Name: Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Aprenda a usar o ensaio de ligação de proximidade (PLA) para detectar e visualizar complexos proteicos induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão. Este método permite quantificar interações entre proteínas de reparo celular.

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A pesquisa no laboratório Guikema é financiada pelo Programa de Incentivos à Pesquisa Innovacional da Organização para Pesquisa Científica dos Países Baixos (concessão VIDI 016126355) e o KiKA &quot;Stichting Kinderen Kankervrij&quot; (projeto 252).

1. Tratamento de indução de células e dano de DNA <ol><li> Cultive as linhas celulares linfoblásticas agudas BCR-ABL + B celulares BV173 ou SUP-B15 em IMDM suplementado com FCS a 20%, β-mercaptoetanol 50 μM, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U / mL e estreptomicina 100 μg / mL em 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 . Conte células e placa a 2 x 10 6 células / mL em placas de 6 poços, a 5 mL / poço. NOTA: Opcionalmente, as linhas celulares de suspensão de várias origens podem ser usadas. </li><li> Para prender as células BCR-ABL + B-ALL na fase G1 do ciclo celular, adicione 5 μM de metanossulfonato de imatinib (STI571) e incube durante a noite. <ol><li> Opcionalmente, omita esse passo ao estudar as interações proteína-proteína ao longo do ciclo celular ou em tipos de células BCR-ABL-negativas. </li></ol></li><li> Induzir o dano do DNA adicionando 50 ng / mL de neocarzinostatina (NCS) à cultura e incubar durante 2 h. <ol><li> Alternativamente,Induz o dano do DNA irradiando as células usando uma fonte radioativa [ 137 Cs] a 0,5 Gy / min, a uma dose de 5 Gy. Após a irradiação, deixe a célula se recuperar durante 2 h a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 . </li></ol></li><li> Opcionalmente, para avaliar o envolvimento da atividade de cinase ATM em resposta ao dano do DNA, adicione 5 μM do inibidor de quinase ATM KU55933 antes da adição de NCS ou o tratamento de irradiação. </li><li> Prepare 1x PBS + 10% de BSA colocando 5 g de fração-V BSA em cima de 50 mL de 1x PBS em uma taça ou balão Erlenmeyer, e deixe-se sentar à TA até BSA dissolver. Não agite ou mexa, pois isso irá causar espuma extensiva. Filme lentamente através de um filtro de 0,22 μm e continue com gelo. </li><li> Coloque células e lave duas vezes com 1x PBS gelado. Contar as células e ressuspender a 2 x 10 6 / mL em 1x PBS + BSA a 10%. Mantenha as células no gelo. </li></ol> 2. Cytocentrifugação, Fixação e Permeabilização <ol><li> Prepare o4% de solução de paraformaldeído em 1x PBS recém-adicionada. Adicione 2 g de PFA a 50 mL de 1x PBS e incube em um banho de água com agitação a 55 ° C até a solução ficar limpa. Filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm e armazene na RT até o uso. NOTA: Opcionalmente, o fixador de 4% de PFA pode ser armazenado congelado a -20 ° C. Após o congelamento, descongelar apenas uma vez para uso. Caso contrário, a solução 4% PFA no PBS pode ser comprada diretamente. </li><li> Pulverize cuidadosamente lâminas de microscopia de 76 mm x 26 mm com tecido sem fiapos e desengordem-nas colocando em etanol a 96% em um frasco de Coplin por 5 min. Deixe a microscopia deslizar para secar ao ar por 10 min. </li><li> Monte as lâminas de microscopia nos funis de citostas / citologia com uma área de 6 mm. Pré-revestir os slides por pipetagem de 50 μL de 1x PBS + BSA a 10% em cada funil e centrifugar durante 1 min a 500 rpm. </li><li> Adicionar 100 μL da suspensão celular (igual a 0,2 x 10 6 células) a cada funil e centrifugar durante 5 minutos a 500 rpm. Para cada combinação de anticorpos, aoSão necessárias 4 preparações (experiência com dois anticorpos, dois controles de anticorpos simples, sem controle de anticorpos). </li><li> Desmonte cuidadosamente os funis e certifique-se de não tocar nos pontos. Proceda imediatamente à fixação da amostra. <ol><li> Opcionalmente, deixe as lâminas secar ao ar durante pelo menos 