Name: Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprenda um ensaio óptico simples para analisar a reciclagem de vesículas sinápticas em neurônios cultivados usando transfecção e marcadores pré-sinápticos. Este método permite avaliar a dinâmica sináptica e a localização de proteínas em terminais nervosos ativos.

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Agradecemos Irmgard Weiss-assistência técnica especializada. Este trabalho foi apoiado pelo DFG através do Cluster de excelência para microscopia na escala do nanômetro e fisiologia molecular do cérebro (CNMPB, B1-7, a T.D.).

Foi realizado nenhum estudo com animais vivos. Experimentos envolvendo animais sacrificados para obter culturas foram aprovadas pelas autoridades locais de proteção animal (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sob a aprovação de célula número T10/30. Os experimentos foram realizados com os protocolos aprovados.
1. primário de células Hippocampal cultura
<ol><li>Prepare a cultura de células dissociadas do hipocampo rato em embrionárias dia 1916,17. As células em lamelas de 12 mm, revestidas com polyethyleneimine (PEI) em 24-bem pratos em uma densidade de 50.000-60.000 células/poço da placa. Verifique a densidade utilizando uma célula ótica de contraste de fase e câmara de contagem.</li>
	<li>Cultura os neurônios para 3 dias (dia em vitro (DIV) 3) em uma placa de 24 na incubadora a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>Avalie as lamelas para indicadores de saúde de células usando microscopia de luz transmitida (por exemplo, fase contraste ótica em uma ampliação de 10-20 X). Verifique os seguintes indicadores de saúde: um halo de contraste de fase clara, neuritos sem estruturas frisados e não soma clustering ou agrupamento do axônio.</li>
</ol>2. transfection
Nota: O seguinte protocolo refere-se a um dupla de Transfeccao para 3 poços. No entanto, o protocolo funciona melhor quando quantidades suficientes para 4 poços estão preparadas.
<ol><li>Prepare 500 mL de tampão de transfeccao (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM Na2HPO4, glicose de 15mm, 42 mM HEPES) em um Erlenmeyer.<ol>
<li>Dissolva 5,0 g de HEPES em 400 mL de água destilada em um Erlenmeyer, 0,37 g de KCl, 0,095 g de Na2HPO4, 1,35 g de glicose e 8,0 g de NaCl.</li>
		<li>Ajuste o pH a 6,95 com 1 M NaOH, usando um medidor de pH.</li>
		<li>Ajustar o volume com água destilada para 500 mL e verificar o pH usando um medidor de pH.</li>
		<li>Fazer alíquotas de 20-30 mL de tampão de transfecção com os seguintes valores de pH por pipetagem 1 M NaOH para o buffer de transfeccao: 6,96, 6.97, 6,98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7,07, 7.08, 7.09, 7.11. Nota: O pH do buffer do transfection é crucial para a eficácia do transfection.</li>
		<li>Para testar o que leva de tampão de Transfeccao para o maior número de células transfectadas, teste cada valor de pH de 6,96 a 7.11. Use o método de transfeccao descrito em 2.2-2.11 e um plasmídeo validado expressando GFP. Determine o número de células transfectadas por lamela para cada valor de pH do tampão de transfeccao avaliar qual tampão funciona melhor.</li>
		<li>Alíquota a reserva com a mais alta eficiência de Transfeccao para tubos de 2 mL microcentrifuga congelar e armazenar os tubos a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pré-aquecer o soro reduzida meio, meio de cultura celular e água destilada a 37 ° C em banho-maria.</li>
	<li>Prepare a mistura de transfeccao em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Trabalhar sob a capa de fluxo laminar para garantir condições de trabalho estéril.<ol>
<li>Mix de 7,5 µ l de cloreto de cálcio 2 M com 4 µ g de cada DNA livre de endotoxinas (Sinaptofisina-mOrange e mGFP/GFP-Rogdi). Adicione água para atingir um volume total de 60 mL em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 60 mL de tampão de transfeccao à mistura. Para obter os melhores resultados, adicione o buffer de transfeccao gota a gota, agitando a mistura de DNA suavemente sobre o vórtice.</li>
		<li>Incube a temperatura ambiente (RT) por 20 minutos. Evite agitação do tubo de incubação durante o tempo de incubação, colocando o tubo ao lado a capa do fluxo laminar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sob o capô de fluxo laminar, remover o meio de cultura celular ("meio condicionado") dos poços utilizando uma pipeta de 1000 mL e armazená-lo em um recipiente separado na incubadora.</li>
