Name: Isolamento de glomérulos e In Vivo de rotulagem das proteínas de superfície celular Glomerular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprenda a rotular proteínas de superfície celular glomerular in vivo usando biotina em camundongos. Este método permite analisar múltiplas proteínas simultaneamente e investigar o tráfego proteico em doenças renais.

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Os autores agradecer Blanka Duvnjak pela sua assistência técnica excepcional. Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 para M.W. e QU280/3-1 para QI. O financiador não tiveram nenhum papel no projeto de estudo, coleta de dados, análise de dados, a decisão de publicar e preparação do manuscrito.

Os ratos foram obtidos como uma raça in-house da instalação de cuidados animais locais ou de Janvier Labs em França. As investigações foram conduzidas de acordo com as diretrizes descritas no guia de cuidados e uso de animais de laboratório (E.U. nacional institutos de saúde publicação n º 85-23, revista em 1996). Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com as aprovações institucionais relevantes (governo do estado LANUV AZ:84 número de referência-02.04. 2016.A435).
1. preparação dos instrumentos, soluções e equipamentos
<ol><li>Preparar 1 L de solução salina tamponada fosfato suplementada com 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) e 0,1 mM de cloreto de cálcio (CaCl2) (PBSCM) e filtrá-la através de um filtro estéril.</li>
	<li>Prepare-se 5 mL de PBSCM estéril por rato para perfusão e colocá-lo no gelo.</li>
	<li>Para cada rato, prepare-se 5 mL de estéril PBSCM suplementado com biotina 0,5 mg/mL.</li>
	<li>Para cada rato, prepare-se 5 mL de PBSCM estéril e adicionar 0,8 x 108 de grânulos magnético (ex., 200 µ l de uma solução de grânulos/mL de 4 x 108 , sem tratamento prévio) para embolização de glomérulos. Prepare esta solução debaixo do banco de cultura de células para manter os grânulos magnéticos no original tubo estéril. Coloque esta solução no gelo.</li>
	<li>Preparar uma solução de resfriamento pela adição de glicina 100 mM para PBSCM (5 mL por rato) e mantê-lo no gelo.</li>
	<li>Fazer uma solução de colagenase (colagenase U/mL 0.378 A em PBSCM estéril). Por rato, Pipetar 1 mL da solução de colagenase em um tubo de 2 mL e colocá-lo no gelo.</li>
	<li>Para lavar, preparar estéril PBSCM (consulte a etapa 1.1) em 50 mL de um tubo e colocá-lo no gelo.</li>
	<li>Para perfusão, use uma bomba de seringa com um fluxo de 2,0 mL/min.</li>
	<li>Prepare uma seringa de 10 mL com agulha 21G. Colocar a ponta da agulha em um cateter de longa 20-30 cm (diâmetro interno, ID = 0,58 mm). Conectar o cateter (ID 0,58 mm) com um cateter curto 10cm (ID 0,28 mm) e corte a ponta do cateter menor oblíquo para uma fácil inserção na aorta de rato.</li>
	<li>Para procedimentos de ligadura durante a cirurgia, corte três 5-7 cm fios de seda (4-0, 6-0) por rato.</li>
	<li>Para a cirurgia, prepare-se 3 grampos cirúrgicos, 2 tesouras cirúrgicas, 2 pinças, 2 pinça fina, 1 tesoura fina e cotonetes. Prepare a anestesia (por exemplo, anestesia intraperitoneal cetamina 100mg/kg de peso corporal e xilazina 5 mg/kg de peso corporal).</li>
	<li>Para o isolamento de glomérulos de dois rins, use um coador de célula de 100 µm, dois tubos de 50 ml e um apanhador de ímã.</li>
	<li>Preparar CHAPS lise: 20 mM 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CAPS); 20 mM Tris (hidroximetil)-aminomethan (Tris) pH 7,5; sodiumchorlide de 50mm (NaCl); sodiumfluoride de 50mm (NaF); 15 mM at4P2O7; pH de ácido (EDTA) de ácido etilenodiaminotetracético 0,1 mM 8.0; sodiumorthovanadate 2 mM; e adenosinetriphosphat de 2mm (ATP).</li>
	<li>Centrifugadores legais a 4 ° C.</li>
</ol>2. cirurgia sob o microscópio
<ol><li>Anestesiar o mouse (por exemplo, com xilazina/cetamina intraperitonealmente, consulte a etapa 1.11). Realize o teste do dedo do pé-beliscão para confirmar a anestesia adequada.</li>
	<li>Desinfecte o lado ventral do mouse com isopropanol 70%.</li>
	<li>Executar um corte mediano através da pele da pelve ao esterno e retirar a pele a fáscia abdominal usando uma pinça. Corte a pele em ambos os lados no meio do abdômen com tesoura cirúrgica.</li>
