Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo

O objetivo geral deste artigo de métodos é apresentar os protocolos detalhados utilizados em nosso laboratório para estudar o reconhecimento molecular de RNAs de fita dupla por ácidos nucleicos peptídicos quimicamente modificados. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia química do RNA, como a detecção e o direcionamento de estruturas de RNA. A principal vantagem desta técnica é que os princípios de design podem ser aplicáveis ao direcionamento de qualquer estrutura de dupla hélice de RNA.

Demonstrará o procedimento Desiree Toh, uma pesquisadora associada do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, adicione quatro microlitros de uma solução de glicerol a 35% a amostras de RNA-PNA previamente preparadas e misture suavemente. Usando uma micropipeta e ponteiras para carregamento de géis, transfira cuidadosamente 20 microlitros de cada amostra para um gel de poliacrilamida previamente preparado, certificando-se de não introduzir bolhas de ar.

Execute o gel a uma voltagem constante de 250 volts durante cinco horas. Após cinco horas, desligue a fonte de alimentação e remova a placa de vidro do suporte do gel. Em seguida, remova a fita selante do gel e desmonte a placa de vidro.

Remova cuidadosamente o gel da placa de vidro e coloque-o em um recipiente contendo 350 mililitros de água desionizada. Adicione cuidadosamente 35 microlitros de brometo de etídio ao recipiente e coloque-o no agitador orbital em velocidade baixa por 30 minutos. Após descartar a solução de brometo de etídio, enxágue o gel com 1,5 a dois litros de água destilada.

Em seguida, escaneie o gel usando um sistema de imagem com laser verde de 532 nanômetros e filtro de emissão ajustado a 610 nanômetros. Quantifique as intensidades das bandas do gel utilizando software gratuito. Transfira a quantidade apropriada de RNA duplo-fixo marcado com 2-aminopurina para um tubo limpo de 1,5 mililitro.

Em seguida, concentre as soluções de RNA utilizando um concentrador a vácuo. Depois, transfira os volumes apropriados da PNA alvo para várias concentrações do estoque principal previamente preparado para tubos separados de 1,5 mililitro. Concentre as soluções de PNA usando o concentrador a vácuo.

Adicione 975 microlitros de tampão de incubação ao tubo contendo o RNA seco e misture bem para garantir que todo o RNA seja dissolvido. Após uma breve centrifugação da solução de RNA, submeta-a ao emparelhamento colocando o tubo em um bloco térmico pré-aquecido por 10 minutos. Ao finalizar, desligue o bloco térmico e deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente.

Adicione 75 microlitros de RNA a cada um dos tubos contendo a PNA seca e misture bem. Após deixar as amostras em repouso à temperatura ambiente por pelo menos uma hora, incube-as a quatro graus Celsius durante a noite. Agora, transfira as quantidades apropriadas de RNA de fita simples marcado com 2-aminopurina para tubos separados de 1,5 mililitro.

Transfira os volumes apropriados de PNA direcionado para várias concentrações do estoque principal para os tubos respectivos contendo o RNA de fita simples. Após secar as amostras, adicione 75 microlitros de tampão de incubação a cada um dos tubos e misture bem. Submeta cada amostra ao emparelhamento colocando cada tubo em um bloco de aquecimento pré-aquecido por 10 minutos.

Após deixar as amostras esfriarem até a temperatura ambiente, incube-as a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, transfira 70 microlitros de cada amostra para uma cubeta quadrada de um centímetro. Coloque a cubeta em um espectrofotômetro de fluorescência e meça a emissão na faixa de comprimento de onda de 330 a 550 nanômetros.

Após a conclusão da medição, remova o tampão da cubeta. Enxágue a cubeta com água destilada e seque com gás nitrogênio. Após repetir a medição para todas as amostras, construa um gráfico da intensidade de fluorescência em função do comprimento de onda.

Transfira as quantidades apropriadas de RNA de fita simples para tubos separados de 1,5 mililitro. Em seguida, transfira os volumes apropriados de PNA direcionado do estoque principal para os tubos respectivos contendo o RNA de fita simples. Após a secagem das amostras, adicione 130 microlitros de tampão de incubação a cada um dos tubos e misture bem.

Sujeite cada amostra ao pareamento, colocando cada tubo em um bloco térmico pré-aquecido por 10 minutos. Após deixar as amostras esfriarem até a temperatura ambiente, incube-as a quatro graus Celsius durante a noite. Agora, transfira 130 microlitros de cada amostra para uma cubeta de oito microcélulas, com uma célula contendo tampão de incubação.

Utilizando um espectrofotômetro UV-Vis, meça a absorbância de cada amostra a 260 nanômetros. Meça com aumento da temperatura de 15 a 95 graus Celsius, seguido por diminuição da temperatura de 95 a 15 graus Celsius, com uma taxa de rampa de 0,5 grau Celsius por minuto. Os oligômeros de PNA foram obtidos após duas purificações por HPLC em fase reversa.

A identidade das PNAs pode ser confirmada por análise MALDI/TOF. Os dados de eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante sugerem que a PNA modificada com Q e L pode reconhecer apenas a região de RNA de dupla fita com um par C-G. Esse reconhecimento específico e aprimorado ocorre por meio da formação de um tríplice com base na sequência T-A-U-L-G-C e na interação Q-C-G entre PNA e RNA.

Um estudo de titulação por fluorescência de 2-aminopurina mostrou que uma PNA modificada com Q e L se liga a um RNA de dupla fita alvo, mas não ao RNA de fita simples. As PNAs contendo resíduos Q não apresentam transições de fusão térmica, sugerindo ausência de ligação ao RNA de fita simples devido ao choque estérico no par Q-G semelhante ao de Watson-Crick. Em comparação com a PNA não modificada P1, as PNAs P4 e P5 contendo resíduos L apresentam uma temperatura de fusão mais baixa para os respectivos dímeros RNA-PNA devido ao choque estérico no par L-G semelhante ao de Watson-Crick.

Os dados de fusão térmica detectados por absorvância UV são consistentes com os dados de titulação de fluorescência da 2-aminopurina, que também mostram que um PNA contendo resíduos Q e L não se liga fortemente ao RNA de fita simples. A incorporação de uma base Q é mais desestabilizadora do que uma base L, pois a base Q apresenta um choque estérico mais significativo na formação de um par Q-G semelhante ao par de Watson-Crick. Após dominar as técnicas, os diversos experimentos podem ser realizados em uma semana, se executados corretamente.

Após este procedimento, outros métodos, como a detecção e o direcionamento de estruturas de RNA em células, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se podemos detectar estruturas de RNA e regular as funções do RNA utilizando PNAs que se ligam a RNA de fita dupla. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia do RNA e de doenças explorarem o desenvolvimento de terapias direcionadas à estrutura do RNA.