	<li>Adicione 500 mL de soro reduzida meio a cada poço. Incube as celulas em 37 ° C e 5% de CO2 até que acabe o período de incubação de 20 minutos (etapa 2.3.3).</li>
	<li>Adicione 30 mL de mistura de Transfeccao para cada poço pipetando várias gotas. Descarte o resíduo no fundo do tubo.</li>
	<li>Depois de todos os poços foram fornecidos com a mistura de transfeccao, agite suavemente a placa de 24 para garantir a distribuição da mistura no meio do transfection.</li>
	<li>Incube os poços durante 60 minutos a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Remova e descarte a mistura de transfeccao e lavá-lo três vezes com meio de cultura celular. Adicione 1 mL de meio de cultura celular a cada poço e incube-os por 30 segundos a RT. remover 750 mL do meio e adicione a mesma quantidade de meio fresco. Repita isso três vezes. Nota: A etapa de lavagem é muito importante. Manter o tempo que cada poço não tem nenhum meio de no mínimo (i. e., remover e substituir por-bem) e adicionar lentamente o meio de lavagem.</li>
	<li>Remova e descarte o meio de cultura celular e adicionar 450 mL do condicionado médio por-bem.</li>
	<li>Deixe os neurônios maduros na incubadora a 37 ° C e 5% CO2 para 10 DIV.</li>
</ol>3. estimulação e captação de Syt1
Nota: O seguinte protocolo aplica-se a absorção de 3 poços. Por despolarização de qualquer outro número de poços, ajuste os montantes em conformidade.
<ol><li>Prepare-se 50 mL de tampão de despolarização 10 x (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20mm CaCl2, glicose de 300 mM, 200 mM HEPES, pH 7,4), em um Erlenmeyer. Nota: A reserva de despolarização pode ser mantida a 4 ° C durante várias semanas. Se uma solução não-despolarizantes também é usada, preparar um 10 solução do x Tyrode consistindo de 1290mm NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20mm CaCl2, 300 mM, glicose, pH HEPES 200mm 7.4 fim comparar estimulação induzida por reciclagem com espontânea reciclagem. Após a diluição a 1 x, adicione 1 µM de tetrodotoxina antes do uso para bloquear a geração do potencial de ação.<ol>
<li>Dissolva 1,87 g de NaCl, 2,61 g de KCl, 0,1 g de MgCl2-6 H20, 0,15 g de CaCl2-2 H2O e 3,0 g de glicose-1 H2O e 2,38 g de HEPES em 50 mL de água destilada em um Erlenmeyer. Ajuste o pH com NaOH e estéril-filtrar a solução. Dilua o tampão 01:10 em água destilada a obter uma concentração de 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o paraformaldeído 4% (PFA) em 1X PBS (pH 7,4) para fixação após a estimulação.<ol>
<li>Para 500 mL de 4% PFA em PBS 1x, dissolver 20 g de paraformaldeído em 450 mL de água destilada H2O. Nota: A solução de aquecimento pode acelerar a dissolução, mas não aqueça a solução acima de 70 ° C, como o PFA pode desintegrar-se. Cuidado: PFA é tóxico, potencialmente carcinogênicos e teratogênicos. Use luvas quando trabalhar com PFA, trabalhar sob a coifa e evitar a ingestão.</li>
		<li>Deixe a solução esfriar a RT e adicionar 50 mL de solução estoque de PBS x 10. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH/HCl usando um medidor de pH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pré-aqueça 600 mL de tampão de despolarização 1x e 10 mL de meio de cultura celular para 37 ° C em banho-maria.</li>
	<li>Adicione 1 mL de anticorpo anti-Syt1 de rato (clone 604.2) para o 1x buffer de despolarização e vortex durante 10 segundos.</li>
	<li>Remova e descarte o meio de cultura celular de células. Adicione 200 mL da mistura despolarização-anticorpo para cada bem e incubar por 5 minutos a 37 ° C e 5% CO2 na incubadora.</li>
	<li>Remova e descarte a mistura de despolarização-anticorpo e lavá-lo três vezes com meio de cultura celular. Adicione 1 mL de meio de cultura celular a cada poço e incube por 30 segundos a RT. remover 750 mL do meio e adicione a mesma quantidade de meio fresco. Repeti três vezes.</li>
	<li>Remova e descarte o meio de cultura celular e adicionar 300ml de 4% PFA em 1X PBS. Incubar durante 20 minutos a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar três vezes por 5 minutos, cada um com PBS 1x. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>4. imunocitoquímica
