Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

A principal vantagem dessa técnica é que ela é muito simples, requer apenas equipamentos padrão e se beneficia da principal vantagem dos anticorpos, que é sua especificidade. O protocolo foi originalmente introduzido por Michela Matteoli e colegas e provou ser altamente eficaz. Eu o usei para testar se uma determinada proteína cordocti está localizada em sinapses ativas.

Comece este procedimento cultivando células primárias do hipocampo em lamínulas em uma placa de 24 poços por três dias, conforme descrito no protocolo de texto. Pré-aqueça o meio de soro reduzido, o meio de cultura de células e a água destilada a 37 graus Celsius no banho-maria. Trabalhando sob a capela de fluxo laminar para garantir condições de trabalho estéreis, prepare a mistura de transfecção em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Primeiro, misture 7,5 microlitros de cloreto de cálcio de dois molares com quatro microgramas de cada DNA livre de endotoxinas. Adicione água para atingir um volume total de 60 microlitros em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Agora, adicione 60 microlitros de tampão de transfecção à mistura.

Para obter os melhores resultados, adicione o tampão de transfecção gota a gota enquanto agita a mistura de DNA suavemente no vórtice. Incube a mistura de transfecção resultante em temperatura ambiente por 20 minutos. Evite agitar o tubo durante o tempo de incubação.

Sob a capela de fluxo laminar, remova o meio de cultura de células dos poços usando uma pipeta de 1.000 microlitros, armazene-o em um recipiente separado e adicione imediatamente 500 microlitros de meio de soro reduzido a cada poço. Armazene o meio condicionado na incubadora. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 até que o período de incubação de 20 minutos para a mistura de transfecção termine.

Em seguida, adicione 30 microlitros de mistura de transfecção a cada poço pipetando várias gotas. Descarte o resíduo no fundo do tubo. Depois que todos os poços tiverem sido abastecidos com a mistura de transfecção, agite suavemente a placa de 24 poços para garantir a distribuição da mistura de transfecção no meio.

Agora incube os poços por 60 minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Após a incubação, remova e descarte a mistura de transfecção e lave as células três vezes com meio de cultura de células. A etapa de lavagem é crítica.

Minimize o tempo que cada poço não tem meio, removendo e substituindo poço por poço. Além disso, certifique-se de adicionar o meio suavemente. Para lavar as células, adicione um mililitro de meio de cultura de células a cada poço e incube-as por 30 segundos em temperatura ambiente.

Em seguida, remova 750 microlitros de meio e adicione a mesma quantidade de meio fresco. Depois de repetir esse processo três vezes, remova e descarte o meio de cultura de células e adicione 450 microlitros do meio condicionado poço a poço. Agora deixe os neurônios amadurecerem na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 para DIV 10.

Pré-aqueça 600 microlitros de tampão de despolarização 1X e 10 mililitros de meio de cultura de células a 37 graus Celsius no banho-maria. Adicione um microlitro de anticorpo anti-Syt1 de camundongo ao tampão de despolarização 1X e vórtice por 10 segundos. Depois de remover e descartar o meio de cultura de células das células, adicione 200 microlitros da mistura de anticorpos de despolarização a cada poço.

Incube a placa por cinco minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2 na incubadora. Remova e descarte a mistura de anticorpos de despolarização e lave as células três vezes com meio de cultura de células. Adicione um mililitro de meio de cultura de células a cada poço e incube por 30 segundos em temperatura ambiente.

Em seguida, remova 750 microlitros de meio e adicione a mesma quantidade de meio fresco. Repita esse processo três vezes. Em seguida, remova e descarte o meio de cultura de células e adicione 300 microlitros de 4% de PFA em 1X PBS.

Finalmente, incube por 20 minutos a quatro graus Celsius antes de lavar três vezes por cinco minutos cada com 1X PBS. Diluir o anticorpo secundário acoplado a fluoróforo em 200 microlitros de tampão de bloqueio para cada poço a uma diluição de um a 1.000. Remova e descarte o PBS 1X de cada poço contendo lamínulas com os neurônios cultivados.

Adicione 200 microlitros de mistura de anticorpos tampão de bloqueio a cada poço e incube por 60 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, lave as células três vezes por cinco minutos com um mililitro de PBS 1X. Em seguida, adicione uma gota de sete microlitros de meio de incorporação na lâmina do microscópio.

Remova a lamínula da placa de 24 poços levantando-a com uma cânula e agarrando-a com uma pinça. Mergulhe a lamínula em água destilada para remover o PBS e seque-a cuidadosamente tocando uma borda em um tecido mole. Vire a lamínula na gota do meio de incorporação de modo que a superfície que transporta as células fique voltada para a lâmina do microscópio, incorporando assim as células no meio de incorporação.

Deixe as lâminas secarem sob o capô por uma a duas horas, cobrindo-as para evitar a exposição à luz. Armazene as lâminas secas em uma caixa de lâminas de microscópio a quatro graus Celsius. Após a imunomarcação do anticorpo Syt1 com um anticorpo secundário marcado com fluorescência, a extensão da captação de Syt1 é finalmente quantificada usando o imunossinal.

A imunofluorescência puntiforme indica locais de captação de Syt1 no campo de visão. Esses locais, portanto, contêm vesículas sinápticas que se reciclaram durante o experimento. A fluorescência sinaptofisina-mOrange indica acúmulos de vesículas sinápticas no axônio de um neurônio transfectado.

A fluorescência GFP-Rogdi indica acúmulos de Rogdi no axônio do neurônio transfectado. Esta parte do experimento revela extensa colocalização de GFP-Rogdi e Synaptophysin-mOrange, sugerindo que GFP-Rogdi se acumula em locais pré-sinápticos dentro do axônio. A sobreposição revela quais das coacumulações de GFP-Rogdi e Synaptophysin-mOrange colocalizam com locais de captação de anticorpos Syt1.

Os locais marcados por setas representam acúmulos de Rogdi recombinante e sinaptofisina recombinante nas sinapses funcionais. O protocolo descreve uma maneira tecnicamente direta de determinar a extensão da reciclagem de resíduos sinápticos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na ciência molecular e celular, como onde os terminais nervosos pré-sinápticos alocados em um axônio de um determinado neurônio e se uma proteína recombinante ou endógena de interesse se acumula nesses terminais.

Após seu desenvolvimento, essa técnica tem sido usada de várias maneiras para monitorar a reciclagem de vesículas sinápticas em terminais pré-sinápticos. Por exemplo, pode ser usado para determinar a reciclagem de vesículas sinápticas em neurônios após superexpressão em proteínas adaptativas, bem como em neurônios obtidos de animais ou de neurônios derivados de células-tronco.