a coleção de pupas, instale frascos com 20 fêmeas virgens e 20 machos. Em seguida, 18 horas antes da sessão de imagem, colete pelo menos 10 pré-pupas brancas recém-formadas dos frascos.Para coletar uma pupa, use uma pinça ou um pincel fino para desalojá-la da superfície interna do frasco e transfira-a cuidadosamente para o lado de um novo frasco para moscas. Depois que as pupas se desenvolverem até o ponto de tempo desejado, transfira-as para um pedaço de fita adesiva dupla face montada em uma lâmina de vidro. Agora, sob um microscópio de dissecção de campo claro, remova cuidadosamente as pupas de seus invólucros.Posicione as pupas de forma que seus lados ventrais fiquem firmemente presos à fita. Faça a primeira incisão na região mais anterior do pupário usando a pinça. Certifique-se de que a caixa de pupa nesta área seja oca e desprovida de tecido pupal, pois as pupas terão encolhido dentro da caixa durante o desenvolvimento inicial da pupa.Em seguida, rasgue ou corte cuidadosamente a caixa da pupa aberta na direção anterior para posterior usando uma pinça ou microtesoura até que a pupa esteja completamente livre do invólucro marrom opaco e quebradiço. Tenha cuidado, essas pupas são muito frágeis. Agora é crucial que a pinça e a microtesoura não perfurem a superfície da pupa durante esta etapa.Tente evitar tocar na própria pupa ao remover a caixa ao redor. Agora monte as pupas não danificadas em um prato com fundo de vidro usando cola de heptano. Primeiro deposite uma linha de cola de heptano preparada a partir de uma alíquota de 10 microlitros.Então, após cinco segundos de secagem, use uma pinça para transferir cuidadosamente as pupas dissecadas para a cola. Ao aprender, alinhe até cinco pupas. Mais pode ser preparado com a experiência adquirida.Role as pupas usando uma pinça para montá-las de forma que a asa fique plana na lamínula com a maior parte da superfície da asa em contato direto com a lamínula. Por fim, para evitar a desidratação, adicione um pedaço de papel de filtro absorvente embebido em água destilada na lateral do prato com fundo de vidro. Em seguida, cubra o prato e prossiga com o procedimento de ferimento induzido por laser.Transfira as pupas montadas para um microscópio de campo amplo equipado com um sistema de ablação a laser ajustável. Ajuste o laser de ablação pulsado UV refrigerado a ar e bombeado por nitrogênio para o comprimento de onda desejado usando a célula de corante apropriada. Para uma ferida ideal, defina a taxa de repetição de pulso para 40 hertz.Agora, usando objetivas 40 ou 63 vezes e campo claro, ajuste os controles do estágio do microscópio para localizar a asa da pupa da primeira pupa a ser ferida. Concentre-se no plano do epitélio da asa de pupa mais próximo da lamínula de vidro. Alinhe a área a ser ferida com a área-alvo conhecida do laser de ablação.Para fazer isso, aproveite o marcador de mira dentro da ocular do microscópio. Em seguida, ajuste a potência do laser ajustando a lâmina do atenuador de densidade de energia no microscópio. Aproveite as paradas de clique para tornar a configuração reproduzível.Agora, para fazer uma ferida, ative o laser de ablação com um clique rápido de controle manual. Em seguida, verifique o aparecimento da bolha de ar transitória no local da ablação, o que é normal com ferimentos. Se o ferimento não for bem-sucedido, tente variar o plano focal.Como alternativa, aumente gradualmente a potência do laser usando a lâmina do atenuador até atingir os tamanhos de ferida desejados. Depois de ferir as margens da asa da pupa, transfira rapidamente o prato com fundo de vidro para um microscópio apropriado para imagens de lapso de tempo. Em seguida, abra o software de captura de imagem apropriado.No software, ligue os lasers apropriados e ajuste sua potência e ganho/deslocamento para obter sinal fluorescente suficiente sem saturação de pixels. Geralmente, a menor potência de laser possível na faixa de cinco a 20% funciona melhor para minimizar o fotobranqueamento. Concentre-se em toda a asa da pupa sob baixa ampliação ou concentre-se na ferida sob alta ampliação para investigar o reparo da ferida.Para capturar o epitélio reparador e o recrutamento de células inflamatórias, primeiro configure o microscópio para registrar uma pilha z usando o ajuste de foco fino no painel de controle. Escaneie do epitélio ferido até o espaço extracelular abaixo contendo hemócitos migratórios. Em seguida, configure o software para registrar fatias z através da asa da pupa a cada três mícrons ou em intervalos ainda mais apertados.Para imagens de lapso de tempo, registre z-stacks pelo menos a cada 30 segundos por pelo menos uma hora. Ao usar as sondas fotoconversíveis para fotoconverter e rotular seletivamente um subconjunto de células durante a geração de imagens, abra os módulos apropriados no software de imagem para realizar a conversão de fotos e ativar o laser de 405 nanômetros. Em seguida, selecione as células a serem fotoconvertidas no software FRAP usando uma ferramenta de seleção.Em seguida, defina o curso de tempo para a conversão de fotos para um único quadro de iteração e defina o laser de 405 nanômetros para 20% de potência do laser. Em seguida, clique em Iniciar o experimento para realizar a conversão de fotos. Depois de concluído, saia do módulo FRAP e retorne à tela de imagem original.Lá, sintonize os lasers com os fluoróforos em uso e obtenha imagens das células fotoconvertidas e não fotoconvertidas usando gravações de lapso de tempo. As asas feridas das pupas de Drosophila 18 horas após a formação do pupário foram fotografadas usando microscopia de lapso de tempo confocal. A lesão induzida por laser no epitélio da asa da pupa estimulou uma rápida migração de células imunes inatas de Drosophila chamadas hemócitos para o local da ferida.Os hemócitos foram marcados com um marcador nuclear e um marcador citoplasmático ou citoesquelético para permitir o rastreamento e a visualização de sua morfologia, respectivamente. O rastreamento das trajetórias nucleares dos hemócitos demonstra a complexa dinâmica espaço-temporal da resposta inflamatória. Dentro de 30 minutos após a ferida, os hemócitos localizados mais próximos do local da lesão começaram a migração direcionada para a ferida.Eventualmente, os hemócitos localizados progressivamente mais distantes da lesão começam a migrar em direção à ferida. Ao utilizar o fluorophor fotoconversível, as subpopulações Kaede desses hemócitos de asas migratórias foram rotuladas seletivamente. Este método tem sido usado para mostrar que os hemócitos recrutados para uma ferida inicial são temporariamente dessensibilizados para uma segunda ferida gerada 90 minutos depois.Ao rotular a E-caderina nas junções aderentes celulares com GFP, a borda da ferida é facilmente identificável e isso permite a análise da dinâmica de cicatrização de feridas. A maioria das feridas começa a reepitelizar dentro de uma hora após a lesão. A borda da ferida avança para dentro e as feridas cicatrizam em três horas.Uma vez que essa técnica tenha sido dominada, várias pupas podem ser preparadas para imagens ao vivo em apenas 10 minutos, mas ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que, uma vez dissecadas de seu caso de pupa, as pupas de Drosophila são extremamente vulneráveis a danos e desidratação. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores no campo da imunidade inata colaborassem com biólogos computacionais e aplicassem modelagem matemática mais sofisticada para explorar o comportamento dos sinais atrativos de feridas responsáveis pelo recrutamento de células inflamatórias. E ainda mais recentemente, tipos de células alternativas também foram rotulados para seguir sua resposta a lesões induzidas por laser e isso revelou que as células dos adipócitos, as células do corpo adiposo da Drosophila, também respondem a feridas dentro desse sistema.

