Name: Visualizando a interação entre a proteína Qdot-etiquetadas e λ Site-specifically modificada de DNA a nível da molécula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a visualizar interações DNA-proteína em nível de molécula única usando TIRFM com DNA λ modificado e proteínas marcadas com Quantum dots. Este método facilita estudos de replicação e reparo genético.

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Agradecemos o Dr. Hasan Yardimci e Dr.Sevim Yardimci do Instituto Francis Crick de tipo ajudar nas experiências de único-molécula, Dr. Daniel Duzdevich do laboratório do Dr. Eric C. Greene, da Universidade de Columbia, Dr. Yujie Sun da Universidade de Pequim e Dr. Chunlai Chen de Universidade de Tsinghua para discussão útil. Este estudo foi suportado por Nacional Natural Science Foundation da China 31371264, 31401059, equipe de inovação interdisciplinar CAS e o Fellowship Newton avançado (NA140085) da Royal Society.

1. preparação do substrato de DNA λ-ARS317
<ol><li>Embalagem e construção de substrato DNA<ol>
<li>Digerir o DNA nativo λ usando Xhoeu enzima; amplificar um rolamento fragmento de DNA bp 543 ARS317 partir do DNA genômico de brotamento fermento usando cartilhas contendo 20 bp homóloga sequências de montante e a jusante da Xhoeu site de enzima no ADN do lambda. Adicionar 100 ng de Xhoeu digerido DNA λ e 10 ng de DNA do fragmento de 10 µ l do sistema de reação do recombination homologous e incubar a reação a 37 ° C por 30 min.</li>
		<li>Para o DNA de λ de recombinação do pacote, adicione 25 µ l dos extratos de embalagens lambda para o produto de recombinação e incubar a reação a 30 ° C, durante 90 min. Em seguida, adicione um adicional 25 µ l de extratos de embalagens lambda no tubo de reação. Continue a incubar a reação a 30 ° C, durante 90 min.</li>
		<li>Adicionar 500 µ l de tampão de diluição estéril (10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM de NaCl, 10 mM MgCl2) para o sistema de reação e misture delicadamente, girando o tubo de cabeça para baixo várias vezes. Adicione 25 µ l de clorofórmio, misture delicadamente e armazenar a 4 ° C.</li>
		<li>Adicione 100 µ l de fagos empacotados e 100 µ l de bactérias LE392MP (cultivadas em 0.8 - 1.0 usando meio LB adicionando com 10 mM de MgSO4) para um tubo novo. Incube a 37 ° C por 15 minutos.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de mistura do fago-bactéria em ágar de detop 4 mL (média LB + 0,7% de ágar + 10 mM de MgSO4, resfriado a 48 ° C). Imediatamente misture girando o tubo de cabeça para baixo várias vezes e despeje-o sobre um prato pré-aquecido (37 ° C) LB.</li>
		<li>Incubar a placa a 37 ° C durante a noite e a placa de λ-ARS317 usando PCR e sequenciamento de tela.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificação de substrato DNA de líquido lysates11,18<ol>
<li>Escolha uma placa em 200 µ l de DDQ estéril2O com 10 mM de MgCl2 e 10 nM CaCl2. Misture com 200 µ l de bactérias LE392MP (cultivada durante a noite em meio LB) e incubar a 37 ° C por 15 min.</li>
		<li>Adicione a mistura do fago-bactéria em 100 mL de NZCYM (NZ-amina, 5g/L de 10 g/L de levedura extrato, 5g/L de NaCl, 1 g/L Casamino hidrolisado e 2 g/L MgSO4·7H2O) médio e cultura para 7 h a 37 ° C. Adicionar 250 µ l de clorofórmio na cultura e agitar durante mais 10 minutos.</li>
		<li>Transferi a cultura para um balão de 200 mL. Adicionar 5,8 g de NaCl (concentração final de 1 M), mexa até para dissolver com a mão e incubar no gelo por 30 min.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C para remover os detritos de células. Recolher o sobrenadante para um balão de 200 mL e adicionar 10% PEG8000 (m/V). Mexa para dissolver por aparelhos de agitação magnéticos e incubar no gelo por 30 min ou mais.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C, para precipitar o bacteriófago. Remova o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender o precipitado em 2 mL de tampão de diluição do fago. Transferi-lo para um tubo de 15 mL e adicionar 10 µ l de RNase (concentração final é de 20 µ g/mL) e 40 µ l de DNase (concentração final é 5 µ g/mL). Incube a 37 ° C por 30 min.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de 0.3 M Tris-HCl (pH 9,0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, 15 proteinase µ l K (concentração final é de 10 µ g/mL). Incube a 65 ° C por 10 min.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de acetato de potássio pre-cooled (3 M, pH 4,8) e incubar o tubo no gelo por 10 min.</li>