<ol><li>Prepare 50 mL de tampão de bloqueio. Nota: Bloqueio de buffer pode ser mantido a-20 ° C por vários meses.<ol>
<li>Dissolva 2,5 g de sacarose e 1 g de albumina de soro bovino (BSA) em 5 mL de solução estoque de PBS x 10. Adicione 1,5 mL da solução detergente 10%. Agite a solução até que todos os componentes corretamente se dissolveram e adicionar água destilada H2O até atingir um volume final de 50 mL. Alíquota da solução e congelar as alíquotas para armazenamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dilua o anticorpo secundário, fluoróforo acoplados (dirigido contra as espécies de Syt1-anticorpo primárias) em 200 mL de tampão de bloqueio em cada poço a uma diluição de 1: 1000.</li>
	<li>Remova e descarte a PBS 1x de cada bem que contém uma lamela.</li>
	<li>Adicionar 200 mL de mistura de tampão-anticorpo para cada poço de bloqueio e incubar durante 60 minutos a RT Cuidado: Porque os anticorpos secundários são sensíveis à luz, todos os passos em frente devem ser realizados no escuro.</li>
	<li>Após a incubação, lave as células três vezes por 5 minutos com 1 mL de 1X PBS.</li>
	<li>Incorpore as lamelas em corrediças do microscópio com o medium de incorporação.<ol>
<li>Adicione uma gota de 7 mL de incorporação médio da lâmina de microscópio. Remova a lamela a placa de 24 por levantá-lo com uma seringa e agarrando-o com a pinça. Cuidado: Células na superfície da lamela são facilmente danificadas, então fórceps deve ser manuseado com cuidado.</li>
		<li>Mergulhe a lamela água destilada para remover a PBS e seque-o cuidadosamente, tocando uma borda de um tecido mole.</li>
		<li>Inverter a lamela sobre a incorporação da gota média, para que a superfície carregando as células enfrenta a lâmina de microscópio, incorporando, assim, as células no meio de encastre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deixe os slides para secar sob o capô para 1-2 h (cobri-los para evitar a exposição à luz) e armazená-los em uma caixa de slide de microscópio a 4 ° C. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>5. microscópico análise
<ol><li>Depois de secam as lamelas, colocá-los sob o microscópio com o objectivo e a câmera.</li>
	<li>Ajuste o tempo de exposição para cada canal para que alguns pixels são superexpostas para garantir o máximo da distribuição dos valores de cinza. Nota: Enquanto o tempo de exposição pode variar entre os canais, deve ser constante para um canal para assegurar a comparabilidade entre as lamelas.</li>
	<li>Adquira imagens de multi-canal para 10 regiões de interesse (ROIs) por lamela. Verifique se o ROI contém processos axonal a partir de um neurônio transfectado, verificando a GFP-fluorescência, que deve ser punctate.</li>
</ol>6. análise estatística
<ol><li>Exporte as imagens como arquivos. tif. Carregar as imagens para OpenView18 clicando em arquivo | Arquivo de imagem de carga.</li>
	<li>Escolha a imagem Sinaptofisina-mOrange como canal 1, a imagem Rogdi-GFP/mGFP como o canal 2 e a imagem de fluorescência Alexa647 como canal 3.</li>
	<li>Limiar de ROIs.<ol>
<li>Clique em análise | Área de lugar sobre a partitura. Escolha os valores de limiar e intensidade de Delta para que após a inspeção visual, fluorescência difusa é excluída, deixando apenas punctate sinais na imagem do canal 1 (representando Sinaptofisina-mOrange fluorescência). Manter o mesmo limiar para todas as imagens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferi estes ROIs ao correspondente canal 2 (fluorescência de GFP-Rogdi/mGFP) e 3 (Syt1-fluorescência) de cada área de lamela, clicando em executar agora. Nota: O ROIs só deve ser considerado se a célula é duplo-transfectadas. Neste método, o mOrange e GFP-fluorescência deve ser claramente visível.</li>
	<li>Salve os dados no editor de registo de análise clicando em dados de Log.</li>
	<li>Abra o editor de registro de análise sob a guia do Windows e copiar os valores para cada canal. Cole os valores para os canais separados em uma planilha.</li>
	<li>Determine a intensidade média de fluorescência do Syt1-canal no ROIs em ambas as condições de transfeccao (GFP-Rogdi e mGFP).</li>
	<li>Aplica testes estatísticos adequados, tais como o teste t de Student para determinar diferenças significativas.</li>
</ol>

