Name: Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a reconhecer RNAs de dupla-fita usando ácidos nucleicos de peptídeo modificados. Este método permite estudar interações específicas com RNAs de fita simples em biologia química de RNA.

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Este trabalho foi financiado pela Singapore Ministério da educação (MOE) nível 1 (RGT3/13 e 15/RG42 para games) e MOE Tier 2 (T2-024-2-MOE2013 e MOE2015-T2-1-028 para games).

Tem sido apresentado um pedido de patente (PAT/179/14/15/PCT) baseado no trabalho relatado aqui.

Oligómeros PNA de ligação duplex RNA (por exemplo, 10-mers) são moléculas médias e assim pode mostrar mudança de mobilidade electrophoretic mediante vinculação de RNAs com um tamanho comparável ou ligeiramente maior (por exemplo, 50-mer ou menor). Se um RNA é significativamente maior do que a ANP, titulação de PNA em RNA pode não funcionar devido a uma mudança de mobilidade limitada de gel. Assim, o RNA grande pode ser truncado para os ensaios de página não-desnaturação. Titulação de uma grande RNA em um fluoróforo-rotulado PNA permite o acompanhamento da formação triplex por um gel de agarose não-desnaturação com a amostra carregada no meio do gel de40.
Para uma experiência de titulação por página não-desnaturação com uma constante concentração total do RNA, geralmente usamos uma concentração de RNA sem rótulo de 1 µM para post eficiente coloração do RNA livre e bandas triplex por brometo de etídio. Uma concentração de RNA tão baixa quanto 0,2 µM pode também ser suficiente dependendo do RNA construção31. A concentração do RNA sem rótulo (0,2 µM) determina que os valores de Kd que podem ser medidos com precisão devem ser cerca de 0,2 µM ou maior. Outros corantes de coloração podem ser usados para melhorar a eficiência de coloração. Alternativamente, os nossos dados não publicados sugerem que Cy3 tingir-etiquetados RNAs pode ser usado em experimentos de página não-desnaturação para medir os eventos de ligação de apertado.
Devido ao fato de que 2-aminopurina é apenas moderadamente fluorescente, 2-aminopurina titulação de fluorescência também é limitada para a medição da vinculação com valores ded Kpróxima ou acima de 0,2 µM31. O RNA ou o PNA pode ser rotulado com uma tintura relativamente brilhante para quantificar uma ligação relativamente apertado em solução através da titulação de fluorescência, se a vinculação resulta em alterações na fluorescência sinais53,54, 55.
A estratégia de segmentação de estruturas de RNA pela ligação de dsRNA PNAs foi testada por um número limitado de RNAs. É provável que Propriedades de vinculação podem variar para dsRNAs com diferentes composições de sequências e pares de base. Um pode sempre escolher strand de um duplex para a concepção de TFPNAs ricos em purinas. É de fundamental importância compreender como consecutivos Q· C-G triplos podem afetar a estabilidade de um triplex. Mais extensos estudos de sequência dependente claramente são necessários para compreender as propriedades de vinculação dependente da sequência de TFPNAs.
A afinidade obrigatória da TFPNAs pode ser reforçada pelo aumento do comprimento e/ou modificando ainda mais as bases e backbones56,57 de TFPNAs. No entanto, uma região contínua frente e verso pode não muitas vezes consistem em mais de 10 pares de bases consecutivas sem interrupção por estruturas não-Watson-Crick. Um pode conjugar TFPNAs com pequenas moléculas de reconhecimento de não-Watson-Crick estruturas adjacentes às regiões dsRNA. Em princípio, um conjugado de molécula TFPNA-pequeno deverá ter aprimorado vinculação afinidade e especificidade em comparação com um TFPNA ou pequena molécula sozinha. No entanto, as propriedades físicas e químicas do vinculador para a conjugação58,59,60,61,,62,63,64 deve ser otimizado.
O fato de que TFPNAs pode seletivamente ligar a dsRNAs sobre ssRNAs e dsDNAs sugere que é possível desenvolver TFPNAs como sondas químicas muito útil e potenciais terapêuticos ligantes através da regulação da dinâmica estrutural do RNA e interações com proteínas e metabólitos. Absorção celular de TFPNAs pode ser facilitada através da conjugação com penetração celular partes tais como pequenas moléculas, peptídeos e nanopartículas, ou complexação com estruturas supramoleculares como lipossomas5,6 ,12,17,25,31,41,,65,66. Mais functionalization de TFPNAs com bioimaging tags como fluorophores e radioisótopos pode facilitar a detecção, imagem latente e do posicionamento das estruturas funcionais de RNA em organismos vivos.