30 min. Após a secagem ao ar, envolva os lâminas individualmente em papel alumínio e guarde-a a -20 ° C até o uso. Ao usar preparações congeladas, assegure-se de descongelar as lâminas enroladas em uma toalha de papel para evitar condensação aberta sobre as lâminas. </li></ol></li><li> Desenhe um círculo (diâmetro aproximado de 15-20 mm) ao redor do local usando um bloqueador de líquido de caneta PAP (dica de 5 mm). </li><li> Adicione 50 μL de solução de fixação de 4% de PFA a cada mancha e incube durante 30 min à TA. </li><li> Lave as células 3 vezes durante 5 min com 1x PBS em um frasco de Coplin à RT com agitação suave. </li><li> Seca as lâminas em torno das manchas com um tecido sem fiapos e remova o máximo de líquido do local com um piPet sem tocar no local, ou inclinando o slide. Adicionar 50 μL de Triton-X a 0,25% em 1x PBS a cada ponto e incubar durante 10 min à TA sem agitação. </li><li> Lave os slides 3 vezes durante 5 minutos em ~ 50-60 mL de Tween-20 a 0,05% em TBS (TBS-T) em um frasco de Coplin à RT com agitação suave. 10 slides podem ser processados ​​simultaneamente desta forma. </li></ol> 3. Bloqueio e Incubação primária de anticorpos <ol><li> Toque fora o TBS-T e retire as lâminas em torno das manchas com um tecido sem fiapos. Remova o máximo possível de líquido do local usando uma pipeta sem tocar no local ou inclinando o slide. Em breve vórtice a solução de bloqueio e adicione uma gota (~ 40 μL) a cada ponto. Incubar durante 1 h a 37 ° C numa câmara humidificada pré aquecida. </li><li> Prepare o coquetel de anticorpos misturando o cabra anti-ATM a 1: 1000 e o coelho-anti-fosfo-Ser15-p53 a 1: 100 em diluente de anticorpo comercial, diluente de anticorpo vortex antes da utilização. Para o experimento de controleTs, preparar diluições de anticorpos contendo apenas a cabra anti-ATM e apenas o anticorpo anti-fígado-Ser15-p53 do coelho (controles de anticorpos únicos). </li><li> Toque a solução de bloqueio, mas tome cuidado para não deixar as células secar antes de adicionar as diluições de anticorpos. Adicionar 30 μL de cada diluição de coquetel de anticorpos e incubar numa câmara humidificada durante a noite a 4 ° C. </li><li> Prepare in situ Wash Buffer A e Wash Buffer B dissolvendo o conteúdo de uma bolsa de tampão A e Buffer B em um volume final de 1.000 mL de água cada. <ol><li> Alternativamente, prepare o tampão de lavagem A dissolvendo 8,8 g de NaCl, 1,2 g de Tris-base e 0,5 mL de Tween-20 em 800 mL de água. Ajuste o pH para 7.4 usando HCl e adicione-se a um volume final de 1.000 mL. </li><li> Alternativamente, prepare o tampão de lavagem B dissolvendo 5,84 g de NaCl, 4,24 de Tris-base e 26,0 g de Tris-HCl em 500 mL de água. Ajuste o pH para 7,5 usando HCl. Adicione água a um volume final de 1.000 mL. </li><li> FiltroAmbas soluções através de um filtro de 0,22 μm. </li></ol></li><li> Lave as lâminas 2 vezes durante 5 minutos com 1x tampão de lavagem in situ A em um frasco de Coplin à temperatura ambiente com agitação suave. </li></ol> 4. Sondas PLA, ligadura e amplificação <ol><li> Prepare as sondas de PLA diluindo o anti-cabra PLUS e o anti-coelho MINUS tanto 1: 5 no diluente de anticorpo comercial. Toque no 1x tampão de lavagem in situ A das lâminas e adicione 30 μL da mistura da sonda PLA a cada ponto. Incube 1 h a 37 ° C numa câmara humidificada pré-aquecida. NOTA: Qualquer combinação de sondas de anticorpos secundários PLUS e MINUS PLA pode ser usada (anti-mouse, anti-coelho, anti-cabra), desde que os anticorpos primários aplicados sejam criados em diferentes espécies e a combinação de sondas de PLA deve sempre Contém uma sonda PLUS e uma sonda MINUS. </li><li> Lave as lâminas 2 vezes durante 5 min com ~ 50-60 mL 1x tampão de lavagem in situ A em um frasco de Coplin à RT com agitação suave. &lt;/ Li&gt; <li> Prepare a solução de Ligação-Ligase em gelo adicionando 1 μL de Ligase a 39 μL de solução de Ligação e adicione 40 μL de solução Ligação-Ligase a cada ponto. Incubar 30 min a 37 ° C numa câmara humidificada pré