		<li>Centrifugar a 8.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C para remover os materiais insolúveis.</li>
		<li>Adicione o volume de 0,7 x de isopropanol para o sobrenadante. Misture girando o tubo de cabeça para baixo várias vezes e incube por 2 min à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Centrifugar a 8.000 x g durante 10 minutos a RT para precipitar o DNA. Remova o sobrenadante.</li>
		<li>Lave o DNA, uma vez que com 70% de etanol por centrifugação a 8.000 x g durante 10 min. Retire o sobrenadante.</li>
		<li>Eluir o DNA usando tampão de TE do 500 µ l (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH. 8.0) suavemente e transferir o DNA no tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Extrair o DNA duas vezes usando fenol: clorofórmio por centrifugação a 8.000 g durante 10 minutos.</li>
		<li>Precipitar com 0,7 x volume isopropanol. Misture girando o tubo de cabeça para baixo suavemente e centrifugar a 8.000 x g durante 10 minutos.</li>
		<li>Lave uma vez com etanol a 70%, resuspenda em 200 µ l de TE. Medir a concentração de DNA e armazenar a-20 ° C em 12,5 µ g alíquotas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
<ol><li>Para fosforilar oligonucleotides biotinilado (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-biotina-3') complementares para a extremidade esquerda do nativo λ DNA, adicionar 1 µ l (100 µM) de oligonucleotídeos, 7,5 µ l de DDQ2O, 1 µ l de buffer de ligase de 10x e 0,5 µ l de T4 PNK. Incube a reação a 37 ° C por 3 h.</li>
	<li>Para fosforilar λ-ARS317, adicione 12,5 µ g de λ-ARS317, 3 µ l de buffer de ligase de 10x, 1 µ l de T4 PNK e ddH2O volume total de 30 µ l. Incubar a reação a 37 ° C por 3 h.</li>
	<li>Para recozer oligonucleotides com λ-ARS317, adicione 0,5 µ l de oligonucleotides fosforilados, µ l 195 do DDQ2O, 25 µ l de tampão de ligase × 10 no tubo fosforilada λ-ARS317. Misture delicadamente, girando o tubo de cabeça para baixo e incubar a 65 ° C por 5 min. Turn off o aquecedor do bloco e deixe o fresco da amostra para abaixo de 33 ° C, no bloco.</li>
	<li>Para ligate oligonucleotides com λ-ARS317, adicione 1 μL de T4 DNA ligase e 0.63 µ l de ATP (200 mM). Misture delicadamente, girando o tubo de cabeça para baixo e incubar a temperatura ambiente por 2 h ou 4 ° C durante a noite. Armazenar a 4 ° C para 1 mês. Nota: Para evitar a interrupção do DNA, todas as etapas de mistura devem ser feitas rodando suavemente o tubo de cabeça para baixo, em vez de mistura usando pipetas.</li>
</ol>3. lamela limpeza e Functionalization
<ol><li>Lamela limpeza<ol>
<li>Lugar 20 lamelas em 4 frascos de coloração (5 de lamelas/jar), proceda à sonicação durante 30 minutos em etanol e lave as lamelas com ultrapura H2O 3 vezes.</li>
		<li>Proceda à sonicação durante 30 minutos com 1 M de hidróxido de potássio (KOH) e enxágue as lamelas com ultrapura H2O 3 vezes. Repita o etanol e sonication KOH uma vez.</li>
		<li>Proceda à sonicação com acetona durante 30 minutos e em seguida enxaguar com ultrapura H2O (pelo menos 3 vezes). Nota: Acetona deve ser removida completamente enxaguando com ultrapura H2O, porque ele pode causar uma explosão quando o solvente orgânico (como acetona) misturado com a solução de piranha equivocadamente14.</li>
		<li>Coloque as lamelas em solução piranha (3:1 mistura de H2SO4 e 30% H2O2) e incube a 95 ° C por 1h. Nota: Solução Piranha é altamente energético e erosiva, então use com cautela. Ao preparar a solução de piranha, adicionar 50 mL de H2O2 primeiro para um copo de vidro de 500 mL e adicione 150 mL de H2então4 lentamente no copo medidor.</li>
