Aplicação de longo prazo cultivadas Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Ensaio para a Avaliação e efetoras de memória T respostas de células em gado

O objetivo geral deste procedimento é avaliar as respostas das células T efetoras e de memória usando ensaios de ponto de interferon gama L cultivados de curto e longo prazo, respectivamente. A avaliação da resposta da memória central é realizada por meio da cultura de células mononucleares do sangue periférico bovino sob estimulação antigênica por 13 dias. A cultura de longo prazo permite que as respostas das células T efetoras ocorram e diminuam.

A interleucina dois é adicionada às culturas para manutenção das células T de memória. No dia 13, as células de longo prazo são transferidas para placas pontuais L revestidas com anticorpo de captura gama IFN. A resposta de células de longo prazo a antígenos micobacterianos individuais é avaliada na presença ou ausência de células apresentadoras de antígenos autólogos.

APCs As APCs são isoladas de BMCs p frescos por adesão no dia 13. Além disso, a resposta do pbmc recém-isolado em condições ex vivo é avaliada como um correlato das respostas efetoras. Em vários estudos, a resposta de bovinos cultivados a longo prazo a antígenos micobacterianos após a vacinação demonstrou se correlacionar positivamente com a eficácia da vacina.

Além disso, as culturas de células T de longo prazo contêm principalmente células T de memória central em humanos e bovinos para realizar o ensaio de ponto L cultivado a longo prazo. 60 ml de sangue são coletados de animais infectados ou vacinados com M bovis por jugular, punção venosa e P BMCs são isolados por densidade. Centrifugação em gradiente.

A concentração celular deve ser ajustada para 4 milhões de células por ml. No meio RPMI completo, comece com o plaqueamento de 500 microlitros de antígenos microbacterianos, neste caso TB 10.4 e antígeno 85 A e o derivado proteico purificado da cultura em bovis chamado PPDB. Em seguida, adicione 500 microlitros de pbmc isolados de cada animal com quatro repetições por animal.

Observe que todos os poços devem ser estimulados. Controles como nenhuma estimulação ou mitógenos não são necessários nesta etapa, incubar a placa a 39 graus Celsius a temperatura normal do gado por 13 dias. Nos dias três e sete, descarte 500 microlitros de cada poço pipetando com cuidado para não perturbar a camada de células no fundo dos poços.

Reabasteça o volume com PMI completo contendo IL Dois. Coloque a placa na incubadora No dia 10, descarte 750 microlitros do sobrenadante de cada poço, reabasteça com RPMI completo sem nenhum IL dois no dia 12, pipete e descarte um ml de sobrenadante de cada poço reabastecido com RPMI completo sem IL dois. Prepare também a placa de ponto L a ser revestida com o anticorpo de captura IFM Gamma primeiro a pipetar 15 microlitros de álcool a 35% em cada poço usando um pipetador multicanal, esta etapa aumenta a definição do ponto.

Lave bem seis vezes com 300 microlitros de PBS. Adicione 100 microlitros de anticorpo de captura a oito microgramas por ml em PBS. A pipetagem deve ser feita com cuidado durante todos os procedimentos, não permitindo que as pontas das pipetas toquem ou danifiquem a membrana no fundo do poço, coloque a placa dentro de um saco plástico e incube a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia 13, coletar 60 ml de sangue por punção da veia jugular dos mesmos animais amostrados no primeiro dia. Isolar o pbmc e ajustar a concentração para 2 milhões de células por ml. Rotule a placa de ponto L corretamente para cada conjunto de samples.

Células de longo prazo mais APCs células de longo prazo sem APCs e células ex vivo. Descarte o anticorpo de captura dos poços de lavagem da placa Ellis com 300 microlitros de PBS contendo interpolação. Repita seis vezes, descarte, lave o fluido e pipete.

50 microlitros de p BMCs recém-isolados nos poços alocados para células de longo prazo. Além de APCs. Bloquear outros poços da placa de ponto L com 200 microlitros por poço de RPMI completo Avaliar o fenótipo de células por citometria de fluxo em paralelo com a placa de ensaio de ponto L.

50 microlitros de células recém-isoladas em uma placa de fundo redondo de 96 poços devidamente rotulada. Este é um ensaio auxiliar a ser realizado em conjunto com o ensaio de mancha amarela para determinar o fenótipo das células respondedoras. Incube as placas por 90 minutos a 39 graus Celsius em uma incubadora de 5% de CO2, permitindo que as células apresentadoras de antígenos adiram.

Incube também 200 ml de RPMI completo para aquecê-lo durante esta etapa de incubação de 90 minutos. Colha as células cultivadas a longo prazo da placa de 24 poços. Combinando as duplicatas quádruplas de cada animal em um único tubo cônico de 15 mil.

Centrifugue os tubos por cinco minutos a 400 Gs.Descarte o sobrenadante por inversão do tubo, desaloje o pellet celular e adicione cinco ml de PBS ressuspenda suavemente o pellet, se necessário. Lavar as células duas vezes e ajustar a concentração celular para 200 000 células por ml. Após a incubação de 90 minutos, retire a placa LPO e o RPMI completo da incubadora.

Coloque a placa LPO em um agitador de placas por 30 segundos. Em seguida, remova as células de não aderência por pipeta de inversão de placa 150 microlitros por poço de RPMI completo quente. Agite o prato e descarte o líquido de lavagem.