aquecida. </li><li> Lave os slides 2 vezes por 5 min com ~ 50-60 mL 1x tampão de lavagem in situ A em um frasco de Coplin à TA com agitação suave. </li><li> Prepare a mistura Amplification-Polymerase em gelo diluindo a solução de estoque de amplificação 1: 5 em água. Em seguida, adicione 0,5 μL de polimerase a 39,5 μL de 1x solução de amplificação para cada ponto. NOTA: Os reagentes de amplificação são sensíveis à luz e devem ser protegidos contra exposição direta à luz. O reagente de amplificação vem em quatro cores diferentes (RED: excitação 594 nm, emissão 624 nm; FarRED: excitação 644 nm, emissão 669 nm; LARANJA: excitação 554 nm, emissão 576 nm; GREEN: excitação 501 nm, emissão 523 nm), Certifique-se de que a configuração de microscopia disponível tenha sPossíveis propriedades de excitação e filtros para criar imagens dessas cores. </li><li> Toque fora 1x tampão de lavagem in situ A e adicione 40 μL de mistura de Amplificação-Polimerase por local. Incubar durante 100 minutos a 37 ° C numa câmara humidificada pré-aquecida. </li></ol> 5. Montagem e Imaging <ol><li> Prepare 0,01 x tampão de lavagem in situ B adicionando 1 mL de 1x tampão de lavagem B a 99 mL de água. </li><li> Toque fora a mistura Amplificação-Polimerase e lave as lâminas 2 vezes durante 10 min com 1x tampão de lavagem in situ B em um frasco de Coplin à RT com agitação suave. </li><li> Lave as lâminas 1 min em tampão de lavagem 0,01x B. </li><li> Toque o excesso de 0,01 x tampão de lavagem B e seque as lâminas em torno das manchas com um tecido sem fiapos. Remova o máximo possível de líquido do local usando uma pipeta sem tocar no local ou inclinando o slide. </li><li> Diluir o meio de montagem contendo DAPI 1: 5 em meio de montagem sem DAPI para evitar o excesso de núcleos. </li><li> Adicione 25-30 μL de meio de montagem contendo DAPI 1: 5 para uma lamínula de 24 mm x 24 mm e pegue a tampa com a corrediça, aplique uma ligeira pressão para garantir que não haja bolhas de ar presas. Selar a lamínula com esmalte de unhas e aguarde pelo menos 15 minutos antes da imagem. </li><li> Analise as lâminas usando um microscópio de fluorescência (confocal). <ol><li> Contar o número de sinais PLA pontuais por célula em pelo menos 4 campos de imagem adquiridos (objetivo 20x, contando pelo menos 20 células por condição ou combinação de anticorpos, com base em um cálculo de potência usando uma média antecipada de sinais de 7 ± 5 nas células tratadas, E 2 ± 2 sinais nas células não tratadas, com uma probabilidade de um erro de tipo I de 0,05, e uma potência de 80%, conforme relatado anteriormente 15 ). NOTA: A melhor resolução é conseguida através da aquisição de uma pilha Z e uma deconvolução usando pacotes de software ( por exemplo , ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS)). O signaDeve ser prontamente discernível dentro do perímetro nuclear, conforme definido pela coloração DAPI. </li><li> Não conte sinais que aparecem claramente fora dos núcleos. Tipicamente, o tratamento NCS ou a irradiação γ resulta em aproximadamente 5-10 sinais PLA de phosho-p53 / ATM por célula. Os controles de &quot;anticorpo único&quot; podem dar algum sinal de fundo, mas isso não deve exceder 1-2 sinais PLA por 1 em cada 20 células. </li><li> Para fins de publicação e apresentação, capture imagens usando um objetivo de óleo de imersão 40X ou 63X. As lâminas podem ser armazenadas a 4 ° C e devem ser protegidas da exposição à luz. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste relatório, é demonstrado que PLA pode ser usado para determinar e visualizar a interação específica entre proteínas em culturas de células em suspensão. De notar que o protocolo aqui descrito não se restringe ao estudo de complexos de reparo de DNA, mas também se aplica para visualizar e quantificar outras interações proteína-proteína em culturas de células em suspensão. Mostra-se que a quinasa ATM interage com p53 fosforilada em células BCR-ABL + B-ALL presas em G1 quando expostas a um agente indutor de danos ao ...