	<li>Alterar os instrumentos cirúrgicos. Aplique um corte mediano da xifoide até a bexiga através da camada muscular abdominal e dividi-los em quatro quadrantes, usando uma pinça e tesoura cirúrgica. Anexe o lado dois superior com grampos na direção do pescoço do mouse com duas pinças cirúrgicas. Nota: O abdômen está agora aberto.</li>
	<li>Colocar os órgãos viscerais à parte com um cotonete estéril e corte do ligamento frênico-hepática com uma tesoura bem.</li>
	<li>Prepare uma ligadura (com um fio de seda 4-0 a 6-0) em torno da aorta proximal das artérias renais na altura da glândula supra-renal com duas pinças bem. Aperte a ligadura da aorta proximal para abolir o fluxo sanguíneo com uma pinça.</li>
	<li>Livre a aorta distal da fáscia, gordura e outros tecidos e preparar uma ligadura ao redor da artéria hepática/mesentérica cranial das artérias renais usando uma pinça cirúrgica bem.</li>
	<li>Preparar uma ligadura (com um fio de seda 4-0 a 6-0) em torno da aorta distal das artérias renais e fixar a veia cava e aorta na altura da bifurcação.</li>
	<li>Corte um furo pequeno na aorta distal às artérias renais para que o buraco é metade do diâmetro da aorta. Colocou o cateter na aorta e corrigi-lo com a ligadura preparada. Atenção: Evite bolhas no sistema de perfusão para evitar embolia gasosa.</li>
	<li>Inicie a perfusão com o PBSCM gelada em uma taxa de fluxo de 2 mL/min.</li>
	<li>Corte um buraco na veia renal a nível das artérias renais com tesoura cirúrgica fina e aperte a ligadura ao redor das artérias hepáticas e mesentéricas. Nota: A rins devem empalidecer após o início da perfusão.</li>
</ol>3. in Vivo Biotinylation
<ol><li>Mudança da seringa, livre de bolhas para PBSCM gelada suplementado com biotina 0,5 mg/mL para a rotulagem de superfície e perfundir rins com 5 mL em uma taxa de fluxo de 2 mL/min. Nota: Misture as soluções PBSCM (por exemplo, rodando os tubos de 50 mL) suavemente para evitar a formação de bolhas dentro da solução. Após a aspiração da solução dentro da seringa, evacue quaisquer bolhas ou o ar da seringa. Use uma cânula extra (21G) na seringa para preencher o espaço na cânula que está conectado ao sistema de cateter. Finalmente, enfiar a seringa dentro da cânula com o cateter sem bolhas.</li>
	<li>Altere a seringa sem bolhas para PBSCM gelada suplementado com glicina 100 mM para saciar os glomérulos e perfundir com 5 mL em um fluxo de 2 mL/min.</li>
	<li>Mudança da seringa, livre de bolhas para PBSCM gelada suplementado com 200 μL magnético grânulos/mL e perfundir os rins em 2 mL/min. Nota: Na superfície renal, embolização de glomérulos com grânulos magnéticos marrons será visível.</li>
</ol>4. isolamento de glomérulos de dois rins
<ol><li>Remova os rins no hilo e a cápsula. Coloque os rins no gelo em 15 mL de PBSCM em um prato de cultura de célula de 10 cm. Eutanásia o mouse com deslocamento cervical sob anestesia depois da colheita, os rins. Os procedimentos de cirurgia e perfusão duram aproximadamente 20-22 min.</li>
	<li>Corte os rins nas peças de menores possível com uma nova lâmina de dois gumes. Mover o tecido em um tubo de 2 mL com 1 mL de colagenase A (ver passo 1.6) e digerir a 37 ° C por 30 min. Antes e depois da digestão, misture delicadamente com uma 1000 μL cortar a pipeta.</li>
	<li>Lave o tecido digerido através de um filtro de célula 100 μm usando PBSCM gelada. Suavemente, use o célula-raspador para picar o restante através de tecido o filtro célula e enxaguá-lo com PBSCM gelada depois de um volume total de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão a 4 ° C 500 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o precipitado com pouco menos de 1,5 mL de PBSCM gelada enquanto num Vortex a pelota. Depois, colocar a suspensão glomerular em um novo tubo de 2 mL.</li>
</ol>5. lavar roupa
<ol><li>Use o apanhador de ímã para puxar os glomérulos para um lado. Aguarde 1 minuto antes de glomérulos moveram-se em direção do ímã.</li>
	<li>Remova o sobrenadante com uma pipeta μL de 1000 enquanto o tubo 2 mL permanece no apanhador de ímã. Durante a lavagem de primeira e segunda etapas (consulte a etapa 5.3), 250 μL do sobrenadante permanece dentro do tubo para evitar a perda de glomérulos. Execute este procedimento rapidamente para evitar deixar estruturas tubulares afundar até o fundo do tubo. Nota: O procedimento de lavagem durará mais tempo caso contrário.</li>
	<li>Retire o tubo de 2 mL do apanhador de ímã e adicionar 1 mL de PBSCM, pipeta e descer (muito importante), então vórtice.</li>