		<li>Enxague as lamelas com ultrapura H2O 5 vezes. Então lave cada lamela com ultrapura H2O completamente usando 3 copos cheios ultrapura H2O e seque a lamela usando papel da borda da lamela. Colocar a lamela dentro do frasco de coloração e secar a lamela completamente em um forno a 110 ° C durante 30 minutos.<ol>
<li>Enxágue a lamela com metanol e coloque o frasco de coloração no forno novamente para secar completamente o sentido do lamela 110 ° C. Nota: Secagem a lamela completamente é muito importante, porque APTES terá lotes de possíveis estruturas superficiais, uma vez que está na presença de água19.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lamela functionalization<ol>
<li>Adicionar 70 mL de solução de silano (metanol de 93%, 5% de ácido acético e 2% APTES) em cada frasco, enrosque a tampa e deixar o frasco à temperatura ambiente durante a noite.</li>
		<li>Lave e seque as lamelas, conforme descrito na etapa 3.1.5, exceto secar as lamelas completamente usando gás nitrogênio ao invés de colocá-los no forno.</li>
		<li>Dissolva 150 mg de mPEG (metoxi-polietileno glicol) e 6 mg de biotina-PEG (biotina-polietilenoglicol) em 1 mL de 0.1 M feito fresco NaHCO3 (pH 8,2) completamente. Em seguida centrifugar 17, 000 x g por 1 min remover PEGs insolúveis. Nota: Recém-feitos NaHCO3 está pronto; Não há nenhuma necessidade de ajustar o seu pH.</li>
		<li>Coloque as lamelas silanizada em caixas e colocar duas pequenas lamelas no topo de duas extremidades de lamelas o silanizadas. Pipetar 100 µ l de solução de PEG no centro da lamela silanizadas e coloque outro silanizada lamela em cima.</li>
		<li>Adicionar alguns ultrapura H2O na caixa para mantê-lo úmido e incube as lamelas com solução de PEG pelo menos 3 h no escuro. Uma incubação durante a noite pode funcionar tão bem.</li>
		<li>Separar os pares de lamela e acompanhar a face superfície funcionalizada, enxaguar as lamelas usando ultrapura H2O extensivamente e seque-os com gás de nitrogênio.</li>
		<li>Marca o lado funcionalizado das lamelas em um dos cantos usando uma caneta marcador, manter o lado funcionalizado voltadas para cima, colocá-los em caixas e armazenar as caixas no exsicador vácuo durante 1 mês.</li>
		<li>Para armazenar as lamelas por mais tempo, coloque uma lamela em um tubo de 50 mL perfurado com um buraco na sua tampa, em seguida, colocar o tubo em um saco plástico e selar o saco usando um selador. Desta forma, as lamelas podem ser armazenadas a-20 º C cerca de 3 meses.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. fluxo celular Assembly
<ol><li>Corte um canal 15 mm × 2 milímetros no centro de um pedaço de fita dupla-face (30 mm × 12 mm) usando um perfurador.</li>
	<li>Retire o lado da fita dupla-face de papel e colá-lo sobre a lâmina de vidro com dois buracos. Pressione para remover as bolhas de ar. Baseado em nossa experiência, é mais fácil remover as bolhas de ar por descascar fora do lado do papel que a lateral de plástico da fita dupla-face.</li>
	<li>Corte uma lamela funcionalizada (60 mm × 24 mm) em quatro pedaços (30 mm × 12 mm) usando um copo com ponta de diamante escriba e remover os detritos usando gás nitrogênio. Lembre-se de manter o funcionalizados lado enfrentar.</li>
	<li>Retire a lateral de plástico da fita dupla face e colar o slide sobre a lamela funcionalizado. Pressione suavemente para remover as bolhas de ar entre a lamínula e a fita. Remover as bolhas de ar completamente pode proteger a célula de fluxo vazem enquanto amortecedores foram bombeados para isso.</li>
	<li>Inserir entrada e saída tubos nos furos pequenos e grandes, respectivamente. Conserte a tubulação usando epóxi.</li>
	<li>Bomba de 20 µ l de estreptavidina (0,2 mg/mL) em células de fluxo, usando uma seringa manualmente e incubar a RT por 10 min. Então bomba bloqueio reserva10 na célula de fluxo para substituir streptavidin e mantê-lo em temperatura ambiente.</li>
</ol>5. molécula visualização
