Coleção, isolamento e Citometria de Fluxo de Análise de Amostras endocervix Humano

O objetivo geral deste procedimento é isolar células mononucleares cervicais de uma raspagem endocervical usando uma escova citogênica. Uma vez isoladas, essas células podem ser usadas em vários ensaios, incluindo citometria de fluxo, onde você pode determinar o fenótipo e a função das células imunes no trato genital feminino. A coleta de amostras de escova citogênica e lavagem cervical é um procedimento não invasivo que deve ser realizado por um ginecologista ou médico treinado.

A lavagem vaginal cervical é realizada primeiro onde a endocérvice é lavada com dois moinhos de PBS, que é então coletado do fórnice posterior após a lavagem. A extremidade côncava de um raspador cervical é colocada contra o colo do útero e girada para amostrar a abertura cervical ou os orifícios cervicais. Em seguida, a escova cyto é inserida no sistema operacional endocervical e girada 360 graus.

O uso de pressão suave ajudará a garantir que não haja contaminação do sangue da amostra. A escova de cito no raspador é coletada em um tubo contendo cinco mils de PBS. Depois de ser transportada no gelo, a amostra é rapidamente um vórtice para dissociar as células da escova citogênica.

Depois de lavar as amostras com mídia, elas são filtradas por um filtro de náilon de cem mícrons. Isso permite a coleta de linfócitos, monócitos e células epiteliais da amostra. As células agora estão prontas para serem coradas com anticorpos contra proteínas de superfície e, uma vez fixadas, podem ser executadas no citômetro de fluxo.

Mostraremos como analisamos os dados resultantes para avaliar o fenótipo das populações de células T CD quatro e CD oito presentes no colo do útero. Olá, sou estudante de doutorado no laboratório do Dr.Keith. Nossa pesquisa se concentra na ligação entre a ativação imunológica e a suscetibilidade ao HIV, bem como a progressão da doença.

Como a maioria das infecções por HIV agora ocorre por meio de relações heterossexuais, também estamos interessados em determinar os correlatos da proteção à transmissão do HIV para o trato genital feminino. Infelizmente, a coleta de amostras do trato genital pode ser muito desafiadora e bastante invasiva para os participantes do estudo. O uso de escovas citogênicas para coletar CMCs ou células mononucleares cervicais é um método mais rápido e fácil em comparação com outros protocolos, como biópsias.

Neste vídeo, mostraremos como isolar e preparar CMCs para uso em citometria de fluxo ou outras aplicações downstream. Após a coleta, a escova de cito e o raspador são transportados em cinco mils de PBS frio. É importante transportar as amostras em gelo até o momento do processamento, que não deve ser superior a duas horas após a coleta da amostra.

Quaisquer amostras contaminadas com vestígios de sangue neste momento devem ser excluídas de análises adicionais para dissociar as células da escova de cito. Vortex o tubo em alta por 45 segundos porque as células ainda permanecerão na escova de cito e no raspador. Eles devem ser removidos manualmente.

Coloque um par de luvas novas e use a escova cyto para raspar qualquer material restante do raspador. Depois de descartar em uma solução de alvejante, use o polegar e o indicador para remover todas as células restantes da escova citogênica, apertando para cima e para baixo sobre o tubo de falcão. Depois de descartar a escova citogênica, troque as luvas antes de preparar outra amostra, use uma pipeta de transferência para lavar as laterais do tubo com PBS, garantindo que toda a amostra seja coletada.

Ajuste um nylon de cem mícrons. Filtre sobre um tubo Falcon novo e use a pipeta para filtrar todo o volume da solução de PBS. Adicione cinco mils de mídia RPMI sem FBS ao tubo original.

Use a pipeta para lavar bem as laterais do tubo para remover qualquer muco ou detritos aderentes. Em seguida, transfira a mídia através do filtro. Use um pouco do meio filtrado para lavar o fundo do filtro antes de descartá-lo em alvejante.