Repita três vezes, descarte o máximo de líquido possível e adicione cem microlitros por poço de cada antígeno nos poços apropriados contendo APCs aderentes. Em seguida, pipete 100 microlitros por poço de suspensão de células cultivadas de longo prazo. 200.000 células por ML nos poços rotulados como células de longo prazo mais APCs.

Certifique-se de que as células de longo prazo adicionadas nesta etapa sejam do mesmo animal que as APCs já existentes no poço. Não misture APCs e células cultivadas a longo prazo de diferentes animais. Além disso, pipete 100 microlitros por poço de suspensão de células cultivadas de longo prazo a uma concentração de 200.000 células por ml em poços sem APCs para avaliar as respostas de longo prazo.

Na ausência de apresentação de antígeno, adicione 100 microlitros por poço de células de curto prazo, além de recém-isoladas e ajustadas para 2 milhões de células por ML para avaliação da resposta ex vivo. Se estiver realizando a análise de citometria de fluxo, lave o fundo redondo 96, placa do poço e adicione as células e antígenos recém-isolados de longo prazo aos poços seguindo os mesmos procedimentos. Empregado para placas IFN Gamma LPO Incubate Plates durante a noite a 39 Celsius em uma incubadora de 5% CO2.

Certifique-se de que as placas estejam planas e não empilhe as placas no dia 14. Descarte os fluidos dos poços e placas de lavagem seis vezes com 300 microlitros por poço de PBS contendo interpolação colocada no agitador de placas a cada vez por 10 segundos antes e entre as lavagens. Em seguida, lave uma vez com o mesmo volume de água destilada e mais seis vezes com PBS contendo interpolação.

Finalmente, lave as células duas vezes com 300 microlitros por poço de PBS. Remova o fluido de lavagem batendo no prato em toalhas de papel ou absorventes. Adicionar 100 microlitros por poço de anticorpo de detecção a cinco microgramas por ml diluído em PBS com 1% de albumina sérica bovina.

Incube as placas por 120 minutos a 39 graus Celsius. Durante esta etapa de incubação, prepare a solução de fosfatase alcalina do padrão do kit VTA A BC AP seguindo as instruções do fabricante 30 minutos antes do uso ou 90 minutos após a adição do anticorpo de detecção aos alvéolos Diluir o reagente em PBS contendo tween após 120 minutos de incubação, descartar o anticorpo de detecção por placas de lavagem de inversão de placa seis vezes com 300 microlitros por poço de PBS contendo tween.

Remova o fluido de lavagem batendo no prato em toalhas de papel. Em seguida, adicione 100 microlitros por poço de solução alcalina de fosfatase. Incube as placas por 45 minutos em temperatura ambiente.

Descarte o fluido e lave cada placa seis vezes com interpolação contendo PBS. Prepare a solução de substrato do kit de substrato AP azul vetorial três seguindo as instruções do fabricante. Diluir os reagentes em tampão tris HCL 0,1 molar a pH 8,2.

Pipetar 50 microlitros de substrato D.Cada poço incubar à temperatura ambiente até que a cor azul comece a se desenvolver aproximadamente 30 minutos. Descarte o fluido e lave as placas com grandes quantidades de água destilada. Remova a placa inferior para expor a membrana de lavagem dos poços e deixe a placa secar ao ar.

Meça a resposta usando um analisador de imagem de ponto imunológico ou mantenha as placas no escuro em temperatura ambiente até que a resposta seja medida. Devido à alta estabilidade do substrato de reação, a qualidade é preservada por vários anos. Se avaliar o fenótipo e a resposta de citocinas por citometria de fluxo, realizar procedimentos de coloração padrão das células plaqueadas no fundo redondo 96, bem placa representativa TCM na presença ou ausência de APCs, tripulado ex vivo IFN gama L respostas de pontos de animais infectados e animais não infectados são mostrados.

As respostas específicas a m bovis são avaliadas por PBDB ou ESAT seis, estimulação antigênica CFP 10. As manchas no fundo das placas são o produto colorido do ensaio de manchas amarelas. Cada ponto normalmente representa uma célula produtora de citocinas individual, fornecendo uma medida quantitativa de células T produtoras de IFN gama com células de animais infectados.

As respostas pontuais de IFN gama L a longo prazo apresentadas como células formadoras de manchas ou SFCs são claramente visualizadas, pouca ou nenhuma produção de gama IFN em resposta à estimulação de antígenos é observada com células de bovinos não infectados e com células não estimuladas de bovinos infectados ou não infectados. A resposta robusta das células T deve ocorrer em resposta ao mitogênio da erva daninha, conforme mostrado TCM e respostas ex vivo ao PPDB e ESAT seis. CCFP 10 foram detectados em todos os animais infectados com 3M bovis e respostas mínimas ou inexistentes de TCM e ex vivo foram detectadas no animal de controle.

A presença de APCs foi necessária para respostas ideais da MTC por animais infectados, conforme demonstrado pelas respostas muito reduzidas por células cultivadas a longo prazo. Na ausência de APCs autólogas, células formadoras de manchas de animais infectados e não infectados por em, bovis foram apresentados. O número de SFCs de cada animal foi calculado por um número médio de SFCs em 10 elevado à sexta células em amostras duplicadas em resposta ao PPDB menos a respectiva resposta apenas ao meio as respostas diferiram com base no status da infecção, presença ou ausência de APCs e duração da cultura, ou seja, a cultura de longo prazo versus cultura ex vivo.