RNAs estão emergindo como importantes biomarcadores e alvos terapêuticos, devido aos avanços recentes em descobertas de funções dos RNAs na regulação e catálise de diversos processos biológicos,1,2,3. Tradicionalmente, vertentes antisentidos têm sido utilizados para ligar a ssRNAs através de Watson-Crick formação duplex3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. recentemente, triplex-formando ácidos nucleicos peptídeo (TFPNAs) foram projetados para ligar a dsRNAs através de estruturas (Figura 1)3,28,29de hidrogénio. regiões de dsRNA estão presentes na maioria dos RNAs antisentido-alvo tradicionais, incluindo mRNAs, pre-pre-mRNAs ou pri-miRNAs3e muitos outros não-codificantes RNAs1,26,27. Visando dsRNAs através da formação de tripla hélice usando o TFPNAs pode ser vantajoso devido à sua especificidade de estrutura e é de grande potencial para uso em restaurar as funções normais dos RNAs, que são a desregulação nas doenças, por exemplo.
O recentemente publicado trabalho de Rozners et ale nos3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, relatou os esforços na melhoria a ligação seletiva de TFPNAs modificados para dsRNAs com maior afinidade. Desenvolvemos métodos de síntese de monômeros PNA racionalmente projetados (Figura 2) incluindo thio-pseudoisocytosine (L) monômero30 e monômero de guanidina-modificado 5-metil-citosina (Q)31. Através de vários métodos de Caracterização bioquímica e biofísica, demonstrámos que relativamente curtos PNAs (resíduos de 6-10), incorporando resíduos L e Q mostram reconhecimento melhorado de pares de bases Watson-Crick G-C e C-G, respectivamente, em dsRNAs. Além disso, comparado a PNAs não modificados, PNAs que contenham resíduos de L e Q mostram vinculação mais seletiva para dsRNA ssRNA e dsDNA. A funcionalidade de guanidina42 na base Q permite PNAs entrar de células HeLa31.
Em nosso laboratório, podemos sintetizar PNAs pelo manual Boc-química (Boc ou t- COB defende tert-butyloxycarbony4método síntese do peptídeo de fase sólida (ver Figura 2). A síntese do monômero PNA com Boc como proteger o grupo amina é conveniente, como o grupo Boc é estericamente menos volumoso em comparação com fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) amina, protegendo o grupo, que pode ser benéfico durante monômero PNA acoplamento a suporte sólido. O grupo Boc é ácido-lábil e pode ser facilmente removido com o sólido apoio por 20-50% de ácido trifluoroacético (TFA) em diclorometano (DCM) durante a síntese PNA. Um sintetizador de peptídeo automatizado pode ser empregado para sintetizar oligómeros PNA; no entanto, 3-5-fold excesso de monômero PNA é necessária para um sintetizador de peptídeo automatizado. Manual síntese requer significativamente menos monômero PNA (excesso de 2-3-fold), com cada acoplamento facilmente monitorado pelo Kaiser teste43. Além disso, muitos sintetizadores automatizados não são compatíveis com a síntese de estratégia do COB devido ao uso de TFA corrosivo durante a etapa de remoção do Boc.
Os oligómeros PNA podem ser purificados por reverso-fase alta-cromatografia líquida (HPLC-RP) seguida por peso molecular caracterização por MALDI-TOF (figuras 3 e 4)30, 31. empregamos página não-desnaturação para monitorar a formação triplex, devido ao fato de que livre duplex RNA constrói e PNA vinculado triplexes frequentemente mostra migração diferentes taxas (Figura 5)30,31 . Não há rotulagem é necessário se eficiente pós-coloração pode ser alcançado para ambos o RNA frente e verso e PNA· Bandas de triplex2 RNA. Uma relativamente pequena quantidade de amostra é necessária para experimentos de página não-desnaturação. No entanto, os buffers de carregamento (incubação) e os buffers da execução (pH 8,3) podem não ser o mesmo, resultando nas medições limitadas as triplexes cineticamente estáveis, porque um pH relativamente alto de 8.3 significativamente pode desestabilizar um triplex.
2-aminopurina é um isômero da adenina (6-aminopurina); a intensidade de fluorescência 2-aminopurina (com um pico de emissão em cerca de 370 nm) é sensível às mudanças de ambiente estrutural local e é apropriado para o acompanhamento da formação triplex com o resíduo de 2-aminopurina incorporados perto o PNA (sítio de ligação A Figura 6) 31. ao contrário de muitos outros corantes que mostram a emissão de fluorescência na faixa visível, 2-aminopurina-etiquetados RNA pode ser exposto a luz do quarto sem foto branqueamento. Ao contrário de experimento da página em que uma execução tampão de pH 8.3 é muitas vezes necessária, 2-aminopurina com base em titulação de fluorescência permite a medição da ligação em uma solução com um pH especificado e assim pode permitir a medição e a detecção de relativamente fraco e cineticamente instável ligação em equilíbrio.
Experiências de fusão térmicas UV-absorvância-detectado permitem a medição da estabilidade térmica de duplex (Figura 7)31 e triplexes30,32,44,45. Dependendo da composição de comprimento e sequência, o derretimento de triplexes pode ou não mostrar uma transição clara. Parâmetros termodinâmicos podem ser obtidos se se sobrepõem as curvas de aquecimento e resfriamento. Parâmetros termodinâmicos precisos podem ser obtidos por titulação isotérmica (ITC) a calorimetria32; no entanto, relativamente grandes quantidades de amostras são geralmente necessárias para ITC.