long-term-vivo-tracking-inflammatory-cell-dynamics-within-drosophila

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Mesoscópica fluorescência tomografia opera além dos limites de penetração de tecido de corte de microscopia de fluorescência. A técnica é baseada na projeção multi-iluminação e uma descrição do transporte de fótons. Demonstramos in-vivo visualização de corpo inteiro em 3D da morfogênese da GFP-expressando asa em discos...

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

O vídeo demonstra o uso da fotoconversão para estudar a dinâmica das células inflamatórias em pupas de Drosophila. Os hemócitos verdes são atraídos para o epitélio ferido, seguidos por migração distante. A fotoconversão muda certos hemócitos de verde para vermelho, facilitando o rastreamento de seus movimentos.

A técnica de fotoconversão para explorar a dinâmica celular inflamatória em pupas de insetos

Este trabalho demonstra o uso de um microscópio confocal de varredura rápida para o comportamento das células de imagem diretamente através do pupário. Ao deixar o caso de pupa intacto, este método permite a observação e medição de processos celulares dinâmicos numa fase de desenvolvimento de Drosophila que é difícil de estudar directamente.

Imagem Através do Pupal Caso de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este protocolo apresenta um método eficiente para obter imagens do neuroepitélio do olho pupal de Drosophila vivo. Este método compensa o movimento do tecido e a topologia irregular, melhora a visualização dos limites celulares por meio do uso de várias proteínas de junção marcadas com GFP e usa um equipamento de imagem facilmente montado.

Vivo-imaging da Drosophila Pupal Eye

Este protocolo descreve um método detalhado para a longo prazo ex vivo cultura e imagens ao vivo de um disco imaginal Drosophila. Ele demonstra a diferenciação de fotorreceptores e rotação ommatidial dentro do período de 10 h de imagens ao vivo do disco olho. O protocolo é simples e não requer instalação caros.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

Aqui, apresentamos um protocolo para a visualização, detecção, análise e rastreamento do tráfico endógeno de mRNA em câmara de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo usando balizas moleculares, microscopia confocal de disco giratório e análise de código aberto Software.

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

Este protocolo é projetado para a imagem e análise da dinâmica da orientação celular e crescimento tecidual na epitélia abdominal Drosophila à medida que a mosca-das-frutas sofre metamorfose. A metodologia aqui descrita pode ser aplicada ao estudo de diferentes estágios de desenvolvimento, tecidos e estruturas subcelulares em Drosophila ou outros organismos modelo.

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Aqui, um protocolo é apresentado para imagens ao vivo de longo prazo da perna de Drosophila durante o estágio de pupa, envolvendo a remoção completa do pupário. Este protocolo também pode ser aplicado a outros tecidos.

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

Aprenda a realizar imagens de longo prazo da resposta inflamatória em pupas de Drosophila. Este método permite rastrear hemócitos em tempo real e estudar a cicatrização de feridas e imunidade inata.

A longo prazo no Vivo controle da dinâmica celular inflamatória dentro drosófila pupas

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