	<li>Volte a colocar o tubo no apanhador de ímã e recomeçar com passo 5.2.</li>
	<li>Repita as etapas de lavagem até que a pureza dos glomérulos atingiu 90%. Por isso, examine uma representante alíquota do sobrenadante sob um microscópio (40-100 X). Nota: Glomérulos aparecerá como rodadas estruturas contendo grânulos magnéticos marrons. Estruturas alongadas são fragmentos tubulares e grânulos magnéticos livre aparecem como pontos de ronda marrons. Os restos da célula podem aparecer como estruturas volumosas.</li>
	<li>Se a pureza é alcançada, estime a contagem de glomérulos dissolvendo os glomérulos em 1 mL de PBSCM. Após a mistura, pegue uma alíquota de 10 μL e conte os glomérulos sob o microscópio. Calcular o número de glomérulos com a seguinte equação: número final de glomérulos = número de glomérulos em 10 μL x 100 alíquota.</li>
	<li>Bem sucedido isolamento dos glomérulos leva a uma variedade de 10.000 40.000 glomérulos.</li>
</ol>6. a proteína extração e imunoprecipitação (IP)
<ol><li>Glomérulos cobrar por centrifugação a 4 ° C a 6800 x g, durante 5 min. Retire o sobrenadante enquanto estiver usando um apanhador de ímã e resuspenda o pellet em gelada do lysis (EG., 30.000 glomérulos em 300 μL; CAMARADAS, ver passo 1.11). Homogeneizar as amostras com um homogeneizador na velocidade máxima por 30 s e lyse-los no gelo por 30 min.</li>
	<li>Remover o material insolúvel por centrifugação a 15.000 x g, durante 30 min para 4 ° C. Pipete o sobrenadante, que inclui a célula lisada para um novo tubo de 1,5 mL. Descarte a pelota.</li>
	<li>Medir a concentração de proteína do líquido sobrenadante usando um bicinchoninic (BCA)-com base em método seguindo as instruções do fabricante. Uma bem sucedida lise de 30.000 glomérulos cede a uma quantidade de proteína glomerular 700-1.000 µ g/ml. Ajuste a quantidade de proteína igual com Lise.</li>
	<li>Tomar uma alíquota de 10% do volume total para glomerular lisado e adicionar 2 x Laemmli + dithiothreithol (TDT) antes de incubação por 5 min a 95 ° C.</li>
	<li>Para IP, incube o resto do lisado com grânulos de agarose streptavidin durante a noite a 4 ° C, um agitador de sobrecarga.</li>
	<li>Centrifugue os grânulos de agarose a 1000 x g por 3 min a 4 ° C, remover o sobrenadante e adicionar 800 μL de tampão de Lise para lavar os grânulos para o emperramento da proteína inespecíficos.</li>
	<li>Repita a lavagem 3 vezes e remover o sobrenadante completamente.</li>
	<li>Adicionar 30 μL de 2 x Laemmli + TDT e incubar a 95 ° C por 5 min.</li>
	<li>Carregar o lisado e sondas IP em um SDS 10% gel e funcione o gel de SDS V de 70 por 30 min, em seguida, a 20 mA por gel para 1,5 h. depois, borre o gel por 2 h em 200 mA em uma membrana de nitrocelulose.</li>
	<li>Bloquear a membrana de nitrocelulose durante a noite a 4 ° C, com 5% albumina de soro bovino (BSA) no tampão de lavagem.</li>
	<li>Incubar a membrana com o anticorpo de interesse durante a noite a 4 ° C. Lavar com buffer de 3 vezes por 5 min num agitador de lavagem e incubar a membrana com o anticorpo secundário HRP-marcados por 1h à temperatura ambiente. Repita a etapa de lavagem.</li>
	<li>Visualize o lisado e imunoprecipitação sondas na membrana, usando um agente quimioluminescente Super-resolução com uma câmera CCD.</li>
</ol>

<ol><li>Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+biology+for+the+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Disease%22%5BJournal%5D)">Podocyte biology for the bedside.</a> American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).</li>
<li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513(2016).</li>
<li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Arrestin2+mediates+nephrin+endocytosis+and+impairs+slit+diaphragm+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).</li>
<li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+alpha+mediates+beta-arrestin2-dependent+nephrin+endocytosis+in+hyperglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemitry%22%5BJournal%5D)">PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia.</a> Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).</li>
<li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+Trafficking+at+the+Mature+Podocyte+Slit+Diaphragm%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 32(2017).</li>
