Visualizando a interação entre a proteína Qdot-etiquetadas e λ Site-specifically modificada de DNA a nível da molécula

Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo da imagem de molécula única de interações de proteínas de DNA, como replicação de DNA, reparo de genes e manutenção da estrutura cromossômica. A principal vantagem desta técnica é que se pode obter alto colágeno de DNA lambda modificado e, em seguida, curar rapidamente as proteínas marcadas. A demonstração visual desse método é crítica porque as etapas de montagem da célula de fluxo são difíceis de aprender.

Para limpar as lamínulas, coloque 20 lamínulas em quatro frascos de coloração, despeje etanol neles e sonice por 30 minutos em etanol. Em seguida, enxágue as lamínulas com água ultrapura três vezes. Em seguida, sonicar as lamínulas com um hidróxido de potássio molar por 30 minutos e enxaguar as lamínulas com água ultrapura três vezes.

Em seguida, repita a sonicação com etanol e hidróxido de potássio uma vez. Sonicar as lamínulas com acetona por 30 minutos e depois enxaguar abundantemente com água ultrapura. Agora coloque as lamínulas na solução de Piranha e incube a 95 graus Celsius por uma hora.

Após a incubação, enxágue as lamínulas com água ultrapura cinco vezes. Em seguida, lave extensivamente cada lamínula com água ultrapura. Use papel para secar a lamínula da borda e coloque-a em um frasco de coloração.

Seque bem a lamínula em um forno a 110 graus Celsius. Agora enxágue a lamínula com metanol e coloque o frasco de coloração de volta no forno a 110 graus Celsius para secar a lamínula. Para realizar a funcionalização da lamínula, adicione 70 mililitros de solução de silano em cada frasco, aperte a tampa e deixe o frasco em temperatura ambiente durante a noite.

Lave as lamínulas usando três copos cheios de água ultrapura. Seque bem as lamínulas com gás nitrogênio. Dissolva 150 miligramas de metoxi-PEG e seis miligramas de biotina-PEG em um mililitro de bicarbonato de sódio 0,1 molar recém-preparado.

Centrifugar a 17 000 vezes g durante um minuto para remover os PEG insolúveis. Agora pipete 100 microlitros de solução de PEG no centro da lamínula silanizada e coloque outra lamínula silanizada na parte superior. Incubar as lamínulas com a solução de PEG durante pelo menos três horas na obscuridade.

Separe os pares de lamínulas e mantenha a superfície funcionalizada voltada para cima. Enxágue extensivamente as lamínulas com água ultrapura e seque-as com gás nitrogênio. Agora marque o lado funcionalizado das lamínulas em um dos cantos usando uma caneta marcadora.

Coloque uma lamínula em um tubo de 50 mililitros perfurado com um orifício na tampa. Coloque o tubo em um saco plástico, feche o saco usando um selador a vácuo e guarde-o a menos 20 graus Celsius. Para montar a célula de fluxo, corte um canal no centro de um pedaço de fita dupla-face usando um perfurador.

Retire o lado do papel da fita dupla-face e cole-o em um lado de vidro com dois orifícios. É mais fácil remover bolhas de ar descascando o lado do papel do que o lado plástico da fita dupla-face. Pressione a fita para remover as bolhas de ar.

Em seguida, corte uma lamínula funcionalizada em quatro pedaços usando um escriba de vidro com ponta de diamante e remova os detritos usando gás nitrogênio, mantendo o lado funcionalizado para cima. Retire o lado plástico da fita dupla-face e cole a lâmina na lamínula funcionalizada. Pressione suavemente para remover as bolhas de ar entre a lamínula e a fita.

A remoção completa das bolhas de ar pode proteger a célula de fluxo contra vazamentos enquanto os amortecedores são bombeados para ela. Agora insira a tubulação de entrada no orifício pequeno e insira a tubulação de saída no orifício grande. Fixe a tubulação usando epóxi.

Bombeie manualmente 20 microlitros de 0,2 miligramas por mililitro de estreptavidina na célula de fluxo usando uma seringa e incube em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, bombeie o tampão de bloqueio para a célula de fluxo para substituir a estreptavidina e mantê-la à temperatura ambiente. Obtenha o alinhamento focal de vermelho e vermelho distante com A5 na lâmina de teste do microscópio de fluorescência número um por excitação simultânea usando um laser de 532 nanômetros e um laser de 640 nanômetros.

Produza imagens de comprimento de onda duplo com óptica de divisão. Coloque a célula de fluxo no microscópio e conecte sua tubulação de saída a uma tubulação mais longa que é conectada a uma mola de 10 mililitros instalada em uma bomba programável de retirada de infusão automatizada. Remova as bolhas de ar na célula de fluxo injetando tampão de bloqueio e invertendo a tubulação de saída.

Adicione 0,5 microlitros de DNA lambda-ARS317 biotinilado em 80 microlitros de tampão de bloqueio. Bombeie a mistura preparada para a célula de fluxo a 25 microlitros por minuto por dois minutos. Em seguida, lave o DNA lambda-ARS317 usando 200 microlitros de tampão de bloqueio a uma taxa de 50 microlitros por minuto.

Agora bombeie 200 microlitros de tampão de ligação a uma taxa de 50 microlitros por minuto para remover o tampão de bloqueio na célula de fluxo. Em seguida, adicione dois microlitros de ORC-Qdot705, um microlitro de TDT e um microlitro de ATP em 96 microlitros de tampão de ligação. A concentração final de ORC-Qdot705 é de 0,2 nanomolar.

Depois de bombear o tampão de ligação conforme detalhado no protocolo de texto, bombeie 20 microlitros da solução ORC-Qdot705 preparada a uma taxa de 10 microlitros por minuto na célula de fluxo. Lave o ORC-Qdot705 excessivo usando 200 microlitros de tampão de ligação a uma taxa de 100 microlitros por minuto. Em seguida, bombeie o tampão de ligação com 30 nanomolares SYTOX Orange na célula de fluxo para corar substratos de DNA a uma taxa de 100 microlitros por minuto.

Finalmente, excite o sinal ORC-Qdot705 usando um laser de 405 nanômetros e excite o sinal de DNA corado com laranja SYTOX usando um laser de 532 nanômetros. Observe os sinais simultaneamente com fluxo de 100 microlitros por minuto usando um filtro passa-banda quad. Grave as imagens por EMCCD com 100 milissegundos por quadro.

A ilustração do substrato de DNA lambda-ARS317 é mostrada aqui. O ORC marcado com Qdot705 foi excitado por um laser de 405 nanômetros. O DNA corado com laranja SYTOX foi excitado por um laser de 532 nanômetros.

O resultado mesclado sugere que o ORC marcado com Qdot705 se liga ao ARS317. O resultado da distribuição de ligação a ORC no DNA lambda-ARS317 mostra que ORC se liga a ARS317 com alta abundância. Após este procedimento, outros métodos, como FRET de molécula única, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre interações proteína-proteína e dinâmica de proteínas.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imagem fluorescente de molécula única explorarem as interações da proteína do DNA em sistemas reconstituídos de replicação do DNA e reparo do DNA in vitro. Não se esqueça de que trabalhar com a solução Piranha pode ser extremamente perigoso e os cuidados como o uso de máscaras faciais de proteção devem sempre ser tomados durante a realização deste procedimento.