Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

O objetivo geral deste experimento de ensaio de ligação de proximidade é visualizar e quantificar a formação de resposta a danos no DNA e reparar complexos de proteínas após a indução de danos ao DNA em culturas de células em suspensão. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no reparo de danos ao DNA, como organização e regulação espaço-temporal e como diversas vias de reparo respondem a diferentes tipos de danos ao DNA. As principais vantagens dessa técnica são que ela é relativamente simples, requer um baixo número de células e não requer processamento extensivo, o que pode interromper ou alterar as interações proteína-proteína.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o reparo do DNA, a formação de complexos proteicos em células em suspensão de cultura, ele também pode ser aplicado em células aderentes cultivadas, tecidos congelados ou embebidos em parafina e até animais inteiros. A linha celular linfoblástica aguda de células b BCR positiva humana, BV-173, é usada neste estudo e cultivada em IMDM com suplementos a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de CO2. Coloque as células em duas vezes 10 elevado a sexto por mililitro em uma placa de seis poços a cinco mililitros por poço.

Para deter as células na fase G1 do ciclo celular, adicione cinco micromolares de metanossulfonato de amônio a cada poço e incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de CO2. No dia seguinte, adicione cinco micromolares de um inibidor de ATM a cada um dos dois poços e retorne a placa à incubadora por 30 minutos. Em seguida, induza danos ao DNA adicionando 50 nanogramas por mililitro de NCS a um dos poços que foi pré-tratado com o inibidor de ATM e a outro poço que não foi pré-tratado.

Incubar por duas horas. Prepare 1XPBS mais 10% BSA colocando cinco gramas de fração 5 BSA em cima de 50 mililitros de 1XPBS em um béquer e deixe descansar em temperatura ambiente sem agitar ou mexer até que o BSA seja dissolvido. Lentamente, filtre a solução PBS mais 10% BSA através do filtro de 0,22 micrômetro e mantenha no gelo.

Colha as células transferindo o conteúdo de cada poço para um tubo de 15 mililitros. Lave as células duas vezes com 1XBPS gelado. Após a contagem das células, ressuspenda duas vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro em 1XBPS mais 10% BSA.

Mantenha as células no gelo. Prepare as lâminas de microscopia para este procedimento, polindo-as cuidadosamente com tecido sem fiapos e desengordurando-as colocando um etanol a 96% em um frasco de Coplin por cinco minutos. Deixe as lâminas secarem ao ar por 10 minutos.

Monte as lâminas de microscopia nos funis de citologia de citospin com uma área de seis mililitros. Pré-revestir as lâminas pipetando 50 microlitros de 1XPBS mais 10% BSA em cada funil e centrifugue por um minuto a 500 RPM. Em cada funil, adicionar 100 microlitros da suspensão celular e centrifugar a 500 RPM por cinco minutos.

Desmonte cuidadosamente os funis e certifique-se de não tocar nos pontos nas lâminas. Use um bloqueador de líquido de caneta de Papanicolau com uma ponta de cinco milímetros para desenhar um círculo ao redor de cada ponto. Em seguida, adicione 50 microlitros de solução de fixação de 4% PFA em cada ponto.

E incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Após 30 minutos, lave as células com 1XPBS em um frasco Coplin em temperatura ambiente com agitação suave. Lave três vezes dessa maneira por cinco minutos de cada vez.

Seque as lâminas ao redor das manchas com um lenço de papel sem fiapos e remova o máximo de líquido possível das manchas, inclinando a lâmina e secando com um lenço de papel sem fiapos. Adicione 50 microlitros de 0,25% Triton X em 1XPBS a cada local e incube por 10 minutos em temperatura ambiente sem agitação. Lave as lâminas em 50 a 60 mililitros de TBS-T em um frasco Coplin em temperatura ambiente com agitação suave.

Três vezes por cinco minutos de cada vez. Antes de bloquear, retire o TBS-T e seque as lâminas ao redor das manchas com um lenço de papel sem fiapos. Remova o máximo de líquido possível do local.

Um breve vórtice da solução de bloqueio e, em seguida, adicione uma gota de cerca de 40 microlitros a cada ponto. Coloque as lâminas em uma câmara umidificada pré-aquecida e incube por uma hora a 37 graus Celsius. Prepare os coquetéis de anticorpos.

Vortex e, em seguida, pipeta o diluente de anticorpos comerciais em cada tubo de microcentrífuga. Adicione o anticorpo anti-ATM de cabra a 1:1000. E o anticorpo antifosserina-15 p53 de coelho a 1:100.

