Molecular Probe Optimization para determinar mortalidade celular em um fotossintético organismo ( Microcystis aeruginosa) Utilizando citometria de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como criar um protocolo que possa analisar o estado fisiológico das cianobactérias de forma eficaz, usando citometria de fluxo e sondas moleculares. Este protocolo pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a fisiologia celular das comunidades microbianas. A principal vantagem desse procedimento é que um protocolo de sonda fluorescente otimizado pode distinguir entre os estados fisiológicos das cianobactérias no nível da célula individual em tempo real.

Demonstrando este procedimento estará David Hartnell, um estudante de doutorado que trabalha no laboratório de citometria da Universidade de Bournemouth. Antes de iniciar o experimento, coloque um tubo de hemólise vazio na sonda de injeção de amostra. Clique em desentupir.

E, em seguida, lave novamente para iniciar o processo de limpeza por citometria de fluxo. No final da retrolavagem, carregue um novo tubo de hemólise contendo dois mililitros de água filtrada ultrapura na sonda de injeção de amostra, ou SIP, e defina o limite de tempo para 10 a 15 minutos e a velocidade fluídica para rápida. Em seguida, selecione uma nova célula de dados e defina os limites de fluorescência e dispersão de luz relevantes para reduzir o ruído de fundo.

Em seguida, clique em executar. Se o total de eventos por segundo não for menor que a recomendação do fabricante, execute dois mililitros de solução de descontaminação por dois minutos em jejum. E repita as etapas de retrolavagem e lavagem de água ultra pura.

Para preparar uma monocultura primária de M.aeruginosa, autoclave 98 mililitros de água filtrada ultra pura, misturada com dois mililitros de meio algas, em um copo de 250 mililitros por 20 minutos a 120 graus Celsius. Quando uma cultura está em alta densidade de estado estacionário, desagregue dois mililitros de células por vórtice. Em seguida, transfira as células sob a sonda de injeção de amostra.

Confirme se as células estão uniformemente dispersas por microscopia de luz. Em seguida, selecione um gráfico de histograma no software do citômetro de fluxo para registrar os dados de dispersão de luz direta. E clique em log para visualizar os dados em uma escala de log no eixo x.

Em uma saída separada, defina outro histograma do eixo logarítmico para registrar a fluorescência natural das células M.aeruginosa. Em seguida, selecione uma fonte de luz que possa excitar a ficocianina e um detector que possa filtrar as emissões da fluorescência resultante. Para gravar na resolução mais alta, selecione as configurações mais próximas do tamanho do núcleo do organismo alvo.

E defina uma taxa de fluxo relativamente lenta. Antes de adquirir os dados, defina um limite para bloquear qualquer dispersão de luz e sinais de fluorescência causados por ruído de fundo eletrônico ou detritos de amostra de célula. Em seguida, selecione uma nova célula de dados.

Crie um gráfico de densidade com parâmetros de dispersão direta e lateral em uma escala logarítmica e clique em executar. Agora aplique a dispersão de luz direta e a porta de fluorescência natural aos dados de dispersão direta a lado para excluir quaisquer sinais de dispersão de baixo nível e incluir apenas os sinais de ficocianina de fluorescência relativa mais alta. Em seguida, colete eventos até que a amostra seja concluída e use os dados para determinar a contagem inicial de células.

Para otimizar a absorção da célula da sonda molecular, exponha metade da monocultura previamente preparada às condições apropriadas para gerar um controle morto. Verifique as variações no microambiente da amostra para confirmar a morte da cultura. E então desagregar a formação da colônia como acabamos de demonstrar.

Em seguida, selecione um laser de 488 nanômetros ao lado de um detector que pode registrar a fluorescência das sondas de ácido nucleico verde e laranja. E o laser de 640 nanômetros para registrar os sinais de ficocianina através de seus respectivos detectores. Em uma nova planilha de dados, configure um gráfico de densidade com parâmetros de dispersão direta e lateral.

Em seguida, crie um histograma usando o respectivo canal do detector óptico da sonda molecular. Um histograma para detectar as emissões de ficocianina e um histograma para eventos de dispersão direta, todos em escala logarítmica. Execute as amostras de cianobactérias usando diferentes concentrações e tempos de incubação.

Crie uma porta no histograma de dispersão direta para incluir eventos apenas com o tamanho da célula do organismo alvo. E aplique-o ao canal de sonda de fluorescência correspondente. Em seguida, no canal da sonda de fluorescência, crie outra porta de software inclusiva contra o pico mais alto no histograma.

E, posteriormente, porte a fluorescência da sonda positiva correspondente no gráfico de densidade. Compare o número de sinais de fluorescência com o número de células de controle mortas, onde a maior porcentagem de captação da sonda nucleica celular que não produz coloração inespecífica. Para testar a sobreposição de interferência de fluorescência da coloração celular intrínseca ou não específica, selecione os dados de cultura mista de 50% vivos e 50% mortos.

E remova as portas fluorescentes. Aplique portas para incluir apenas o histograma de dispersão direta para o tamanho da célula do organismo alvo no histograma do canal de ficocianina. Bloqueando os picos mais altos e mais baixos da ficocianina e rotulando-os vivos e mortos, respectivamente.

Em seguida, aplique separadamente as portas aos sinais de ficocianina viva e morta. E registre os dois comprimentos de onda médios. Para determinar a sensibilidade do protocolo, coraje os comprimentos de onda médios da fluorescência da sonda molecular morta positiva e o sinal ativo intrínseco não específico.

Por fim, selecione o protocolo otimizado em que a maior quantidade de células mortas foi corada sem a ocorrência de coloração inespecífica. Nestes gráficos, são mostradas as saídas representativas de dispersão de luz direta e lateral, para tamanho celular e complexidade interna de uma cultura em batelada de M.aeruginosa na fase exponencial. O gating pode ser realizado refinando os dados entre certos pontos da saída de dispersão de luz direta.

A ficocianina produz um sinal forte quando interrogada por uma fonte de luz vermelha, que pode ser usada para bloquear ainda mais as populações de interesse. A partir da dispersão de luz direta e dos sinais fluorescentes, os dados podem ser bloqueados da saída original para dados específicos na amostra de M.aeruginosa para contagens finais de células. Quando os controles vivos de pigmentação mais alta e os controles de pigmentação inferior mortos são misturados, a mudança decrescente na fluorescência automática torna-se clara.

Em células comprometidas por membrana, as sondas de ácido nucleico produzem um sinal adicional que pode ser observado por citometria de fluxo e posteriormente confirmado por microscopia de epifluorescência. A discriminação de fluorescência entre células vivas e mortas aumenta com o tempo entre as concentrações de 0,05 e 0,5 micromolares, mas diminui entre as concentrações de um e 100 micromolares para ambas as sondas. De fato, a concentração ideal para a sonda de ácido nucleico verde parece ser de 0,5 micromolar com um tempo de incubação de 30 minutos.

Para a sonda de ácido nucleico laranja, a concentração ideal é de um micromolar para uma incubação de 10 minutos. Uma vez dominada, para cada sonda molecular, a otimização pode ser concluída em um dia, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as sondas em um ambiente estável, sob temperatura, pH e condições de luz adequadas.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da microbiologia explorarem a heterogeneidade da comunidade no fitoplâncton. Depois de assistir ao vídeo, agora você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver um protocolo ideal para avaliar a fisiologia celular usando citometria de fluxo e sondas moleculares. Não se esqueça de que trabalhar com sondas moleculares e organismos tóxicos pode ser extremamente perigoso e que precauções como usar o PPE apropriado e ter o conhecimento completo dos materiais COSHH devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.