Para pellet as células isoladas. Centrifugue as amostras por 10 minutos a 1500 rpm para evitar que o pellet se desloque. Lembre-se de desligar o freio da centrífuga se as células forem usadas para citometria de fluxo.

Preparar a solução de bloqueio necessária para evitar a ligação de anticorpos não específicos. Durante a etapa de centrifugação, use 100 microlitros de solução de bloqueio por amostra. A solução de bloqueio contém 93,2 microlitros de fax, lavagem ou PBS mais 2% de FBS, cinco microlitros de FBS e 1,8 microlitros de IgG de camundongo.

Após a rotação, a maioria das amostras com células viáveis terá um pellet visível. Em alguns casos, o pellet será bastante grande. Enquanto em outras amostras pode ser pouco visível.

O tamanho do pellet nem sempre está relacionado ao rendimento da célula. Com cuidado para inclinar o sobrenadante, garantindo que você não perturbe as células, ressuspenda o pellet por agitação suave. Lave as células com cinco mils de PBS e repita a centrifugação por 10 minutos a 1500.

RRP M com a interrupção, mais uma vez, decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet como antes. Neste ponto, as células estão prontas para serem criopreservadas ou coradas na superfície antes da coloração Com anticorpos fluorescentes, é benéfico bloquear a ligação não específica incubando as células com uma solução de bloqueio preparada durante uma centrifugação anterior. Depois que o pellet celular for ressuspenso, adicione cem microlitros de solução de bloqueio à amostra e misture bem.

As etapas restantes do protocolo podem ser executadas em uma placa de 96 poços ou em um tubo de fax. Dependendo do tamanho do pellet CMC. Transfira a solução de bloqueio e a mistura de células para um tubo de fax.

Incubar a amostra durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Durante a incubação de 10 minutos, prepare o corante de viabilidade que será usado para discriminar células vivas e mortas. Durante a análise dos dados, prepare o corante de viabilidade de acordo com o fabricante e pré-titule conforme necessário.

Certifique-se de manter a mistura de corante coberta da luz até que esteja pronta para ser usada. Após a incubação de 10 minutos, lave as células com 500 microlitros de fax, lave ou PBS com 2% FBS e, em seguida, centrifugue por 10 minutos a 1600 RPM. Depois de girar, transvase o sobrenadante do tubo de fax.

Ressuspenda as células por agitação. Agora adicione o volume apropriado do corante de viabilidade que foi preparado anteriormente. Incube as células por 30 minutos a quatro graus Celsius para garantir que as amostras permaneçam cobertas da luz, embrulhando-as em papel alumínio.

Durante esta incubação, você pode preparar a mistura principal de anticorpos fluorescentes que serão usados para rotular as células. Certifique-se de pré-titular e validar seus anticorpos em amostras de controle de sangue periférico antes de usá-los em CMCs. Misture os anticorpos titulados e leve a um volume final de cem microlitros por amostra.

Com fax, lave, proteja todos os anticorpos da luz durante essas etapas. Após a incubação de 30 minutos, mais uma vez, lave a amostra com 500 microlitros de fax, lave, centrifugue, decanta e ressuspenda as células como antes. Agora é hora de incubar as células com 100 microlitros do coquetel de anticorpos preparado durante a incubação anterior.

Mais uma vez, incube as amostras por 30 minutos a quatro graus Celsius, garantindo que estejam protegidas da luz. Os CMCs incubadores estão agora prontos para serem lavados com 500 microlitros de PBS pela última vez. Centrifugue a amostra a 1600 RPM por 10 minutos.

Após decantação e ressuspensão do pellet, diluir as células em um volume final de 750 microlitros em solução de 1% de paraldeído. Para corrigi-los, é importante ressuspender as células nesse grande volume para evitar o entupimento do citômetro de fluxo. Mesmo com esse volume, o tubo de amostra pode parecer bastante turvo.

Mantenha as células no escuro a quatro graus Celsius até que sejam adquiridas no citômetro de fluxo. Além da amostra de escova de cito, coletamos rotineiramente dois mils de lavagem PBS do colo do útero e da vagina. Esta amostra é centrifugada a 1400 RPM por sete minutos para remover os detritos celulares da lavagem.