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Os autores não têm nada para divulgar.

Existem três ensaios rotineiramente usados para estudar a vesícula sináptica (SV) reciclagem. Os dois primeiros incluem o uso de um) fluorescente styryl corantes como FM1-43 (que incorporar em membranas, são retomadas em organelas durante a endocitose e são liberados após a exocitose); e b) marcados fluorescentemente proteínas recombinantes do SV (que, em cima de superexpressão, incorporam as máquinas de reciclagem proteicas). Se o anexadas fluorophores alterar sua fluorescência dependendo do pH, pode ser usados para mon...

Estudando a vesícula sináptica reciclagem é importante em determinar como alteram Propriedades pré-sináptica, durante a plasticidade sináptica, ou em resposta a perturbação da função sináptica. Estudando Synaptotagmin-1 (Syt1) captação de anticorpo fornece um método para medir a quantidade de reciclagem de SV. Syt1 é uma proteína de SV-associado que atua como um sensor de Ca2 + e é necessária para os liberação do neurotransmissor1,2. É uma proteína transmembranar com um domínio citoplasmático do C-terminal fora o SV e um domínio N-terminal do luminal dentro do SV3. Durante a exocitose, o domínio luminal de Syt1 torna-se exposto ao meio externo. Para este meio externo, acrescentamos anticorpos dirigidos contra o domínio citoplasmático, que se torna interiorizado durante a endocitose. Estes anticorpos podem ser que também pre-conjugados com fluorophores ou immunostained com anticorpos secundários4,5,6,7. A intensidade da fluorescência do immunosignal resultante é proporcional à quantidade de reciclagem de SV. Esta abordagem pode ser usada para determinar o SV constitutiva e induzida por despolarização reciclagem6,8.
Ensaios de absorção de Syt1 podem ser realizados após a transferência de genes mediada por vírus para praticamente todas as células no prato ou transfection esparso de um pequeno número de células. Nosso método combina o ensaio com esparso transfection duplo de neurônios hippocampal preliminares usando o fosfato de cálcio9. Nós usamos uma proteína recombinante marcador conhecida a acumular-se no presynapses, Sinaptofisina fluorescente etiquetada, localizar terminais pré-sináptica e overexpress nossa proteína de interesse, Rogdi. Isto permite-nos testar ou não Rogdi alvos funcionais sinapses e afeta SV reciclagem. O gene que codifica a Rogdi foi originalmente identificado em uma tela para mutantes de Drosophila, caracterizados pela memória prejudicada10. Em humanos, mutações no gene Rogdi causam uma doença rara e devastadora, chamada síndrome de Kohlschütter-Tönz. Os pacientes sofrem de malformações do esmalte dentário e pharmacoresistant epilepsia psicomotoras atrasos; no entanto, a Localização subcellular do produto gene permaneceu evasivo11. Assim, o ensaio de absorção de Syt1 forneceu evidência chave para localização de GFP-etiquetado Rogdi às sinapses funcionais9.
Esta técnica de captação tem diversos benefícios. Primeiro, SV reciclagem pode ser observado tanto em tempo real através da realização de7,de imagens ao vivo12e após fixação6,9 , medindo a intensidade da fluorescência do rótulo Syt1 fluorescência. Além disso, foram desenvolvidas diversas variantes de Syt1 anticorpo. Existem variantes sem marcas de formatação que podem ser rotuladas com um anticorpo secundário, seguindo um protocolo padrão de imunocoloração após a fixação e variantes pre-conjugadas com um rótulo de fluorescência já anexado. Finalmente, baseados em anticorpo fluorescência é vantajosa devido a grande seleção de corantes secundários ou conjugados em comercialmente disponíveis que pode ser usado.
