Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo

O objetivo geral deste artigo sobre métodos é apresentar os protocolos detalhados utilizados por nosso laboratório para estudar o reconhecimento molecular de RNAs de fita dupla por ácidos nucleicos peptídicos quimicamente modificados. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia química do RNA, como detecção e direcionamento de estruturas de RNA. A principal vantagem desta técnica é que os princípios de design podem ser aplicáveis ao direcionamento de qualquer estrutura duplex de RNA.

Demonstrando o procedimento estará Desiree Toh, uma pesquisadora associada do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, adicione quatro microlitros de uma solução de glicerol a 35% às amostras de RNA PNA previamente preparadas e misture suavemente. Usando uma micropipeta e pontas de carregamento de gel, cuidadosamente 20 microlitros de cada amostra para um gel de poliacrilamida previamente preparado, certificando-se de não introduzir bolhas de ar.

Execute o gel a uma tensão constante de 250 volts por cinco horas. Após cinco horas, desligue a fonte de alimentação e remova a placa de vidro do suporte de gel. Em seguida, remova a fita de vedação de gel e desmonte a placa de vidro.

Remova suavemente o gel da placa de vidro e coloque-o em um recipiente cheio de 350 mililitros de água deionizada. Adicione cuidadosamente 35 microlitros de brometo de etídio ao recipiente e coloque-o no agitador da plataforma em velocidade baixa por 30 minutos. Depois de descartar a solução de brometo de etídio, enxágue o gel com 1,5 a dois litros de água destilada.

Em seguida, escaneie o gel usando um gerador de imagens com um laser verde de 532 nanômetros e o filtro de emissão ajustado em 610 nanômetros. Quantifique as intensidades da banda de gel usando software livre. Transfira a quantidade apropriada de RNA de fita dupla marcado com 2-aminopurina para um tubo limpo de 1,5 mililitro.

Em seguida, concentre as soluções de RNA usando um concentrador a vácuo. Em seguida, transfira os volumes apropriados do PNA alvo para várias concentrações do estoque principal previamente preparado para tubos separados de 1,5 mililitro. Concentre as soluções PNA usando o concentrador de vácuo.

Adicione 975 microlitros de tampão de incubação ao tubo que contém o RNA seco e misture bem para garantir que todo o RNA seja dissolvido. Depois de centrifugar brevemente a solução de RNA, submeta-a a recozimento colocando o tubo em um bloco de calor pré-aquecido por 10 minutos. Quando terminar, desligue o bloco de calor e deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente.

Adicione 75 microlitros de RNA a cada um dos tubos que contêm o PNA seco e misture bem. Depois de permitir que as amostras permaneçam em temperatura ambiente por pelo menos uma hora, incube-as a quatro graus Celsius durante a noite. Agora, transfira as quantidades apropriadas de RNA de fita simples marcado com 2-aminopurina para tubos separados de 1,5 mililitro.

Transferir os volumes apropriados de PNA direcionado para várias concentrações do estoque principal para os respectivos tubos contendo o RNA de fita simples. Após a secagem das amostras, adicione 75 microlitros de tampão de incubação a cada um dos tubos e misture bem. Submeter cada amostra ao recozimento, colocando cada tubo num bloco de calor pré-aquecido durante 10 minutos.

Depois de permitir que as amostras esfriem até a temperatura ambiente, incube-as a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, transfira 70 microlitros de cada amostra para uma cubeta quadrada de um centímetro. Colocar a cubeta num espectrofotómetro de fluorescência e medir a emissão num intervalo de comprimentos de onda de 330 a 550 nanómetros.

Quando a medição estiver concluída, remova o tampão da cubeta. Enxágue a cubeta com água destilada e seque com gás nitrogênio. Depois de repetir a medição para todas as amostras, represente graficamente a intensidade de fluorescência em relação ao comprimento de onda.

Transfira as quantidades apropriadas de RNA de fita simples para tubos separados de 1,5 mililitro. Em seguida, transfira os volumes apropriados de PNA direcionado do estoque principal para os respectivos tubos contendo o RNA de fita simples. Após a secagem das amostras, adicione 130 microlitros de tampão de incubação a cada um dos tubos e misture bem.

Submeter cada amostra ao recozimento, colocando cada tubo num bloco de calor pré-aquecido durante 10 minutos. Depois de permitir que as amostras esfriem até a temperatura ambiente, incube-as a quatro graus Celsius durante a noite. Agora, transfira 130 microlitros de cada amostra para uma cubeta de oito microcélulas com uma célula contendo tampão de incubação.

Usando um espectrofotômetro UV-Vis, meça a absorbância de cada amostra em 260 nanômetros. Meça com temperatura crescente de 15 a 95 graus Celsius, seguida de temperatura decrescente de 95 a 15 graus Celsius a uma taxa de rampa de 0,5 graus Celsius por minuto. Os oligômeros de PNA foram obtidos após duas purificações por HPLC de fase reversa.

A identidade dos PNAs pode ser confirmada pela análise MALDI/TOF. Os dados PAGE não desnaturantes sugerem que o PNA modificado Q e L só pode reconhecer a região de RNA de fita dupla com um par CG. Este reconhecimento específico e aprimorado é através da formação tripla de duas bases de T-A-U-L-G-C e Q-C-G PNA RNA.

Um estudo de titulação de fluorescência de 2-aminopurina mostrou que um PNA modificado com Q e L se liga a um RNA de fita dupla direcionado, mas não a um RNA de fita simples. Os PNAs contendo resíduos de Q não mostram transições de fusão térmica, sugerindo uma ausência de ligação ao RNA de fita simples devido ao choque estérico no par Watson Watson-Crick como Q-G. Em comparação com o PNA P1 não modificado, os PNAs P4 e P5 contendo resíduos L mostram uma temperatura de fusão mais baixa para os duplex de RNA PNA correspondentes devido ao choque estérico no par L-G semelhante a Watson-Crick.

Os dados de fusão térmica detectados por absorbância UV são consistentes com os dados de titulação de fluorescência de 2-aminopurina, que também mostram que um PNA contendo resíduos Q e L não se liga fortemente ao RNA de fita simples. Incorporar uma base Q é mais desestabilizador do que uma base L, pois uma base Q tem um choque estérico mais significativo na formação de um par Watson-Crick como Q-G. Uma vez dominados, os vários experimentos podem ser feitos em uma semana se forem realizados corretamente.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como sondagem e direcionamento de estruturas de RNA nas células, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se podemos detectar estruturas de RNA e regular as funções de RNA usando PNAs de ligação de RNA de fita dupla. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia e doenças do RNA explorarem o desenvolvimento terapêutico direcionado à estrutura do RNA.