O dano do DNA desencadeia uma série altamente regulada de eventos envolvendo interações proteína-proteína e modificações pós-tradução que garantem o reparo eficiente e rápido do DNA, salvaguardando assim a integridade genômica 1 . Tipicamente, o reparo do DNA é estudado em células expostas à radiação ionizante, monitorando a formação dos chamados focos induzidos por radiação ionizante (IRIF) por microscopia de fluorescência (confocal). Muitas proteínas de detecção e detecção de dano do DNA formam IRIFs, que representam complexos de proteínas que nucleam em locais de cromatina sustentando dano de DNA 2 , 3 . A localização e a resolução dos IRIF ao longo do tempo fornecem uma visão importante da organização espaciotemporal do reparo do DNA e podem indicar o envolvimento de diferentes caminhos de reparo do DNA. A natureza do dano do DNA eo estágio do ciclo celular em que o dano é atingido determinam qual caminho de reparo do DNA é ativado. Fo<html> Por exemplo, em células ativamente envolvidas na replicação de DNA (fase S), a recombinação homóloga (HR) é a via de reparo do DNA dominante, enquanto que nas células na fase G1 ou G2 / M do ciclo celular, a célula não- É predominante a via de reparo homóloga de junção final (NHEJ). Um dos primeiros eventos após o dano do DNA é a ativação das cinases sensíveis ao dano do DNA Ataxia Telangiectasia-proteína mutada (ATM), que é principalmente ativa nas fases G1 e G2 / M do ciclo celular e regula o NHEJ, E Ataxia Telangiectasia e Proteína Relacionada a Rad3 (ATR), que atua em fase S ativando a FC. Ambos ATM e ATR são quinases muito pleiotrópicas que fosforilam muitas proteínas envolvidas no reparo do DNA, morte celular e sobrevida 4 . Ambas as quinases demonstraram fosforilar e ativar a proteína supressora de tumores p53 após a exposição ao estresse genotóxico, indicando que essas cinases são mediadores a montante de um eixo de sinalização de supressão de tumor fundamental&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 . A formação e a composição dos IRIFs são tipicamente avaliadas pela determinação da co-localização de diferentes proteínas usando coloração e microscopia de imunofluorescência de duas cores, no entanto, nem todas as proteínas que fazem parte dos complexos de proteínas de reparo formam IRIFs, o que limita a aplicabilidade desta abordagem. Além disso, a microscopia de imunofluorescência (confocal) é limitada pelas propriedades de difracção da luz, resultando em uma resolução espacial bastante fraca de cerca de 200-300 nm, excedendo o tamanho da maioria das estruturas subcelulares, o que essencialmente proíbe a interrogação direta das interações proteína-proteína ao O nível molecular. Como tal, a co-localização de padrões de coloração de imunofluorescência como detectada por microscopia de fluorescência (confocal) não é necessariamente indicativa de interações diretas proteína-proteína. Recentemente, novas tecnologias de super-resolução foram desenvolvidas, como a estrutura tridimensionalMicroscopia de iluminação tingida (3D-SIM) 7 , que foi utilizada com sucesso para estudar a formação de IRF de 53BP1 e BRCA1 em detalhes de nano-escala, revelando as características de distribuição espacial dessas proteínas que não foram detectadas por microscopia confocal de varredura a laser 8 . Vários outros métodos podem ser usados ​​para detectar interações proteína-proteína in vivo , tais como métodos de co-imunoprecipitação, pull-down e abordagens de rastreio de dois híbridos de fermento. No entanto, essas técnicas