<ol><li>Obter o alinhamento focal de vermelho e far-red com A5 do slide de teste do microscópio de fluorescência #1 por excitação simultânea, usando um laser de 532 nm e um laser de 640 nm. Produzir imagens de duplo comprimento de onda com separação óptica (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Coloque a pilha de fluxo no microscópio e conectar a tubulação de saída para uma conexão de tubulação mais com uma mola de 10 mL, instalada em uma bomba de infusão/retirada automática programável. Nota: Bombeamento buffers de dentro da célula de fluxo mencionada abaixo significa buffers de retirar o tubo de entrada da célula de fluxo para a seringa.</li>
	<li>Bomba de tampão de bloqueio em 500 µ l/min para a célula de fluxo para remover o ar rapidamente e garantir que o buffer na célula de fluxo é desbloqueado. Depois da bomba o tampão de bloqueio em 200 µ l/min para a célula de fluxo e virar o tubo de saída para retirar bolhas de ar da tubulação de entrada e a célula de fluxo completamente. Nota: Todos os buffers bombeados para dentro da célula de fluxo devem ser desgaseificados num exsicador de vácuo pelo menos 15 minutos antes do uso.</li>
	<li>Adicionar 0,5 µ l de DNA de λ-ARS317 biotinilado em 80 µ l de tampão de bloqueio e bombeá-lo para a célula de fluxo em 25 µ l/min por 2 min. Então lave λ-ARS317 DNA usando 200 µ l de tampão de bloqueio a uma taxa de 50 µ l/min.</li>
	<li>Bomba de 200 µ l de tampão10 de vinculação a uma taxa de 50 µ l/min para remover o tampão de bloqueio na célula de fluxo.</li>
	<li>Adicionar 0,2 µ l de streptavidin-revestido Qdot705 (1 µM) e 0,2 µ l de biotinilado ORC (1,2 µM) em um tubo e incubar a temperatura ambiente por 5 min. Em seguida adicionar 20 µ l de binding buffer no tubo e colocá-lo no gelo. A concentração final de ORC-Qdot705 é cerca de 10 nM.</li>
	<li>Adicionar 2 µ l de ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µ l de TDT (100 mM), 1 µ l de ATP (200 mM) em 96 µ l de tampão de ligação. A concentração final de ORC-Qdot705 é 0.2 nM.</li>
	<li>Bomba de 20 µ l de 0,2 nM ORC-Qdot705 à taxa de 10 µ l/min para a célula de fluxo. O jogo de excessiva de ORC-Qdot705 usando 200 µ l de tampão de ligação à taxa de 100 µ l/min. Em seguida, tampão de ligação da bomba com 30 nM SYTOX laranja dentro da célula de fluxo para manchar substratos de DNA a uma taxa de 100 µ l/min.</li>
	<li>Excitar o sinal de705 ORC-Qdot e laranja SYTOX manchado sinal de DNA usando um laser de 405 nm e laser de 532 nm, respectivamente. Observar os sinais simultaneamente com 100 µ l/min, fluxo, usando um filtro de passa-banda Quad-band (FF01-446/510/581/703-25) e gravar as imagens pelo EM-CCD com 100 ms por quadro. Recolha 20 pilhas de imagem de diferentes campos.</li>
</ol>6. análise de dados
<ol><li>Cortar as imagens usando o software de Fiji com um novo plugin, que é modificado por nós mesmos se baseia o plugin de imagem (OI_cut_RGBmerge), desenvolvido pelo laboratório do Dr. Ron Vale na Universidade da Califórnia, San Francisco.<ol>
<li>Corte uma pilha de imagens (512 × 512 pixels) em duas pilhas de imagens (256 × 256 pixels). Um é um 532 nm laser resultado emocionante, e o outro é um 405 nm laser resultado emocionante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Processo de 61 imagens sequenciais usando projeto de Fiji-imagem-pilhas-Z (intensidade média).</li>
	<li>Medida do comprimento do DNA (DNAde L) e a distância do local da ligação de705 (LORC) ORC-Qdot no DNA com do DNA amarrados fim manualmente.</li>
	<li>Calcular o resultado de LORC/LDNA usando excel, analisar os dados usando o método de inicialização por R, em seguida, criar o histograma e ajuste distribuições Gaussian.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, apresentamos um protocolo para observar a interação entre a Qdot-etiquetou a proteína e o DNA de λ site-specifically modificada usando o TIRFM em uma célula de fluxo. Os passos necessários incluem modificação site-specific do substrato DNA, DNA biotinylation, lamela limpeza e functionalization, preparação de fluxo-célula e único-molécula imagem. Existem dois pontos-chave que devem ser observados. Primeiro, todas as etapas envolvidas com DNA λ devem ser manipuladas com cuidado para diminuir qualquer possível dano, <...