<table><tbody><tr><td>Peneiras moleculares, 4A, pellets de 1-2 mm de diâmetro&nbsp;</td>Cloridrato de 4-Metilbenzhidrilamina <td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>(MBHA&Yuml; HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr>(<tr><td>Benzotriazol-1-il-oxi)tripirrolidinofosfônio hexafluorofosfato (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>Anhyride acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Test Kit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td> <td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>Monômeros PNA não modificados</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys (Z) -OH / Fmoc-Lys (Boc) -OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Tioanisol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Trifluorometanossulfônico</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&reg; 100 RP-18 endcappped (5 &micro; m) LiChroCART&reg; 250-4</td><td>Merck Millipore</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>RNA Oligos&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Personalizado&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ácido &alfa;-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N'-metilenobisacrilamida</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>146072</tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td> <td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td> <td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tris-Borato-EDTA (TBE) Tampon, pH 8.3</td><td>1ª Base</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio (10 mg/mL)</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>Célula de Alta Precisão (Quartzo Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

reconhecimento de sequência específica e seletivo de rnas double-stranded sobre single-stranded rna por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs estão emergindo como importantes biomarcadores e alvos terapêuticos. Assim, há grande potencial no desenvolvimento de sondas químicas e terapêuticas ligantes para o reconhecimento da estrutura e sequência de RNA. Quimicamente modificados peptídeo ácido nucleico (PNA) oligómeros foram recentemente desenvolvidos que pode reconhecer os duplex RNA em uma maneira sequência-específica. PNAs são quimicamente estável com um backbone de peptídeo-como neutro. PNAs pode ser sintetizada relativamente facilmente pelo método de síntese do peptide de fase sólida Boc-química de manual. PNAs é purificada por HPLC de fase reversa, seguida pelo peso molecular caracterização do laser assistida por matriz dessorção/ionização-tempo de voo (MALDI-TOF). Técnica de eletroforese (página) do gel de polyacrylamide Non-desnaturação facilita a imagem da formação triplex, porque cuidadosamente projetado, frente e verso livre RNA constrói e PNA vinculado triplexes frequentemente mostrar taxas de migração diferentes. PÁGINA de non-desnaturação com brometo de etídio post coloração é muitas vezes uma técnica fácil e informativa para caracterizar as afinidades de ligação e especificidades de oligômeros PNA. Normalmente, vários ganchos de RNA ou duplex com mutações de único par de base podem ser usados para caracterizar Propriedades de vinculação de PNA, tais como ligação de afinidades e especificidades. 2-aminopurina é um isômero da adenina (6-aminopurina); a intensidade de fluorescência 2-aminopurina é sensível às mudanças de ambiente estrutural local e é apropriada para o acompanhamento da formação triplex com o resíduo de 2-aminopurina incorporado perto do local de ligação do PNA. 2-aminopurina titulação de fluorescência também pode ser usada para confirmar a seletividade de vinculação da PNAs modificadas no sentido de alvo RNAs double-stranded (dsRNAs) sobre single-stranded RNA (ssRNAs). Experiências de fusão térmicas UV-absorvância-detectado permitem a medição da estabilidade térmica de duplex PNA-RNA e PNA· Triplex de2 do RNA. Aqui, descrevemos a síntese e purificação de oligômeros PNA incorporando modificado de resíduos e descrever métodos bioquímicos e biofísicos para a caracterização do reconhecimento dos duplex RNA pelas PNAs modificados.