são bastante pesadas, exigem grandes quantidades de células ou proteínas ou envolvem a superexpressão de proteínas, que introduzem artefatos experimentais. Mais recentemente, desenvolveu-se uma nova técnica que permite a visualização e quantificação de interações proteína-proteína in situ ( isto é, nas células e nos tecidos), denominada Ensaio de Ligação Proxima (PLA) 9 , 10 . PrOs anticorpos imateriais que reconhecem duas proteínas de interesse são detectados por anticorpos secundários que são conjugados com oligonucleótidos (as chamadas sondas PLA). Se os dois anticorpos secundários diferentes forem suficientemente próximos devido às interacções entre as proteínas reconhecidas pelos anticorpos primários, os oligonucleótidos conjugados hibridam e podem ser ligados para formar um substrato de ADN circular fechado. Este substrato circular é subsequentemente amplificado por amplificação do círculo circulante e visualizado com oligonucleótidos complementares conjugados com fluorochrome. Usando PLA, a localização subcelular da interação proteína-proteína é preservada à medida que o produto de amplificação do círculo de rolamento com marcação fluorescente permanece ligado às sondas PLA. A resolução deste ensaio é &lt;50 nm, com base no achado de que o diâmetro de um anticorpo é de aproximadamente 7-10 nm 11 . A amplificação do círculo circulante só pode ocorrer no caso de dois pares de anticorpos (primário + segundo planoDary) interagem fisicamente dentro do perímetro que é definido pelo seu tamanho (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). O passo de amplificação do sinal aumenta a sensibilidade do ensaio de PLA e permite a detecção de interações de proteínas raramente expressas. O PLA gera padrões de sinais pontuais e focos que podem ser quantificados por célula, pelo qual a variação intra e intercelular nas interações proteína-proteína pode ser avaliada. A formação e composição de complexos de reparo de DNA e IRIFs são principalmente estudadas em linhas celulares aderentes, como a linha celular epitelial de osteossarcoma de osso humano U2OS, a linha de células de rim embrionárias humanas HEK293 e a linha de células epiteliais de pigmento retiniano RPE-1, Crescente e fácil de transfectar. As culturas de células de suspensão, tais como linhagens linfóides e mieloides, são usadas com menos frequência, uma vez que estas são menos favoráveis ​​à transfecção e, em geral, não aderem aos lamínulas, exigindo, assim, uma alternativa adicionalEps para imagens. A resolução do dano do DNA é, no entanto, muito relevante no contexto de malignidades linfóides e mielóides, uma vez que a resposta ao dano do DNA é freqüentemente afetada por aberrações genômicas (excitadores) nesses tumores, desempenhando um papel fundamental na transformação maligna de linfóides e mieloides normais ( Células progenitoras 12 , 13 , 14 . Este protocolo descreve como o PLA pode ser usado para avaliar e quantificar as interações proteína-proteína após a indução do dano do DNA em culturas de células em suspensão. Aqui, o PLA é realizado para determinar e visualizar as interações entre ATM e p53 após o dano do DNA em células de leucemia de células B humanas que são induzidas a sofrer uma parada do ciclo celular em fase G1. De notar que o protocolo aqui apresentado não se restringe ao estudo de interações ATM e p53 em células de leucemia detidas por G1, mas também pode ser usado para visualizar outras proteínas-proteína interativaEm vários tipos de células e culturas de células suspensas.