Interações entre proteínas e DNA são essenciais para muitos processos biológicos complexos, tais como a replicação do DNA, reparo do DNA e transcrição. Apesar de abordagens convencionais têm lançar luz sobre as propriedades destes processos, muitos mecanismos chaves são ainda pouco claras. Recentemente, com as técnicas de molécula em rápido desenvolvimento, alguns dos mecanismos foram abordados1,2,3.
A aplicação da microscopia de fluorescência de único-molécula na visualização de interações proteína-ADN em tempo real principalmente depende do desenvolvimento de detecção de fluorescência e sondas fluorescentes. Para um estudo da molécula, é importante a rotular a proteína de interesse com uma sonda fluorescente adequada desde sistemas de deteção de fluorescência são na sua maioria disponíveis comercialmente.
Proteínas fluorescentes são usadas em biologia molecular. No entanto, o baixo brilho fluorescente e estabilidade contra fotobranqueamento restringem sua aplicação em muitos ensaios única molécula. Pontos quânticos (Qdots) são pequenos emissores de luz de nanopartículas4. Devido a suas propriedades ópticas originais, Qdots são 10 - 20 vezes mais brilhantes e vários milhares de vezes mais estável do que o utilizado orgânicos corantes5. Além disso, Qdots têm uma grande Stokes turno (a diferença entre a posição dos picos de excitação e emissão)5. Assim, Qdots pode ser usado para a observação de longa data (minutos a horas) e aquisição de imagens com alta relação sinal-ruído, enquanto eles não podem ser utilizados em ensaios quantitativos.
Até à data, existem duas abordagens para rotular uma proteína do alvo com Qdots site-specifically: rotulagem, com o auxílio de anticorpos primários ou secundários conjugados a Qdot6,7,8; ou rotulagem a proteína do alvo com Qdots diretamente, que se baseia a interação forte entre biotina e streptavidin9,10,11,12,13. Streptavidin-revestido Qdots estão disponíveis comercialmente. Em nosso estudo recente, site-specifically biotinilado proteínas em gemulação de leveduras com alta eficiência foram purificadas pelo co-superexpressão de BirA e proteínas Avi-etiquetadas em vivo10. Seguinte e otimizando o único-molécula ensaios14,15,16,17, observamos as interações entre proteínas Qdot-labeled e DNA em nível usando a única molécula TIRFM10.
Aqui, nós escolhemos o brotamento fermento origem reconhecimento complexo (ORC), que especificamente pode reconhecer e ligar-se à sequência de replicação autônoma (ARS), como nossa proteína de interesse. O protocolo seguinte apresenta um procedimento passo a passo de visualizar a interação de ORC Qdot-etiquetadas com ARS usando TIRFM. A preparação do substrato DNA site-specifically modificado, biotinylation o DNA, a lamela limpeza e functionalization, a montagem da pilha de fluxo e a imagem do único-molécula são descritos.

