Molecular Probe Optimization para determinar mortalidade celular em um fotossintético organismo (
29 de janeiro de 2016
Populações microbianas contêm heterogeneidade celular substancial, que pode ditar o comportamento geral. Análise sonda molecular através de citometria de fluxo pode determinar estados fisiológicos de células, no entanto a sua aplicação varia entre as espécies. Este estudo fornece um protocolo para determinar com precisão a mortalidade de células dentro de uma população cianobactéria, sem subestimar ou gravar resultados falsos positivos.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como criar um protocolo capaz de analisar efetivamente o estado fisiológico de cianobactérias, utilizando citometria de fluxo e sondas moleculares. Este protocolo pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a fisiologia celular de comunidades microbianas. A principal vantagem deste procedimento é que um protocolo otimizado com sondas fluorescentes pode distinguir entre os estados fisiológicos de cianobactérias ao nível celular individual em tempo real.
Demonstrará este procedimento David Hartnell, um estudante de doutorado que trabalha no laboratório de citometria da Universidade de Bournemouth. Antes de iniciar o experimento, coloque um tubo de hemólise vazio sobre a sonda de injeção da amostra. Clique em desobstruir.
Em seguida, realize uma lavagem reversa para iniciar o processo de limpeza da citometria de fluxo. Ao final da lavagem reversa, coloque um novo tubo de hemólise contendo dois mililitros de água ultra pura filtrada na sonda de injeção de amostra, ou SIP, e defina o tempo limite entre 10 e 15 minutos, e a velocidade fluidica como rápida. Em seguida, selecione uma nova célula de dados e ajuste os limiares relevantes de fluorescência e dispersão da luz para reduzir o ruído de fundo.
Em seguida, clique em executar. Se o número total de eventos por segundo não for inferior à recomendação do fabricante, execute dois mililitros de solução de descontaminação por dois minutos na velocidade rápida. Repita então os passos de retrolavagem e de lavagem com água ultrapura.
Para preparar um cultivo puro primário de M.aeruginosa, autoclave 98 mililitros de água filtrada ultra pura, misturada com dois mililitros de meio para algas, em um béquer de 250 mililitros durante 20 minutos a 120 graus Celsius. Quando um cultivo estiver em alta densidade no estado estacionário, desagregue dois mililitros de células por vortex. Em seguida, transfira as células sob a sonda de injeção da amostra.
Confirme que as células estão uniformemente dispersas por microscopia de luz. Em seguida, selecione um gráfico de histograma no software do citômetro de fluxo para registrar os dados de dispersão da luz para a frente. E clique em log para visualizar os dados em escala logarítmica no eixo x.
Em uma saída separada, configure outro histograma com eixo logarítmico para registrar a fluorescência natural das células de M.aeruginosa. Em seguida, selecione uma fonte de luz capaz de excitar a ficocianina e um detector que possa filtrar as emissões provenientes da fluorescência resultante. Para gravação na resolução mais alta, escolha as configurações mais próximas ao tamanho do núcleo do organismo-alvo.
E defina uma taxa de fluxo relativamente lenta. Antes de adquirir os dados, defina um limiar para excluir qualquer dispersão da luz e sinais de fluorescência causados por ruído eletrônico de fundo ou detritos da amostra celular. Em seguida, selecione uma nova célula de dados.
Crie um gráfico de densidade com os parâmetros de dispersão direta e dispersão lateral em escala logarítmica e clique em executar. Em seguida, aplique o gate de dispersão direta da luz e fluorescência natural aos dados de dispersão direta por dispersão lateral para excluir sinais de dispersão de baixo nível e incluir apenas os sinais mais altos de fluorescência relativa de ficocianina. Depois, colete eventos até que a amostra termine e use os dados para determinar a contagem inicial de células.
Para otimizar a captação celular da sonda molecular, exponha metade da monocultura previamente preparada às condições apropriadas para gerar um controle morto. Verifique as variações no microambiente da amostra para confirmar a morte da cultura. Em seguida, desagregue a formação da colônia conforme demonstrado anteriormente.
Em seguida, selecione um laser de 488 nanômetros juntamente com um detector capaz de registrar a fluorescência das sondas nucleotídicas verdes e laranjas. E o laser de 640 nanômetros para registrar os sinais de ficocianina por meio de seus detectores respectivos. Em uma nova planilha de dados, configure um gráfico de densidade com os parâmetros de dispersão para frente e dispersão lateral.