<table><tbody><tr><td>Linha celular BV173</td><td>DSMZ</td><td>AC-20</td><td>BCR-ABL+ Linha celular B-ALL</td></tr><tr><td>Linha celular SUP-B15 Linha celular</td><td>DSMZ</td><td>ACC-389</td><td>BCR-ABL+ B-ALL Linha celular</td></tr><tr><td>Meio Dulbecco's Modificado de Iscove (IMDM)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Soro de bezerro fetal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>lote #: 064M3396</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco (Life Technologies)</td> <td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicilina / estreptomicina</td><td>Gibco (Life Technologies)</td> <td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>imatinibe metanossulfonato</td><td>LC Laboratories</td><td>I-5508</td><td>Dissolva em DMSO, prepare a solução estoque 10 mM</td></tr><tr><td>neocarzinostatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N9162</td><td>Mutagênico / teratogênico, manuseie com cuidado</td></tr><tr><td>KU55933</td><td>Selleckchem</td><td>S1092</td><td>Dissolva em DMSO, prepare a solução estoque de 5 mM</td></tr><tr><td>Lâminas de microscopia Starfrost</td><td>Waldemar Knittel</td><td>VA11200 003FKB</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador de líquido da caneta PAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Funil</td><td>Cytospin Q Path Labonord SAS</td><td>003411324</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Red Starter Kit Cabra/Coelho</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DUO92105</td><td>Disponível para diferentes espécies/combinações, também disponível em FarRED, Orange e Green</td></tr><tr><td>goat-anti-ATM</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-136A</td><td>PLA-grade; usamos com sucesso o lote # A300-136A-1 em nossos estudos</td></tr><tr><td>rabbit-anti-phospho-Ser15-p53</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9284</td><td>Usamos com sucesso o lote # 9284-4 em nossos estudos</td></tr><tr><td>Meio de montagem antidesbotamento Vectashield com DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield meio de montagem antidesvanecimento</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldeído em PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Também disponível de vários outros fornecedores</td></tr></tbody></table>

detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do dna em culturas de células de suspensão usando o ensaio de ligação de proximidade

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

A resposta ao dano do DNA orquestrou o reparo de lesões de DNA que ocorrem espontaneamente, são causadas por estresse genotóxico ou aparecem no contexto de quebras de DNA programadas em linfócitos. A Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM e Rad3-kinase (ATR) e a subunidade catalítica de DNA-dependente Protein Kinase (DNA-PKcs) estão entre os primeiros que são ativados após a indução do dano do DNA, e são Reguladores centrais de uma rede que controla o reparo do DNA, a apoptose e a sobrevivência celular. Como parte de uma via supressora de tumor, ATM e ATR ativam p53 através da fosforilação, regulando assim a atividade transcricional de p53. O dano do DNA também resulta na formação dos chamados focos induzidos por radiação ionizante (IRIF) que representam complexos de sensor de dano de DNA e proteínas de reparo que se acumulam nos locais de dano do DNA, que são visualizados por microscopia de fluorescência. A co-localização de proteínas em IRIFs, no entanto, não implica necessariamente dInterações proteína-proteína diretas, uma vez que a resolução da microscopia de fluorescência é limitada. In-situ Proximity Ligation Assay (PLA) é uma técnica inovadora que permite a visualização direta de interações proteína-proteína em células e tecidos com especificidade e sensibilidade sem precedentes. Esta técnica é baseada na proximidade espacial de anticorpos específicos que se ligam às proteínas de interesse. Quando as proteínas interrogadas estão dentro de ~ 40 nm, uma reacção de amplificação é desencadeada por oligonucleótidos que são conjugados com os anticorpos e o produto de amplificação é visualizado por marcação fluorescente, produzindo um sinal que corresponde à localização subcelular das proteínas que interagem. Usando a interação funcional estabelecida entre ATM e p53 como exemplo, é demonstrado aqui como o PLA pode ser usado em culturas de células suspensas para estudar as interações diretas entre proteínas que são partes integrantes da resposta de danos ao DNA.

A fosforilação de p53 no resíduo Ser15 mostrou-se dependente da actividade de quinase ATM 16 . Para demonstrar e confirmar a especificidade da técnica de PLA em preparações de citospina de culturas de células em suspensão, mostra-se que a indução de dano do DNA por 2 h de tratamento NCS de células BCR-ABL + B-ALL presas na fase G1 do ciclo celular Resultou na interação específica entre ATM e phospho-Ser15-p53, como esperado. Os sinais PLA punctivos foram observado...