<table><tbody><tr><td>Loja Lambda DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011</td><td>25 &mu; L alíquotas a -20 &ordm;C.</td></tr><tr><td>XhoI enzima</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0694</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonagem de fusão rápida</td><td>Biotool</td><td>B22611</td><td></td></tr><tr><td>MaxPlax Lambda Embalagem Extratos</td><td>Epicentro</td><td>MP5110</td><td>A cepa bacteriana LE392MP está incluída neste pacote.</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10013092</td><td>Qualquer marca é aceitável.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beijing Chemical funciona</td><td>N / A</td><td>Qualquer marca é aceitável.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Qualquer marca é aceitável.</td></tr><tr><td>NZ-amina</td><td>Amresco</td><td>J853-250G</td><td></td></tr><tr><td>Casamino ácidos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Beyotime</td><td>ST483</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de agitação magnética</td><td>IKA</td><td>KMO2 básico</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Eppendorf tubo Eppendorf</td><td></td><td>30122151</td><td>15 mL, estéril, a granel, 500pcs</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>SIGMA</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>SIGMA</td><td>D5319-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>0706-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Primers biotinilados</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Tampão de Reação (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22266882</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10009259</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306568-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>80120891</td><td>ácido sulfúrico</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011218</td><td>30% de peróxido de hidrogênio</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-2L</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900798</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>mPEG (metoxi-polietilenoglicol)</td> <td>Lysan</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>biotina-PEG (biotina-polietilenoglicol)</td><td>Lysan</td><td>Biotina-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador a vácuo</td><td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td><td>IPC250-1</td><td></td></tr><tr><td>Seladora a vácuo</td><td>MAGIC SEAL</td><td>WP300</td><td></td></tr><tr><td>Escriba de vidro com ponta de diamante</td><td>CIÊNCIAS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA</td><td>70036</td><td></td></tr><tr><td>Vela deslizante de vidro</td><td>Marca</td><td>7101</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de entrada</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/2</td><td>diâmetro interno 0,38 mm; diâmetro externo 1,09 mm.</td></tr><tr><td>Tubulação de saída</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/4</td><td>diâmetro interno 0,76 mm; diâmetro externo 1,22 mm.</td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL620001-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Epóxi</td><td>LEAFTOP</td><td>9005</td><td>epóxi de cinco minutos</td></tr><tr><td>Estreptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Fluorescência</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Infusão/retirada bomba programável</td><td>Aparelho Harvard</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>Laser de 532 nm</td><td>Coherent</td><td>Sapphire-532-50</td><td></td></tr><tr><td>640 nm laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS-640-100</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-BV</td><td></td></tr><tr><td>W-View Gemini Imaging óptica de divisão</td><td>Hamamatsu fotônica K.K.</td>Sistema de iluminação Olympus IX2-RFAEVA2 <td>de A12801-01</td><td></td></tr><tr><td>TIRF</td><td></td><td></td> 60&times;<td></td></tr><tr><td> Objetiva TIRF</td><td>Olympus</td><td>APON60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Quad-edge laser dicroico divisor de feixe</td><td>Semrock</td><td>Di01-R405/488/ 532/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda quad-band</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/ 581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de feixe dicróico</td><td>Semrock</td><td>FF649-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emissão</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET585/65m</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emissão</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET665lp</td><td></td></tr><tr><td>FocalCheck, lâmina de teste de microscópio, lâmina de teste #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F36909</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Laranja</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 Estreptavidin Conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10163MP</td><td>Store em 4 &ordm; C, não congele.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Amresco</td><td>0220-25G</td><td>Prepare a solução de ATP 200 mM, usando ddH2O, ajuste o pH para 7,0 e armazene 10 &mu; L alíquotas a -20 &ordm;C.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Amresco</td><td>M109-5G</td><td>Prepare a solução de 1 M usando ddH2O, e armazene 10 &mu; l alíquotas em -20 &ordm;C.</td></tr></tbody></table>