HPLC de fase reversa permite a purificação de oligômeros PNA. Podemos obter puros oligómeros PNA com duas rodadas de purificação HPLC (Figura 3). A identidade das PNAs pode ser confirmada pela análise de MALDI-TOF (Figura 4).
PÁGINA de non-desnaturação é uma técnica fácil e informativa para caracterizar as afinidades de ligação e especificidades de oligômeros PNA. Normalmente usamos vários ganchos de RNA ou duplex com mutações de único par de base para caracterizar Propriedades de vinculação (Figura 5). Os dados não-desnaturação da página mostrados na Figura 5 claramente sugerem que o Q - e L-modificado PNA pode reconhecer uma região dsRNA com um par de C-G (Figura 5B, painel de fundo) mas não a uma mulher sem um par de C-G (Figura 5B, top painel). Este reconhecimento específico e aprimorado é através do T· A-U, L· G-C e Q· C-G PNA· Formação de base tripla (Figura 1A, C, D) do RNA2 . Vários PNAs com mutações simples ou múltipla também podem ser usados para demonstrar as propriedades de ligação melhorada de um PNA modificado. Mostramos que adicionar 2 mM Mg2 + no buffer de incubação não afeta a ligação significativamente31.
Temos demonstrado por titulação de fluorescência 2-aminopurina que um PNA Q - e L-modificado é vinculado a uma região alvo dsRNA (Figura 6A, 6C, 6D) mas não ssRNA (Figura 6B, 6E, 6F). PNA P3 vincula o dsRNA 2-aminopurina-rotulado com um valor ded Kde 0,8 ± 0,1 µM. A intensidade de fluorescência a 370 nm para a 2-aminopurina-rotulado ssRNA permanece relativamente constante com variada concentração de P3, indicando a falta de vinculação de PNA P3 para o ssRNA.
PNAs contendo show de resíduos (P2 e P3) Q não térmico derretendo transições (Figura 7), sugerindo não vinculativo para o ssRNA. Isto é devido ao impedimento estérico confronto presente em Watson-Crick, como Q-G par. Comparado a P1 de PNA não modificado, PNAs P4 e P5 contendo modificado L resíduos mas sem resíduos Q, mostrar diminuiu temperaturas de fusão para os duplex RNA-PNA correspondentes devido o impedimento estérico confronto presente em Watson-Crick como L-G par. Os dados de fusão térmicos UV-absorvância-detectado são consistentes com os dados de titulação de fluorescência 2-aminopurina, que também mostram que um PNA que contenham resíduos Q e L não se vincula a ssRNA sensivelmente (Figura 6B, 6E, 6F). Incorporando uma base Q é mais desestabilizador do que uma base de L, como uma base Q tem um confronto estérico mais significativo na formação de um par de Watson-Crick-como Q-G (Figura 1-F), em comparação com um par de Watson-Crick-como L-G (Figura 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Figura 1 : Estruturas químicas das estruturas de pares de base base estável da tripla e instável. (A-D) Major-sulco PNA· Triplica o RNA2 base de T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) e Q· C-G (D). (E, F) Watson-Crick instável como pares de bases do RNA-PNA de L-G (E) e Q-G (F). A letra R representa a espinha dorsal de açúcar-fosfato do RNA. Ligações de hidrogênio são indicadas por linhas tracejadas pretas. A figura é reproduzida de referência31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Figura 2 : Estruturas químicas dos monômeros PNA. Quatro monômeros PNA (T, C, L e Q) são mostrados. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Figura 3 : Estrutura química de um oligómero PNA e purificação por RP-HPLC. (A) estrutura química da sequência PNA P3. (B, C) Dados de RP-HPLC de bruto PNA P3 (B) e re-purificado PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Figura 4 : Espectro de MALDI-TOF de purificado PNA P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Figura 5 : Prendendor de RNA e sequências PNA e caracterização de ligação por página não-desnaturação. Ganchos de cabelo (A), RNA (rHP1 e rHP2), PNA P3 e um PNA· RNA2 triplex formado entre PNA P3 e rHP2. (B) página de Non-desnaturação (12%) resultados para rHP1 e rHP2 ligação para PNA P3. O buffer de incubação é de 200 mM de NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. Os grampos de RNA carregados (rHP1 e rHP2) são de 1 µM em 20 µ l. As concentrações de ANP nas pistas da esquerda para a direita são 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, e 50 µM. PNA P3 não ligar para rHP1 (painel superior) mas vincula a rHP2 (painel inferior). (C) Kd determinação para P3 ligação para rHP2. A fração de formação triplex (Y) foi plotada contra a concentração de PNA. A figura é uma adaptação de referência31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Figura 6 : Estudo de titulação de fluorescência de PNA P3 vinculaçãoa 2-aminopurina-rotulado RNAs. O resíduo de 2-aminopurina é designado como '2', na sequência de RNA. O buffer de incubação é de 200 mM de NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. (), Um PNA· RNA2 triplex formado entre P3 e um 2-aminopurina-rotulado dsRNA (dsRNA2-2AP). (B) uma hipotética duplex de PNA-RNA formado entre P3 e um 2-aminopurina-rotulado ssRNA (ssRNA2-2AP). (C, E) Espectros de emissão de fluorescência para a 2-aminopurina-etiquetados RNA frente e verso (1 µM) e ssRNA (1 µM), respectivamente, com variadas P3 concentração em pH 7,5. O pico em cerca de 475 nm é devido a emissão de fluorescência fraca da base L da ANP. (D, F) K d determinação baseia-se nas parcelas da intensidade de fluorescência 2-aminopurina (a 370 nm) do duplex RNA e ssRNA, respectivamente, contra a concentração de PNA P3. A figura é uma adaptação de referência31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Figura 7 : Thermal derretendo resultados para duplex RNA-PNA. O buffer de incubação é de 200 mM de NaCl, 0.5 mM EDTA, 20mm NaH2PO4, pH 7,5. Todas as amostras contêm 5 µM de single-stranded do RNA (ssRNA1) e PNA em 130 µ l. (A) Single-stranded do RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 e P5) e um hipotético duplex de PNA-RNA formado entre PNA P3 e ssRNA1 em uma orientação paralela. O confronto estérico é indicado para o Watson-Crick como Q-G e L-G pares. (B) fusão curvas para diferentes PNAs ligação a ssRNA1. As temperaturas de fusão são mostradas para as curvas com transições de derretimento. A figura é uma adaptação de referência31.