Quando fixação e imunocoloração os neurônios, é também possível mancha para proteínas adicionais e executar análise colocalization. Isto pode ajudar a determinar onde eles estão localizados em relação à reciclagem SVs. A intensidade do rótulo da fluorescência é a medida direta da quantidade de SV reciclagem. Além disso, os anticorpos seletivamente rotulam Syt1 contendo estruturas, resultando em alta especificidade e de fluorescência do pouco fundo4. Protocolos de estimulação diferentes também podem ser usados, tais como buffers de despolarização ou estimulação elétrica protocolos9,12,13,14. No entanto, reciclagem de SV basal pode ser medida sem estimular as culturas neuronal15.
Nosso método trata especificamente a absorção de anticorpo Syt1 nos neurônios duplo-transfectadas com anticorpo secundário immunolabeling após a fixação. No entanto, nos referimos a todas as variantes rotineiramente utilizadas do ensaio em nossa discussão para dar aos espectadores a oportunidade de adaptar o protocolo para necessidades específicas.

<table><tbody><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030-50g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306-100g</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Invitrogen</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>8.03456.0100</td><td></td></tr><tr><td>anti-rato de burro Alexa 647</td><td>Jackson-Immunoresearch</td><td></td><td>715605151 anticorpo</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubos</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>multipoços 24 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>087721H</td><td></td></tr><tr><td>tubo (50 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td>227261</tr><tr><td>FBS superior</td><td>BiochromAG</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Merck</td><td>1.083.421.000</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell 150 (Inkubator)</td> <td>ThermoElectron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500g</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Honeywell</td><td>M0250-500g</td><td></td></tr><tr><td>lâminas</td><td>de microscópio Fisher Scientific</td><td>10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OpenView Experiment Analysis Application</td><td>Software livre, veja os comentários</td><td></td><td>escritos por Noam E. Ziv, Technion &ndash; Instituto de Tecnologia de Israel, Haifa, Israel</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148-1kg</td><td></td></tr><tr><td>capuz de segurança</td><td>ThermoElectron</td><td></td><td>Nº de série 40649111</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>neoFroxx</td><td>1104kg001</td><td></td></tr><tr><td>Synaptotagmin1</td><td>Synaptic Systems</td><td>105311</td><td>monoclonal de camundongo; clone 604.2</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1.086.031.000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&nbsp;</td><td>IKA</td><td>3340001</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>GFL</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Observer. Z1&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Nos terminais de nervo pré-sináptica ativo, vesículas sinápticas passam por ciclos de exo e endocitose. Durante a reciclagem, os domínios luminal de proteínas transmembrana SV tornam-se expostos na superfície da célula. Uma destas proteínas é Synaptotagmin-1 (Syt1). Um anticorpo dirigido contra o domínio luminal de Syt1, uma vez adicionado ao meio de cultura, é retomado durante o ciclo exo-endocytotic. Esta absorção é proporcional à quantidade de SV reciclagem e pode ser quantificada através de imunofluorescência. Aqui, nós combinamos Syt1 absorção de anticorpos com duplo transfeccao de neurônios hippocampal culturas. Isso permite que nós (1) localizar sites pré-sináptica baseados na expressão do marcador pré-sináptica recombinante Sinaptofisina, (2) determinar sua funcionalidade usando Syt1 absorção e (3) caracterizar a segmentação e os efeitos de uma proteína de interesse, GFP-Rogdi.