visualizando a interação entre a proteína qdot-etiquetadas e λ site-specifically modificada de dna a nível da molécula

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

A microscopia de fluorescência fez grandes contribuições em dissecando os mecanismos de complexos processos biológicos a nível da molécula. Em ensaios de molécula para o estudo das interações da proteína-ADN, existem dois fatores importantes para a consideração: o substrato de DNA, com comprimento suficiente para observação fácil e marcando uma proteína com uma sonda fluorescente apropriada. DNA de λ 48,5 kb é um bom candidato para o substrato de DNA. Pontos quânticos (Qdots), como uma classe de sondas fluorescentes, permitem a observação de longa data (minutos a horas) e aquisição de imagens de alta qualidade. Neste trabalho, apresentamos um protocolo para estudar interações DNA-proteína no nível único-molécula, que inclui preparar um site-specifically modificado λ DNA e marcando uma proteína alvo com streptavidin-revestido Qdots. Para uma prova de conceito, podemos escolher ORC (complexo de reconhecimento de origem) em leveduras brotamento como uma proteína de interesse e visualizar sua interação com um ARS (sequência de replicação autônoma) usando TIRFM. Comparado com outras sondas fluorescentes, Qdots tem vantagens óbvias em estudos única molécula devido a sua alta estabilidade contra fotobranqueamento, mas note que esta propriedade limita sua aplicação em ensaios quantitativos.

Para visualizar a interação entre ORC Qdot-rotulados e o ARS, construímos primeiro o substrato de DNA λ-ARS317. Um fragmento de DNA contendo ARS317 foi integrado em Xhoeu site (33,5 kb) de DNA nativo λ por recombinação homóloga (figura 1A). O produto de recombinação foi empacotado usando extratos e as partículas do fago embalados foram cultivadas em placas LB (figura 1B). A placa positiva do fago foi projectada por PCR e...

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar interações DNA-proteína por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) usando um substrato de DNA modificado site-specifically λ e um ponto quântico rotulado de proteína.

Visualizando a interação entre a proteína Qdot-etiquetadas e λ Site-specifically modificada de DNA a nível da molécula