Nós relatamos os protocolos para a síntese e purificação de oligômeros de peptídeo ácido nucleico (PNA) incorporando modificado de resíduos. São descritos os métodos bioquímicos e biofísicos para a caracterização do reconhecimento dos duplex RNA pelas PNAs modificados.

Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

O objetivo geral deste artigo de métodos é apresentar os protocolos detalhados utilizados em nosso laboratório para estudar o reconhecimento molecular de RNAs de fita dupla por ácidos nucleicos peptídicos quimicamente modificados. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia química do RNA, como a detecção e o direcionamento de estruturas de RNA. A principal vantagem desta técnica é que os princípios de design podem ser aplicáveis ao direcionamento de qualquer estrutura de dupla hélice de RNA.Demonstrará o procedimento Desiree Toh, uma pesquisadora associada do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, adicione quatro microlitros de uma solução de glicerol a 35% a amostras de RNA-PNA previamente preparadas e misture suavemente. Usando uma micropipeta e ponteiras para carregamento de géis, transfira cuidadosamente 20 microlitros de cada amostra para um gel de poliacrilamida previamente preparado, certificando-se de não introduzir bolhas de ar.Execute o gel a uma voltagem constante de 250 volts durante cinco horas. Após cinco horas, desligue a fonte de alimentação e remova a placa de vidro do suporte do gel. Em seguida, remova a fita selante do gel e desmonte a placa de vidro.Remova cuidadosamente o gel da placa de vidro e coloque-o em um recipiente contendo 350 mililitros de água desionizada. Adicione cuidadosamente 35 microlitros de brometo de etídio ao recipiente e coloque-o no agitador orbital em velocidade baixa por 30 minutos. Após descartar a solução de brometo de etídio, enxágue o gel com 1,5 a dois litros de água destilada.Em seguida, escaneie o gel usando um sistema de imagem com laser verde de 532 nanômetros e filtro de emissão ajustado a 610 nanômetros. Quantifique as intensidades das bandas do gel utilizando software gratuito. Transfira a quantidade apropriada de RNA duplo-fixo marcado com 2-aminopurina para um tubo limpo de 1,5 mililitro.Em seguida, concentre as soluções de RNA utilizando um concentrador a vácuo. Depois, transfira os volumes apropriados da PNA alvo para várias concentrações do estoque principal previamente preparado para tubos separados de 1,5 mililitro. Concentre as soluções de PNA usando o concentrador a vácuo.Adicione 975 microlitros de tampão de incubação ao tubo contendo o RNA seco e misture bem para garantir que todo o RNA seja dissolvido. Após uma breve centrifugação da solução de RNA, submeta-a ao emparelhamento colocando o tubo em um bloco térmico pré-aquecido por 10 minutos. Ao finalizar, desligue o bloco térmico e deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente.Adicione 75 microlitros de RNA a cada um dos tubos contendo a PNA seca e misture bem. Após deixar as amostras em repouso à temperatura ambiente por pelo menos uma hora, incube-as a quatro graus Celsius durante a noite. Agora, transfira as quantidades apropriadas de RNA de fita simples marcado com 2-aminopurina para tubos separados de 1,5 mililitro.Transfira os volumes apropriados de PNA direcionado para várias concentrações do estoque principal para os tubos respectivos contendo o RNA de fita simples. Após secar as amostras, adicione 75 microlitros de tampão de incubação a cada um dos tubos e misture bem. Submeta cada amostra ao emparelhamento colocando cada tubo em um bloco de aquecimento pré-aquecido por 10 minutos.Após deixar as amostras esfriarem até a temperatura ambiente, incube-as a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, transfira 70 microlitros de cada amostra para uma cubeta quadrada