Para experimentos de controle de anticorpos únicos, prepare diluições de anticorpos contendo apenas o anticorpo anti-ATM de cabra e apenas o anticorpo antifosserina-15 p53 de coelho. Ao final da incubação de uma hora, retire a solução de bloqueio, mas tome cuidado para não deixar as células secarem. Adicione 30 microlitros de cada diluição de coquetel de anticorpos e incube em uma câmara umidificada a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, lave as lâminas com tampão de lavagem 1X NC2 A em um frasco Coplin em temperatura ambiente com agitação suave duas vezes por cinco minutos de cada vez. Depois que as lâminas foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem, bata no tampão de lavagem das lâminas e adicione 30 microlitros da mistura de sonda de ensaio de ligadura de proximidade a cada ponto. Incube a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida por uma hora.

Lave as lâminas com 50 a 60 mililitros de tampão de lavagem A em um frasco Coplin em temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, prepare a solução de ligase de ligadura no gelo, adicionando um microlitro de ligase a 39 microlitros de solução de ligadura para cada mancha. Adicione 40 microlitros da solução de ligase ligada a cada mancha.

Incube a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida por 30 minutos. Lave as lâminas com tampão de lavagem A em um frasco Coplin em temperatura ambiente com agitação suave. Prepare a mistura de amplificação da polimerase no gelo.

Diluir primeiro a solução-mãe de amplificação de um a cinco em água. E adicione 0,5 microlitros de polimerase a 39,5 microlitros de solução de amplificação 1X para cada ponto. Retire o tampão de lavagem e adicione 40 microlitros de mistura de polimerase de amplificação por ponto.

Incube a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida por 100 minutos. Ao final da incubação de 100 minutos, retire a mistura de amplificação da polimerase e lave as lâminas com o tampão de lavagem 1X NC2 B em um frasco de Coplin. À temperatura ambiente com agitação suave duas vezes por 10 minutos cada.

Depois disso, lave as lâminas em 0,01x tampão de lavagem B por um minuto. Retire o excesso de tampão de lavagem B e seque as lâminas ao redor das manchas com um lenço de papel sem fiapos. Remova o máximo de líquido possível do local.

Prepare DAPI contendo meio de montagem que não manchará demais os núcleos diluindo DAPI contendo meio de montagem 1:5 em meio de montagem sem DAPI. Adicione 25 a 30 microlitros do DAPI diluído contendo meio de montagem a uma lamínula de 24 milímetros por 24 milímetros. Pegue a lamínula com a corrediça e aplique uma leve pressão para garantir que não haja bolhas de ar presas.

Sele a lamínula com esmalte e aguarde pelo menos 15 minutos antes de fazer a imagem. Por fim, crie imagens e analise as lâminas usando um microscópio de fluorescência confocal. O ensaio de ligação de proximidade foi usado para investigar a interação entre ATM e fosfosserina 15 p53 em células positivas BCR humanas BV 173 presas na fase G1.

Em contraste com as células que não foram tratadas com NCS para induzir danos ao DNA, a maioria das células tratadas com NCS tinha sinais pontuais exclusivamente no núcleo, com uma média de sete sinais por célula. Isso indica que a indução de dano ao DNA resulta na interação entre ATM e fosfoserina 15 p53. O pré-tratamento das células com um inibidor específico da ATM quinase antes da indução do dano ao DNA diminui o número de sinais para uma média de dois sinais por célula, confirmando que a fosforilação do p53 no resíduo de serina 15 dependia da atividade da ATM quinase.

Experimentos de controle de anticorpos únicos nos quais o anticorpo anti-ATM ou antifosserina 15 p53 foi emitido não produziram nenhum sinal conforme o esperado. Esta figura apresenta a quantificação e análise estatística dos resultados que demonstram e confirmam a especificidade da técnica de ensaio de ligação de proximidade em preparações de citospina de culturas de células em suspensão. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de cinco horas após uma incubação noturna com um anticorpo primário, se for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de titular cuidadosamente o anticorpo por coloração por imunofluorescência das células de seu interesse antes de realizar o ensaio de ligadura de proximidade. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em biologia celular explorarem interações proteína-proteína transitórias que são difíceis de avaliar usando métodos padrão, como imunoprecipitações e imagens baseadas em FRET, que geralmente resultam em artefatos técnicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o ensaio de ligação de proximidade em culturas de células em suspensão para visualizar e quantificar a interação proteína-proteína in situ.