Um resultado esperado desta abordagem é localizar aproximadamente 50 duplo-transfectadas neurônios por lamela em uma densidade de 50.000 neurônios por bem. O axónio de cada neurônio é esperado para mostrar vários hotspots de acumulação Sinaptofisina fluorescente etiquetado, indicando aglomerados ofSVs. Em sites pré-sináptica funcionais, o sinal de Sinaptofisina recombinante colocalizes com punctate Syt1 fluorescência. Usando a transfeccao duplo, ou GFP-Rogdi como a proteína de interesse (...

Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

A principal vantagem dessa técnica é que ela é muito simples, requer apenas equipamentos padrão e se beneficia da principal vantagem dos anticorpos, que é sua especificidade. O protocolo foi originalmente introduzido por Michela Matteoli e colegas e provou ser altamente eficaz. Eu o usei para testar se uma determinada proteína cordocti está localizada em sinapses ativas.Comece este procedimento cultivando células primárias do hipocampo em lamínulas em uma placa de 24 poços por três dias, conforme descrito no protocolo de texto. Pré-aqueça o meio de soro reduzido, o meio de cultura de células e a água destilada a 37 graus Celsius no banho-maria. Trabalhando sob a capela de fluxo laminar para garantir condições de trabalho estéreis, prepare a mistura de transfecção em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Primeiro, misture 7,5 microlitros de cloreto de cálcio de dois molares com quatro microgramas de cada DNA livre de endotoxinas. Adicione água para atingir um volume total de 60 microlitros em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Agora, adicione 60 microlitros de tampão de transfecção à mistura.Para obter os melhores resultados, adicione o tampão de transfecção gota a gota enquanto agita a mistura de DNA suavemente no vórtice. Incube a mistura de transfecção resultante em temperatura ambiente por 20 minutos. Evite agitar o tubo durante o tempo de incubação.Sob a capela de fluxo laminar, remova o meio de cultura de células dos poços usando uma pipeta de 1.000 microlitros, armazene-o em um recipiente separado e adicione imediatamente 500 microlitros de meio de soro reduzido a cada poço. Armazene o meio condicionado na incubadora. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 até que o período de incubação de 20 minutos para a mistura de transfecção termine.Em seguida, adicione 30 microlitros de mistura de transfecção a cada poço pipetando várias gotas. Descarte o resíduo no fundo do tubo. Depois que todos os poços tiverem sido abastecidos com a mistura de transfecção, agite suavemente a placa de 24 poços para garantir a distribuição da mistura de transfecção no meio.Agora incube os poços por 60 minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Após a incubação, remova e descarte a mistura de transfecção e lave as células três vezes com meio de cultura de células. A etapa de lavagem é crítica.Minimize o tempo que cada poço não tem meio, removendo e substituindo poço por poço. Além disso, certifique-se de adicionar o meio suavemente. Para lavar as células, adicione um mililitro de meio de cultura de células a cada poço e incube-as por 30 segundos em temperatura ambiente.Em seguida, remova 750 microlitros de meio e adicione a mesma quantidade de meio fresco. Depois de repetir esse processo três vezes, remova e descarte o meio de cultura de células e adicione 450 microlitros do meio condicionado poço a poço. Agora deixe os neurônios amadurecerem na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 para DIV 10.Pré-aqueça 600 microlitros de tampão de despolarização 1X e 10 mililitros de meio de cultura de células a 37 graus Celsius no banho-maria. Adicione um microlitro de anticorpo anti-Syt1 de camundongo ao tampão de