de um centímetro. Coloque a cubeta em um espectrofotômetro de fluorescência e meça a emissão na faixa de comprimento de onda de 330 a 550 nanômetros.Após a conclusão da medição, remova o tampão da cubeta. Enxágue a cubeta com água destilada e seque com gás nitrogênio. Após repetir a medição para todas as amostras, construa um gráfico da intensidade de fluorescência em função do comprimento de onda.Transfira as quantidades apropriadas de RNA de fita simples para tubos separados de 1,5 mililitro. Em seguida, transfira os volumes apropriados de PNA direcionado do estoque principal para os tubos respectivos contendo o RNA de fita simples. Após a secagem das amostras, adicione 130 microlitros de tampão de incubação a cada um dos tubos e misture bem.Sujeite cada amostra ao pareamento, colocando cada tubo em um bloco térmico pré-aquecido por 10 minutos. Após deixar as amostras esfriarem até a temperatura ambiente, incube-as a quatro graus Celsius durante a noite. Agora, transfira 130 microlitros de cada amostra para uma cubeta de oito microcélulas, com uma célula contendo tampão de incubação.Utilizando um espectrofotômetro UV-Vis, meça a absorbância de cada amostra a 260 nanômetros. Meça com aumento da temperatura de 15 a 95 graus Celsius, seguido por diminuição da temperatura de 95 a 15 graus Celsius, com uma taxa de rampa de 0,5 grau Celsius por minuto. Os oligômeros de PNA foram obtidos após duas purificações por HPLC em fase reversa.A identidade das PNAs pode ser confirmada por análise MALDI/TOF. Os dados de eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante sugerem que a PNA modificada com Q e L pode reconhecer apenas a região de RNA de dupla fita com um par C-G. Esse reconhecimento específico e aprimorado ocorre por meio da formação de um tríplice com base na sequência T-A-U-L-G-C e na interação Q-C-G entre PNA e RNA.Um estudo de titulação por fluorescência de 2-aminopurina mostrou que uma PNA modificada com Q e L se liga a um RNA de dupla fita alvo, mas não ao RNA de fita simples. As PNAs contendo resíduos Q não apresentam transições de fusão térmica, sugerindo ausência de ligação ao RNA de fita simples devido ao choque estérico no par Q-G semelhante ao de Watson-Crick. Em comparação com a PNA não modificada P1, as PNAs P4 e P5 contendo resíduos L apresentam uma temperatura de fusão mais baixa para os respectivos dímeros RNA-PNA devido ao choque estérico no par L-G semelhante ao de Watson-Crick.Os dados de fusão térmica detectados por absorvância UV são consistentes com os dados de titulação de fluorescência da 2-aminopurina, que também mostram que um PNA contendo resíduos Q e L não se liga fortemente ao RNA de fita simples. A incorporação de uma base Q é mais desestabilizadora do que uma base L, pois a base Q apresenta um choque estérico mais significativo na formação de um par Q-G semelhante ao par de Watson-Crick. Após dominar as técnicas, os diversos experimentos podem ser realizados em uma semana, se executados corretamente.Após este procedimento, outros métodos, como a detecção e o direcionamento de estruturas de RNA em células, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se podemos detectar estruturas de RNA e regular as funções do RNA utilizando PNAs que se ligam a RNA de fita dupla. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia do RNA e de doenças explorarem o desenvolvimento de terapias direcionadas à estrutura do RNA.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Alta capacidade seletiva 2 'acilação hidroxila analisados ​​por extensão primer (SHAPE) utiliza um romance químico sondagem tecnologia, transcrição reversa, eletroforese capilar e software de predição de estrutura secundária para determinar as estruturas de RNAs de várias centenas a vários milhares de nucleotídeos em única resolução de nucleotídeos.