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo da imagem de molécula única de interações de proteínas de DNA, como replicação de DNA, reparo de genes e manutenção da estrutura cromossômica. A principal vantagem desta técnica é que se pode obter alto colágeno de DNA lambda modificado e, em seguida, curar rapidamente as proteínas marcadas. A demonstração visual desse método é crítica porque as etapas de montagem da célula de fluxo são difíceis de aprender.Para limpar as lamínulas, coloque 20 lamínulas em quatro frascos de coloração, despeje etanol neles e sonice por 30 minutos em etanol. Em seguida, enxágue as lamínulas com água ultrapura três vezes. Em seguida, sonicar as lamínulas com um hidróxido de potássio molar por 30 minutos e enxaguar as lamínulas com água ultrapura três vezes.Em seguida, repita a sonicação com etanol e hidróxido de potássio uma vez. Sonicar as lamínulas com acetona por 30 minutos e depois enxaguar abundantemente com água ultrapura. Agora coloque as lamínulas na solução de Piranha e incube a 95 graus Celsius por uma hora.Após a incubação, enxágue as lamínulas com água ultrapura cinco vezes. Em seguida, lave extensivamente cada lamínula co

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós apresentamos uma integração inovadora e poderosa de nanofotônica (QD-FRET) e microfluídica para investigar a formação de polyplexes polieletrólito, que é esperado para prestar um melhor controle e síntese de polyplexes uniforme e personalizável para à base de ácido nucléico futuro terapêutica.

Combinando QD-FRET e microfluídica para monitorar Nanocomplex DNA Automontagem-in Real-Time

Este vídeo descreve um método para visualizar a montagem de condensados de proteínas de fusão em moléculas de DNA em loci específicos usando imagens de molécula única. Esses condensados são formados devido às interações LCD-LCD e LCD-DBD, que permitem o recrutamento da RNA polimerase II e o aumento da transcrição gênica.

Imagem de molécula única para visualizar a montagem de condensados de proteínas de fusão em cortinas de DNA

Microscopia localização fotoativado (PALM), combinada com uma única molécula de rastreamento permite a observação direta e quantificação das interações DNA-proteína em células de Escherichia coli ao vivo.

Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

Aqui nós descrevemos os instrumentos e métodos para a detecção de moléculas de proteína única fluorescently rotulados interagindo com uma única molécula de DNA suspenso entre duas microesferas opticamente presos.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

Fornecemos instruções detalhadas para a preparação de pontos quânticos direcionados monovalentes (mQDs) a partir de DNA fosforotioato de comprimento definido. O envolvimento do DNA ocorre em alto rendimento e, portanto, os produtos não requerem purificação. Demonstramos o uso da tag SNAP para direcionar mQDs para receptores de superfície celular para aplicações de imagem de células vivas.

Produção e Segmentação de Monovalent Quantum Dots

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Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

Este fluxo de trabalho descreve o desempenho do enriquecimento tempo e econômico de múltiplas modificações pós-translacionais de proteínas (PTMs) simultaneamente para análise proteômica global quantitativa. O protocolo utiliza o enriquecimento ptm em nível de peptídeo com múltiplos anticorpos conjugados, seguido pela análise de espectrometria de aquisição independente de dados para obter insights biológicos sobre o crosstalk PTM.

Enriquecimento de afinidade simultânea de duas modificações pós-translacionais para quantificação e localização do site

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Usando DNA marcado com ponto quântico e microscopia de fluorescência de reflexão interna total, podemos investigar o mecanismo de reação das endonucleases de restrição ao usar proteína não marcada. Essa técnica de molécula única permite a observação massivamente multiplexada de interações proteína-DNA individuais, e os dados podem ser agrupados para gerar distribuições de tempo de permanência bem povoadas.

Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

Este protocolo demonstra a realização de um ensaio de molécula única para visualização ao vivo do desenrolamento do DNA por CMG helicase. Ele descreve (1) a preparação de um substrato de DNA, (2) a purificação de Drosophila melanogaster CMG helicase marcada com fluorescência, (3) a preparação de uma célula de fluxo microfluídico para microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) e (4) o ensaio de desenrolamento de DNA de molécula única.

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Aprenda a visualizar interações DNA-proteína em nível de molécula única usando TIRFM com DNA λ modificado e proteínas marcadas com Quantum dots. Este método facilita estudos de replicação e reparo genético.

Visualizando a interação entre a proteína Qdot-etiquetadas e λ Site-specifically modificada de DNA a nível da molécula

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