despolarização 1X e vórtice por 10 segundos. Depois de remover e descartar o meio de cultura de células das células, adicione 200 microlitros da mistura de anticorpos de despolarização a cada poço.Incube a placa por cinco minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2 na incubadora. Remova e descarte a mistura de anticorpos de despolarização e lave as células três vezes com meio de cultura de células. Adicione um mililitro de meio de cultura de células a cada poço e incube por 30 segundos em temperatura ambiente.Em seguida, remova 750 microlitros de meio e adicione a mesma quantidade de meio fresco. Repita esse processo três vezes. Em seguida, remova e descarte o meio de cultura de células e adicione 300 microlitros de 4% de PFA em 1X PBS.Finalmente, incube por 20 minutos a quatro graus Celsius antes de lavar três vezes por cinco minutos cada com 1X PBS. Diluir o anticorpo secundário acoplado a fluoróforo em 200 microlitros de tampão de bloqueio para cada poço a uma diluição de um a 1.000. Remova e descarte o PBS 1X de cada poço contendo lamínulas com os neurônios cultivados.Adicione 200 microlitros de mistura de anticorpos tampão de bloqueio a cada poço e incube por 60 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, lave as células três vezes por cinco minutos com um mililitro de PBS 1X. Em seguida, adicione uma gota de sete microlitros de meio de incorporação na lâmina do microscópio.Remova a lamínula da placa de 24 poços levantando-a com uma cânula e agarrando-a com uma pinça. Mergulhe a lamínula em água destilada para remover o PBS e seque-a cuidadosamente tocando uma borda em um tecido mole. Vire a lamínula na gota do meio de incorporação de modo que a superfície que transporta as células fique voltada para a lâmina do microscópio, incorporando assim as células no meio de incorporação.Deixe as lâminas secarem sob o capô por uma a duas horas, cobrindo-as para evitar a exposição à luz. Armazene as lâminas secas em uma caixa de lâminas de microscópio a quatro graus Celsius. Após a imunomarcação do anticorpo Syt1 com um anticorpo secundário marcado com fluorescência, a extensão da captação de Syt1 é finalmente quantificada usando o imunossinal.A imunofluorescência puntiforme indica locais de captação de Syt1 no campo de visão. Esses locais, portanto, contêm vesículas sinápticas que se reciclaram durante o experimento. A fluorescência sinaptofisina-mOrange indica acúmulos de vesículas sinápticas no axônio de um neurônio transfectado.A fluorescência GFP-Rogdi indica acúmulos de Rogdi no axônio do neurônio transfectado. Esta parte do experimento revela extensa colocalização de GFP-Rogdi e Synaptophysin-mOrange, sugerindo que GFP-Rogdi se acumula em locais pré-sinápticos dentro do axônio. A sobreposição revela quais das coacumulações de GFP-Rogdi e Synaptophysin-mOrange colocalizam com locais de captação de anticorpos Syt1.Os locais marcados por setas representam acúmulos de Rogdi recombinante e sinaptofisina recombinante nas sinapses funcionais. O protocolo descreve uma maneira tecnicamente direta de determinar a extensão da reciclagem de resíduos sinápticos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na ciência molecular e celular, como onde os terminais nervosos pré-sinápticos alocados em um axônio de um determinado neurônio e se uma proteína recombinante ou endógena de interesse se acumula nesses terminais.Após seu desenvolvimento, essa técnica tem sido usada de várias maneiras para monitorar a reciclagem de vesículas sinápticas em terminais pré-sinápticos. Por exemplo, pode ser usado para determinar a reciclagem de vesículas sinápticas em neurônios após superexpressão em proteínas adaptativas, bem como em neurônios obtidos de animais ou de neurônios derivados de células-tronco.

