Um método eficiente de crivagem para isolar intactos glomérulos do rim de rato adulto

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da doença renal. Particularmente na compreensão do glomerulus em estados normais e doentes. A biologia glomerular pode ser difícil de estudar devido à variedade de tipos celulares presentes e sua estrutura única.

A principal vantagem desta técnica é fornecer uma fonte prontamente disponível de glomeruli intacto usando métodos e equipamentos simples. Essa técnica tem implicações para nossa compreensão da barreira de filtragem no rim normal e doente. Em particular, pode lançar luz sobre nossa compreensão da doença renal crônica proteinúrica na qual lesão glomerular leva à secreção anormalmente alta de proteínas séricos na urina.

Geralmente, indivíduos novos nessa técnica terão dificuldade em obter rendimento e pureza adequados na amostra final. Demonstrando o procedimento será Brittney Rush, uma técnica do meu laboratório. Para começar, use cortadores de cabelo para remover o cabelo do abdômen anterior de um rato eutanizado.

Use 70% de etanol para limpar a pele exposta. Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão midline na pele. Para expor órgãos internos, faça uma incisão midline através da camada muscular.

Localize e isole os rins e coloque em um tubo cônico plástico estéril de 50 mililitros com 30 mililitros da solução de sal tampão da Hank ou HBSS colocado no gelo. Transfira o tubo no gelo para um capuz de cultura celular estéril. Transfira os rins para uma placa de Petri estéril contendo cinco mililitros de HBSS colocados no gelo.

Use tesouras e fórceps afiados para remover e descartar gordura perirenal. Para remover e descartar as cápsulas ao redor do rim, faça uma pequena incisão superficial e, em seguida, use fórceps afiados para afastá-lo suavemente do rim. Coloque os rins em uma gaze estéril em uma segunda placa de Petri com cinco mililitros de HBSS e divida cada rim ao meio através de uma seção sagital média.

Use um bisturi para remover e descartar a medula que pode ser identificada por sua cor mais escura e localização central. Transfira as peças restantes contendo predominantemente o córtex renal, em uma terceira placa de Petri com cinco mililitros de HBSS. Use uma lâmina de barbear estéril para pica-las até que as peças estejam com menos de um milímetro de tamanho ou até formar uma pasta.

Use 1%BSA PBS para molhar a parte superior e inferior de uma peneira de 180 micrômetros sobre um béquer de resíduos de 500 mililitros. Este passo é crítico, pois reveste a peneira com proteína e reduz a adesão de glomeruli que, em seguida, melhorará o rendimento. Coloque o córtex misto em uma pequena borda da peneira.

Use a flange de êmbolo texturizado de uma seringa descartável de 10 mililitros para mingau o tecido através da peneira em uma panela inferior colocada no gelo. Enxágüe periodicamente com HBSS usando o mínimo possível para evitar a diluição da amostra e reutilizar o fluido coletado na panela inferior para enxaguar a peneira. Após a peneira completa, lave cuidadosamente a parte inferior da peneira com HBSS da parte inferior da panela para capturar qualquer glomeruli frouxamente aderido.

Divida todo o fluido da panela inferior em seringas de 10 mililitros equipadas com agulhas de calibre 20. Passe o fluido através da agulha pelo menos três vezes na panela inferior. Para a última coleção, mantenha o glomeruli contendo fluido na seringa até que esteja pronto para passá-lo através da peneira de 90 micrômetros.

Enquanto isso, lave a panela inferior lavando-a com 1%BSA PBS e em um béquer de resíduo. Use 1%BSA PBS para molhar a parte superior e inferior de uma peneira de 90 micrômetros e, em seguida, colocá-la na parte superior da panela inferior. Aplique a amostra nas seringas em uma borda da peneira.

Use uma flange de êmbolo texturizado para mingau o tecido através da peneira como feito anteriormente. Use a solução da panela inferior para lavar o tecido e coletar tudo de uma borda da peneira. Uma vez que a peneira esteja completa, lave cuidadosamente a parte inferior da peneira com tampão HBSS da parte inferior da panela para capturar qualquer glomeruli que possa ser vagamente aderido.