Em seguida, crie um histograma utilizando o canal do detector óptico da sonda molecular respectiva. Um histograma para detectar as emissões de ficocianina e um histograma para eventos de espalhamento para a frente, todos em escala logarítmica. Execute as amostras de cianobactérias usando diferentes concentrações e tempos de incubação.
Crie um gate no histograma de dispersão para frente para incluir apenas eventos com o tamanho celular do organismo-alvo. E aplique-o ao canal correspondente da sonda fluorescente. Em seguida, no canal da sonda fluorescente, crie outro gate inclusivo no software contra o pico mais alto do histograma.
E, posteriormente, delimite a fluorescência correspondente da sonda positiva no gráfico de densidade. Compare o número de sinais de fluorescência com o número de células controle mortas, onde a maior porcentagem de captação da sonda nucleica celular não produz coloração inespecífica. Para testar a sobreposição de interferência de fluorescência proveniente da coloração intrínseca ou inespecífica das células, selecione os dados do cultivo misto com 50 por cento de células vivas e 50 por cento de células mortas.
E remova os marcadores fluorescentes. Aplique marcadores para incluir apenas o histograma de dispersão para frente referente ao tamanho celular do organismo-alvo no histograma do canal de ficocianina. Delimite os picos mais alto e mais baixo de ficocianina e rotule-os como “vivo” e “morto”, respectivamente.
Em seguida, aplique separadamente os gates aos sinais de ficocianina de células vivas e mortas. E registre os comprimentos de onda médios de ambos. Para determinar a sensibilidade do protocolo, calcule a razão entre os comprimentos de onda médios da fluorescência positiva do marcador molecular para células mortas e o sinal intrínseco não específico de células vivas.
Por fim, selecione o protocolo otimizado no qual a maior quantidade de células mortas foi corada, sem a ocorrência de coloração inespecífica. Nestes gráficos, são mostradas as saídas representativas de dispersão da luz para frente e lateral, para o tamanho celular e complexidade interna de um cultivo em lote de M.aeruginosa na fase exponencial. O gateamento pode ser realizado refinando os dados entre certos pontos da saída de dispersão da luz para frente.
A ficocianina produz um sinal forte quando excitada por uma fonte de luz vermelha, o que pode ser usado para realizar uma seleção adicional das populações de interesse. A partir do espalhamento da luz para frente e dos sinais fluorescentes, os dados podem então ser selecionados a partir da saída original, obtendo-se informações específicas sobre a amostra de M.aeruginosa para contagens celulares finais. Quando controles vivos com maior pigmentação e mortos com menor pigmentação são misturados, a diminuição no deslocamento da autofluorescência torna-se evidente.
Em células com membrana comprometida, as sondas de ácidos nucleicos produzem um sinal adicional que pode ser observado por citometria de fluxo e posteriormente confirmado por microscopia de epifluorescência. A discriminação de fluorescência entre células vivas e mortas aumenta com o tempo nas concentrações entre 0,05 e 0,5 micromolar, mas diminui nas concentrações entre um e 100 micromolares para ambas as sondas. De fato, a concentração ideal para a sonda verde de ácidos nucleicos parece ser de 0,5 micromolar, com um tempo de incubação de 30 minutos.
Para a sonda de ácido nucleico laranja, a concentração ideal é de um micromolar para uma incubação de 10 minutos. Uma vez dominado, para cada sonda molecular, a otimização pode ser concluída em um dia, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as sondas em um ambiente estável, sob as condições adequadas de temperatura, pH e luz.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de microbiologia explorarem a heterogeneidade comunitária em fitoplâncton. Após assistir ao vídeo, você agora deve ter uma boa compreensão de como desenvolver um protocolo ideal para avaliar a fisiologia celular utilizando citometria de fluxo e sondas moleculares. Não se esqueça de que trabalhar com sondas moleculares e organismos tóxicos pode ser extremamente perigoso, e que precauções, como o uso de EPI apropriado e o completo entendimento dos materiais COSHH, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para analisar os estados fisiológicos de cianobactérias utilizando citometria de fluxo e sondas moleculares. O método tem como objetivo determinar com precisão a mortalidade celular em populações microbianas, abordando os desafios relacionados à heterogeneidade celular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Biologia Celular
- Citometria de Fluxo
Contexto
- As populações microbianas exibem heterogeneidade celular significativa.
- A citometria de fluxo pode avaliar estados fisiológicos, mas varia conforme a espécie.
- A medição precisa da mortalidade celular é crucial para compreender comunidades microbianas.