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

O objetivo geral deste experimento com ensaio de ligação por proximidade é visualizar e quantificar a formação de complexos de proteínas envolvidas na resposta e reparo de danos ao DNA após a indução de lesões no DNA em culturas celulares em suspensão. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo do reparo de danos ao DNA, tais como a organização espaciotemporal e a regulação dos processos, bem como a forma pela qual diferentes vias de reparo respondem a tipos variados de dano ao DNA. As principais vantagens desta técnica são sua relativa simplicidade, a necessidade de um baixo número de células e a ausência de etapas extensas de processamento, o que poderia perturbar ou alterar as interações proteína-proteína.Embora este método possa fornecer informações sobre reparo de DNA e formação de complexos proteicos em células em suspensão na cultura, ele também pode ser aplicado em células aderentes cultivadas, tecidos congelados ou emblocados em parafina e até em animais inteiros. A linhagem celular humana de leucemia linfoide aguda de células B positiva para BCR, BV-173, é utilizada neste estudo e cultivada em IMDM com suplementos a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% CO2. Plaque as células a duas vezes 10 à sexta por mililitro em uma placa de seis poços com cinco mililitros por poço.Para deter as células na fase G1 do ciclo celular, adicione cinco micromolares de metanosulfonato de amônio a cada poço e incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% CO₂. No dia seguinte, adicione cinco micromolares de um inibidor de ATM a cada um dos dois poços e retorne a placa ao incubador por 30 minutos. Em seguida, induza danos no DNA adicionando 50 nanogramas por mililitro de NCS a um dos poços previamente tratados com o inibidor de ATM e a outro poço que não foi previamente tratado.Incube por duas horas. Prepare 1XPBS com 10% de BSA colocando cinco gramas de BSA fração-5 sobre 50 mililitros de 1XPBS em um béquer e deixe em repouso à temperatura ambiente, sem agitar ou mexer, até que a BSA esteja completamente dissolvida. Filtre lentamente a solução de PBS com 10% de BSA através de um filtro de 0,22 micrômetro e mantenha-a sobre gelo.Colete as células transferindo o conteúdo de cada poço para um tubo de 15 mililitros. Lave as células duas vezes com 1X BPS gelado. Após a contagem das células, re-suspenda em 2 × 10⁶ células por mililitro em 1X BPS mais 10% de BSA.Mantenha as células em gelo. Prepare as lâminas de microscopia para este procedimento polindo-as cuidadosamente com tecido livre de fiapos e desengordurando-as colocando etanol 96% em um frasco Coplin durante cinco minutos. Deixe as lâminas secarem ao ar por 10 minutos.Monte as lâminas de microscopia nos funis de citocentrifugação com uma área de seis mililitros. Pré-revesta as lâminas pipetando 50 microlitros de PBS 1X contendo 10% de BSA em cada funil e centrifugue por um minuto a 500 RPM. Adicione a cada funil 100 microlitros da suspensão celular e centrifugue a 500 RPM por cinco minutos.Desmonte cuidadosamente os funis e certifique-se de não tocar nas manchas dos lâminas. Use um bloqueador líquido com caneta Pap com ponta de cinco milímetros para desenhar um círculo ao redor de cada mancha. Em seguida, adicione 50 microlitros de solução fixadora de 4% PFA a cada mancha.E incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Após 30 minutos, lavar as células com PBS 1X em um frasco Coplin à temperatura ambiente com agitação suave. Lavar três vezes dessa maneira, por cinco minutos cada vez.Seque as lâminas ao redor das amostras com um lenço livre de fiapos e remova o máximo de líquido possível das amostras inclinando a lâmina e secando com um lenço livre de fiapos. Adicione 50 microlitros de Triton X 0,25% em 1XPBS a cada amostra e incube por 10 minutos à temperatura ambiente sem agitação. Lave as lâminas em 50 a 60 mililitros de TBS-T em um frasco de Coplin à temperatura ambiente com agitação suave.Três vezes por cinco minutos cada vez. Antes do bloqueio, remova o TBS-T batendo levemente e seque as lâminas ao redor das manchas com um tecido livre de fiapos. Remova o máximo de líquido possível da mancha.Vortexe brevemente a solução bloqueadora e, em seguida, adicione uma gota de aproximadamente 40 microlitros a cada local. Coloque as lâminas em uma câmara umidificada pré-aquecida e incube por uma hora a 37 graus Celsius. Prepare os coquetéis de anticorpos.Vortex e, em seguida, pipete o diluente comercial de anticorpos em cada tubo de microcentrífuga. Adicione o anticorpo de cabra anti-ATM na diluição de 1:1000 e o anticorpo de coelho anti-fosfoserina-15 p53 na diluição de 1:100.Para experimentos de controle com um único anticorpo, prepare diluições de anticorpos contendo apenas o anticorpo de cabra anti-ATM e apenas o anticorpo de coelho anti-fosfoserina-15 p53. Após a conclusão da incubação de uma hora, remova cuidadosamente a solução de bloqueio, tomando cuidado para que as células não sequem. Adicione 30 microlitros de cada diluição de coquetel de anticorpos e incube em câmara