Colete todo o fluido da panela inferior em um tubo cônico plástico de 50 mililitros. Use 1%BSA PBS para lavar a panela inferior em um béquer de resíduo. Em seguida, use PBS 1%BSA para molhar a parte superior e inferior de uma peneira de 75 micrômetros.

Coloque a peneira em cima da panela inferior colocada no gelo. Aplique a amostra em uma borda da peneira com líquido fluindo facilmente. Enxágüe a parte superior da peneira com um mínimo de 20 mililitros de 1%BSA PBS em um béquer de resíduo e lave cuidadosamente a parte inferior da peneira.

Para coletar o glomeruli que permaneceu no topo da peneira de 75 micrômetros, enxágue através da peneira de cabeça para baixo com o máximo de HBSS necessário para coletar glomeruli em uma placa de Petri. Colete o glomeruli peneirado em um tubo cônico plástico de 50 mililitros no gelo. Depois de centrifugar a 1800 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius, remova o sobrenatante cuidadosamente usando uma pipeta.

Suspenda a pelota em 10 mililitros de HBSS frios. Combine as amostras e repita a centrifugação. Suspenda o glomeruli em cinco mililitros de HBSS.

Para contar o glomeruli total, coloque uma queda de 10 microliter da amostra em um slide de vidro, conte sob um microscópio e múltiplo por 500 para obter o rendimento total. Estruturas isoladas devem consistir em quase todos os glomeruli sem estruturas tubulares. Se os túbulos estiverem presentes e afetarem sua aplicação a jusante, eles podem ser removidos aplicando toda a amostra na peneira de 90 micrômetros e repetindo o protocolo a partir desse ponto.

O protocolo descrito aqui é eficiente em isolar glomeruli e a suspensão final é densamente embalada com glomeruli com uma pureza superior a 95% e contaminação mínima de segmentos tubulares ou outros tipos de células. Estes glomeruli podem ser manchados com hematoxilina e manchas de eosina para ver sua morfologia. Além disso, mantêm sua estrutura em todo o protocolo mesmo após o processamento.

Eles retêm podocitos intactos e viáveis, células mesangiais e células endoteliais. Os glomeruli isolados foram expostos a lesões químicas para simular a patologia in vivo. Especificamente sulfato de protamina que interrompe a carga da barreira de filtragem glomerular.

Ao contrário do glomeruli saudável, o sulfato de protamina tratado glomeruli, tem uma redução proeminente no nefron e uma série de núcleos positivos para WT1. Quando visto com microscopia eletrônica de transmissão, glomeruli saudável mostram processos típicos de pé. Após o tratamento de sulfato de protamina, os processos dos pés são alongados ou apagados indicando lesão podocyte.

Para determinar a viabilidade celular em glomeruli isolado, o caspase 3 foi observado como um marcador de apoptose. Não havia caspase rachada três a zero e uma hora após o isolamento de glomeruli. Algumas células apresentaram sinais de apoptose às duas e quatro horas com um aumento progressivo ao longo do tempo.

O maior número de células apoptóticas foi observado em 24 e 48 horas. Com base nesses resultados, recomendamos que glomeruli isolado seja usado imediatamente após o isolamento para a maioria dos experimentos. Ao realizar esse procedimento, é importante trabalhar de forma rápida e eficiente.

A partir do momento em que o rim é isolado, glomeruli começa a se deteriorar. Quanto mais rápido você isolar o glomeruli, mais tempo você terá para posar, isolamento, manipulação. Após o isolamento, glomeruli isolado pode ser exposto a agentes químicos ou biológicos para estimular condições fisiológicas ou patológicas.

E os espécimes podem ser processados para isolamento de proteínas ou RNA, histologia ou imunofluorescência e microscopia eletrônica. Desde o seu desenvolvimento na década de 1950, essa técnica tem auxiliado pesquisadores no estudo da biologia glomerular. No geral, este protocolo fornece um método para avaliar as características morfológicas e celulares de glomeruli intacto em estados normais e doentes.

Este método pode ajudar a entender a doença renal crônica proteinúrica e ajudar no desenvolvimento de terapias futuras.