an-optical-assay-for-synaptic-vesicle-recycling-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

Este relatório demonstra uma técnica para isolamento mecânico de cada um dos neurônios viáveis ​​retenção anexado boutons pré-sináptica. Neurônios Vibrodissociated têm as vantagens de rápida produção, controle farmacológico excelente e melhor espaço grampo sem a influência das células vizinhas. Este método pode ser usado para imagens de elementos sináptica e patch-clamp gravação.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

A técnica de imagem ao vivo de fluorescência para quantificar o reabastecimento e mobilização de vesículas sinápticas específicas (SV) piscinas de terminais nervosos central é descrito. Duas rodadas de SV reciclagem são monitorados nos terminais nervosos mesmo fornecendo um controle interno.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

Este vídeo demonstra o procedimento para preparar neurônios cultivados para análise óptica de vesículas sinápticas recicladas. O processo envolve marcação de fluorescência de proteínas de vesículas sinápticas e imunocoloração para rotular e visualizar as vesículas recicladas dentro dos neurônios.

Preparação de neurônios cultivados para análise óptica de vesículas sinápticas recicladas

Descreve-se o uso de corantes estiril FM imagem sináptica reciclagem vesícula nos terminais nervosos funcionais. Este protocolo pode ser aplicado não só a evocada, mas também espontânea e actividades sinápticas em miniatura. O protocolo expande a variedade de eventos sinápticos que podem ser eficazmente analisados.

Exame do Synaptic Vesicle Reciclagem Usando FM Corantes Durante Evocado, espontânea, e as atividades de Synaptic miniatura

Este artigo fornece um método para investigar a dinâmica de vesículas de neurotransmissores em células de neuroblastoma, usando uma construção de sinaptobrevin2-pHluorina e Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total. A estratégia desenvolvida para processamento de imagens e análise de dados também é relatada.

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

Endocitose da vesícula sináptica é detectada pela microscopia de luz de pHluorin fundido com proteínas de vesículas sinápticas e por microscopia eletrônica de absorção da vesícula.

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

Excitabilidade neuronal pode ser modulada através de um processo dinâmico de endo e exocitose de geleificação excitatório glutamato receptores. Aqui descrito é um ensaio acessível, alto teor para quantificação de receptores de superfície e interno população piscinas.

Um ensaio de alto teor para monitoramento Leandro tráfico de Receptor

A formação de presynapse é um processo dinâmico que inclui a acumulação de proteínas sináptica na ordem apropriada. Neste método, a formação do presynapse é provocada pelos grânulos conjugados com uma proteína do organizador do presynapse em folhas axonal da cultura da esfera do Neuron do "", de modo que a acumulação de proteínas sináptica seja fácil de ser analisada durante a formação do presynapse.

Ensaio de formação presynapse usando Presynapse organizador contas e "Neuron Ball" cultura

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

DetectSyn é um ensaio fluorescente rápido e imparcial que mede mudanças no número de sinapse relativa (engajamento pré e pós-sináptico) entre os estados de tratamento ou doença. Esta técnica utiliza uma técnica de ligadura de proximidade que pode ser usada tanto em neurônios cultivados quanto em tecido fixo.

DetectSyn: um método fluorescente rápido e imparcial para detectar alterações na densidade da sinapse

Aprenda um ensaio óptico simples para analisar a reciclagem de vesículas sinápticas em neurônios cultivados usando transfecção e marcadores pré-sinápticos. Este método permite avaliar a dinâmica sináptica e a localização de proteínas em terminais nervosos ativos.

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

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