umidificada a quatro graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, lave as lâminas com tampão de lavagem A 1X NC2 em um frasco Coplin à temperatura ambiente com agitação suave, duas vezes, por cinco minutos cada vez. Após as lâminas terem sido lavadas duas vezes com o tampão de lavagem A, remova cuidadosamente o tampão das lâminas e adicione 30 microlitros da mistura de sondas do ensaio de ligação por proximidade a cada ponto. Incube a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida por uma hora.Lave as lâminas com 50 a 60 mililitros de tampão de lavagem A em um frasco Coplin à temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, prepare a solução de ligase de ligação em gelo adicionando um microlitro de ligase a 39 microlitros de solução de ligação para cada ponto. Adicione 40 microlitros da solução de ligase de ligação a cada ponto.Incube a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida por 30 minutos. Lave as lâminas com o tampão de lavagem A em um frasco de Coplin à temperatura ambiente com agitação suave. Prepare a mistura de polimerase de amplificação em gelo.Primeiro, dilua a solução estoque de amplificação de um para cinco em água. E adicione 0,5 microlitros de polimerase a 39,5 microlitros de solução de amplificação 1X para cada ponto. Remova cuidadosamente o tampão de lavagem e adicione 40 microlitros da mistura de polimerase de amplificação por ponto.Incube a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida por 100 minutos. Ao final da incubação de 100 minutos, remova cuidadosamente a mistura de polimerase de amplificação e lave as lâminas com tampão de lavagem NC2 1X B em um frasco de Coplin. À temperatura ambiente, com agitação suave, duas vezes por 10 minutos cada.Após isso, lave as lâminas em tampão de lavagem B 0,01x por um minuto. Remova o excesso de tampão de lavagem B batendo levemente e seque as lâminas ao redor das manchas com um lenço livre de fiapos. Remova o máximo de líquido possível da mancha.Prepare um meio de montagem contendo DAPI que não superestaine os núcleos, diluindo o meio de montagem contendo DAPI na proporção de 1:5 em meio de montagem sem DAPI. Adicione de 25 a 30 microlitros do meio de montagem contendo DAPI diluído a uma lamínula de 24 milímetros por 24 milímetros. Levante a lamínula com a lâmina e aplique leve pressão para garantir que não haja bolhas de ar aprisionadas.Selar a lamínula com esmalte de unha e aguardar pelo menos 15 minutos antes da aquisição de imagens. Por fim, obter imagens e analisar as lâminas utilizando um microscópio de fluorescência confocal. O ensaio de ligação por proximidade foi utilizado para investigar a interação entre ATM e fosfoserina 15 p53 em células humanas BV 173 positivas para BCR-ABL arrestadas na fase G1.Em contraste com as células que não foram tratadas com NCS para induzir danos no DNA, a maioria das células tratadas com NCS apresentou sinais pontuais exclusivamente no núcleo, com uma média de sete sinais por célula. Isso indica que a indução de danos no DNA resulta na interação entre ATM e p53 fosforilada na serina 15. O pré-tratamento das células com um inibidor específico da quinase ATM antes da indução de danos no DNA reduz o número de sinais para uma média de dois sinais por célula, confirmando que a fosforilação de p53 no resíduo serina 15 era dependente da atividade da quinase ATM.Experimentos de controle com anticorpo único, nos quais foi omitido ou o anticorpo anti-ATM ou o anticorpo anti-fosfoserina 15 p53, não produziram nenhum sinal, conforme esperado. Esta figura apresenta a quantificação e a análise estatística dos resultados, que demonstram e confirmam a especificidade da técnica de ensaio de ligação por proximidade em preparações de citoespinagem de culturas celulares em suspensão. Após dominar a técnica, ela pode ser realizada em cerca de cinco horas, após uma incubação de 12 horas com o anticorpo primário, se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de titular cuidadosamente o anticorpo por meio de coloração de imunofluorescência das células de seu interesse antes de realizar o ensaio de ligação por proximidade. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores em biologia celular explorarem interações proteína-proteína transitórias que são difíceis de avaliar usando métodos padrão, como imunoprecipitações e imagens baseadas em FRET, que frequentemente resultam em artefatos técnicos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o ensaio de ligação por proximidade em culturas celulares em suspensão para visualizar e quantificar interações proteína-proteína in situ.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos

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Um ensaio simples, rápido e quantitativo para medida de reparação de ADN-proteína ligações cruzadas em plasmídeos transfectadas em células de mamíferos

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Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade (Vídeo) | JoVE Journal

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

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