- As sondas fluorescentes otimizadas podem aprimorar a análise no nível de célula individual.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para avaliar a fisiologia de cianobactérias.
- Aprimorar a precisão na determinação da mortalidade celular.
- Facilitar a análise em tempo real dos estados fisiológicos em cianobactérias.
Métodos Utilizados
- Citometria de fluxo para análise celular.
- Probes moleculares para distinguir estados fisiológicos.
- Otimização de protocolo para resultados precisos.
- Demonstração por um estudante de doutorado em um laboratório de citometria.
Resultados Principais
- O protocolo diferencia efetivamente estados fisiológicos em cianobactérias.
- Foi alcançada a determinação precisa da mortalidade celular.
- A análise em tempo real forneceu informações sobre o comportamento microbiano.
- Os resultados apoiam a compreensão das populações de cianobactérias.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido aprimora a análise da fisiologia de cianobactérias.
- Ele aborda limitações anteriores na medição da mortalidade celular.
- Este método pode ser aplicado a diversos estudos microbianos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação precisa da viabilidade celular em sistemas microbianos apoia a validação precoce de alvos ao permitir triagem fenotípica confiável e desvio de riscos mecanicistas. A citometria de fluxo com sondas moleculares otimizadas fornece dados quantitativos com resolução em nível de célula única, melhorando a confiança preditiva em campanhas de identificação de compostos líderes. Esta abordagem supera os desafios relacionados à heterogeneidade na biologia de descoberta, facilitando decisões baseadas em dados de avançar ou interromper projetos e reduzindo riscos biológicos em estágios avançados nas etapas de desenvolvimento de antimicrobianos ou agentes anti-infecciosos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao distinguir células viáveis de não viáveis em populações microbianas.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da avaliação da integridade da membrana utilizando as sondas SYTOX Green e SYTOX Orange.
- Valor Preditivo: Concentrações otimizadas da sonda (0,5 µM verde, 1,0 µM laranja) minimizam resultados falsos negativos e coloração inespecífica, aumentando a confiabilidade do ensaio.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera leituras padronizadas e reprodutíveis de fluorescência para triagem em alta produtividade de compostos na descoberta de agentes antimicrobianos.
- Saída Quantitativa: Permite a medição precisa da captação do marcador como variável dependente para modelagem de resposta à dose.
- Escalabilidade: A otimização do protocolo em Microcystis aeruginosa fornece uma estrutura transferível para outros sistemas cianobacterianos ou microbianos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Apoia a modelagem pré-clínica da eficácia antimicrobiana mediante a quantificação da mortalidade induzida por compostos em patógenos-alvo.
- Continuidade Tradutiva: Conecta a triagem de viabilidade na fase de descoberta à validação pré-clínica por meio de pontos finais consistentes baseados em citometria de fluxo.
- Avanço Ajustado ao Risco: Reduz a ambiguidade mecanicista na otimização de compostos líderes ao fornecer dados fisiológicos em tempo real em nível de célula única.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao contínuo de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, fornecendo insights mecanicistas que orientam as decisões sobre o avanço de compostos.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao correlacionar o tratamento com compostos às alterações na viabilidade celular.
- Triagem: Garante padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio da otimização dos parâmetros de incubação e concentração da sonda.
- Análises: Gera medições quantitativas de fluorescência que permitem comparação estatística entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores ao vincular leituras da integridade da membrana ao mecanismo de ação do composto.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de citometria reutilizável, aplicável a diferentes alvos microbianos em programas anti-infecciosos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir leituras falsas de viabilidade por meio da otimização de sondas.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização entre laboratórios por meio de concentrações definidas de sondas e tempos de incubação.
- Valor Estratégico: Aperfeiçoa a eficiência de capital ao permitir a eliminação precoce de compostos que não apresentam atividade específica para o alvo.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco ao identificar compostos com efeitos antimicrobianos genuínos em vez de artefatos do ensaio.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na operação de citometria de fluxo e compensação de fluorescência para detecção multiparamétrica.
- Depende do acesso a citômetros de fluxo compatíveis com laser de 488 nm e canais de detecção apropriados para corantes SYTOX.
- Necessita padronização do protocolo entre equipes para garantir manuseio, armazenamento e aplicação consistentes da sonda.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir o método para modelos bacterianos Gram-positivos ou Gram-negativos.
- Inclui limitações práticas, como a toxicidade da sonda e a necessidade de contenção de biossegurança ao trabalhar com organismos tóxicos como Microcystis aeruginosa.