O sobrenadante restante pode então ser colocado e congelado a 80 graus Celsius negativos para a análise futura da concentração de proteínas solúveis. Esses dados podem ser particularmente úteis em combinação com dados de fenótipo celular obtidos por citometria de fluxo. Antes de executar sua amostra CMC.

É útil preparar os controles PBMC para auxiliar na passagem dos tubos de compensação de corrida, usando grânulos ou células de coloração simples para ajustar a sobreposição espectral. Adquira todo o tubo CMC para coletar todos os eventos em comparação com as amostras PBMC. Os CMCs exibirão mais duplicatas em um gráfico de área FSC versus altura e podem não exibir uma população de linfócitos tão distinta quanto o pbmc.

Depois de adquirir suas amostras, exporte os arquivos para análise em um programa como o FlowJo. Aqui, mostraremos os principais componentes de uma estratégia típica de gating para células T CD quatro positivas e oito positivas derivadas de CMC. Use um gráfico de área versus altura do FSC para G nos singlets em sua amostra.

Nesta comparação combinada, você pode ver claramente o aumento do número de duplicatas em uma amostra CMC em comparação com p BMCs. Em seguida, traçar um marcador fluorescente ou FSC versus tempo serve como uma etapa de controle de qualidade. Se alguma alteração na taxa de fluxo introduziu artefatos nos dados, eles podem ser removidos nesta etapa.

Na parte superior, você pode ver um perfil consistente de fluorescência ao longo do tempo, indicativo de uma amostra de alta qualidade. Abaixo você pode ver uma amostra com múltiplas interrupções e vazão, que podem ser excluídas de análises posteriores. A identificação da população de linfócitos em amostras de CMC pode ser um desafio.

O uso do controle APMC ajudará na colocação da marcha. Como você pode ver, algumas amostras exibem grandes populações claras, enquanto outras amostras não possuem populações de linfócitos. No total, estas amostras devem ser excluídas.

Embora nos concentremos nas populações de linfócitos. Também é possível gating em monócitos por gating em células que não possuem a expressão de marcadores de linhagem. É possível identificar células que expressam combinações de marcadores de células dendríticas e monócitos, como CD 16 e CD 11 C. A inclusão de um marcador de viabilidade ou corante é crucial para a análise de CMC, mesmo em células frescas.

Como você pode ver, a maioria dos linfócitos CMC é viável, mas algumas amostras contêm altas frequências de células mortas que devem ser excluídas da análise. As células mortas podem absorver anticorpos de forma não específica e confundir a análise de dados na marcha dos linfócitos. A coloração CD três deve ser robusta.

A proporção de três células T positivas para CD é menor e mais variável do que nas amostras de PBMC, por isso é crucial adquirir toda a amostra de CMC e maximizar o número de eventos coletados. As populações de células T CD quatro positivas e CD oito positivas podem ser identificadas assim como nas amostras de TBMC. Em algumas amostras de CMC.

A proporção de CD quatro para CD oito é menor do que a observada no sangue periférico e alguns indivíduos exibem uma grande população de células T duplamente negativas. Após a identificação das populações de células T CD quatro positivas e CD oito positivas, é possível quantificar a expressão de vários marcadores fenotípicos. Embora a expressão de CD 1 61 possa ser detectada em CMCs, a população brilhante de CD 1 61 que é evidente no sangue está ausente no trato genital.

Da mesma forma, a expressão de marcadores de ativação como CD 69 e H-L-A-D-R, bem como marcadores como CCR cinco e PD um podem ser medidos de forma confiável entre amostras de CMC e quantificados. O uso de amostras de pincel de cito nos permite caracterizar tanto o fenótipo quanto a função das células imunes da mucosa, especialmente no contexto de doenças infecciosas. Isso não apenas nos dá uma visão mais ampla dos mecanismos que regulam a imunologia mucosa e reprodutiva, mas também fornece a base para o desenvolvimento de novas medidas de eficácia da vacina da mucosa.