RNA Secundária Previsão Estrutura Usando SHAPE de alta capacidade

as interações RNA-proteína estão no centro de muitos processos celulares. Aqui, descrevemos um método in vivo para isolar RNA específico e identificar novas proteínas associadas a ele. Isso pode lançar uma nova luz sobre como os RNAs são regulados na célula.

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Este método de suspenso de RNA permite identificar os alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA (lncRNA). Baseado na hibridação de caseiras, concebidas antido sentidas oligonucleotide sondas de DNA específicas para este lncRNA em um tecido apropriadamente fixo ou linha de células, com eficiência permite a captura de todos os alvos de RNA do lncRNA.

Procedimento de Pull-down de RNA para identificar alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA

Double-stranded do RNA produzido durante a replicação de vírus de RNA pode ser reconhecido por receptores de reconhecimento padrão para induzir uma resposta imune inata. Para vírus de RNA de sentido negativo, a interação entre o baixo nível de dsRNA e PRRs permanece obscura. Nós desenvolvemos um método de microscopia confocal para visualizar dsRNA arenavírus e PRR em células individuais.

Imagem latente confocal de RNA Double-Stranded e receptores de reconhecimento padrão na infecção pelo vírus de RNA de sentido negativo

A especificidade da sequência é fundamental para a regulação genética. As proteínas reguladoras que reconhecem sequências específicas são importantes para a regulação genética. Definir locais de ligação funcionais para essas proteínas é um problema biológico desafiador. Uma aproximação iterativo para a identificação de um local obrigatório para uma proteína RNA-obrigatória é descrita aqui e é aplicável a todas as proteínas RNA-obrigatórias.

Explorando o espaço de seqüência para identificar sites de vinculação para proteínas reguladoras de ligação de RNA

MALDI-TOF foi utilizado para caracterizar fragmentos obtidos a partir da reatividade entre o RNA oxidado e o exoribonuclease Xrn-1. O presente protocolo descreve uma metodologia que pode ser aplicada a outros processos envolvendo RNA e/ou DNA.

Identificação de fragmentos de RNA resultantes da degradação enzimática usando espectrometria de massa MALDI-TOF

Oligonucleotídeos 5'-triphosfatos são componentes onipresentes em vias biológicas essenciais e têm visto o uso crescente em aplicações de biotecnologia. Aqui, descrevemos técnicas para a síntese de rotina e purificação de oligonucleotídeos 5'-triphosphates, a partir de oligonucleotídeos preparados por técnicas de síntese automatizada padrão.

Triphosforilação química de Oligonucleotídeos

O presente protocolo demonstra o uso de um ensaio rápido de amplificação exponencial baseado em aptâmeros de 3 estágios para detectar alvos. A preparação da amostra, a amplificação do sinal e o desenvolvimento da cor são abordados para implementar este sistema para reconhecer a presença de teofilina sobre a cafeína.

Detecção de alvos baseada em aptâmero facilitada por uma reação de amplificação exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 estágios

As nanomáquinas baseadas em DNAzyme podem ser usadas para detecção altamente seletiva e sensível de ácidos nucléicos. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o projeto de nanomáquinas baseadas em DNAzyme com um núcleo 10-23 usando software livre e sua aplicação na detecção de um fragmento de vírus Epstein-Barr como exemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas baseadas para reconhecimento de ácidos nucleicos

Aprenda a reconhecer RNAs de dupla-fita usando ácidos nucleicos de peptídeo modificados. Este método permite estudar interações específicas com RNAs de fita simples em biologia química de RNA.

Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo (Vídeo) | JoVE Journal

Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo

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