<li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+trafficking+in+podocyte+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Membrane trafficking in podocyte health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).</li>
<li>Soda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+dynamin%2C+synaptojanin%2C+and+endophilin+in+podocyte+foot+processes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).</li>
<li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein--nephrin--is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li>
<li>Martin, C. E., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrin+Signaling+in+the+Podocyte%3A+An+Updated+View+of+Signal+Regulation+at+the+Slit+Diaphragm+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302(2018).</li>
<li>Nielsen, J. S., McNagny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+podocalyxin+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The role of podocalyxin in health and disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).</li>
<li>Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab27+effector+Slp2-a+transports+the+apical+signaling+molecule+podocalyxin+to+the+apical+surface+of+MDCK+II+cells+and+regulates+claudin-2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).</li>
<li>Tossidou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytic+PKC-alpha+is+regulated+in+murine+and+human+diabetes+and+mediates+nephrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis.</a> Public Library of Science One. 5 (4), 10185(2010).</li>
<li>Qin, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+nephrin+triggers+its+internalization+by+raft-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).</li>
<li>Waters, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+promotes+dynamin-dependent+endocytosis+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinases+endocytosis+in+endothelium%3A+biology+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).</li>
<li>Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+trafficking+mechanisms+in+endothelial+cells+as+modulators+of+the+tumor+vasculature+and+targets+of+antiangiogenic+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Journal%22%5BJournal%5D)">Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).</li>
<li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li>
<li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+glomeruli+from+mice%3A+A+practical+approach+for+beginners%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li>
<li>Haase, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vivo+method+to+quantify+slit+diaphragm+protein+abundance+in+murine+proteinuric+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease.</a> Public Library of Science One. 12 (6), 0179217(2017).</li>
<li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aPKClambda+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).</li>
<li>Tomas, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+type-1+domain-containing+7A+in+idiopathic+membranous+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy.</a> New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).</li>
<li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+labeling+of+neurotransmitter+transporters+at+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface.</a> Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).</li>
<li>Ougaard, M. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502(2018).</li>
<li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O método apresentado permite isolamento bem sucedido de glomérulos para investigar glomerular RNA ou proteína. Além disso, culturas de células glomerular primária podem ser realizadas de glomérulos isolados. Se biotina é aplicada antes de isolamento glomerular, rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular pode ser executada. Com este método, na vivo celular glomerular proteína tráfico pode ser estudado, e semi quantificação da abundância de proteína é possível. Os passos mais críticos para o teste co...

Proteinúria é uma marca registrada de lesão glomerular e acompanha geralmente o rompimento do filtro glomerular1. O filtro glomerular é composto o endotélio fenestrado, membrana basal glomerular e podócitos. A delicada estrutura molecular do filtro glomerular é altamente dinâmico e sujeito a proteína de superfície celular tráfico de ambos os rins saudáveis e doentes,2,3,4,5,6 . Endocitose de proteínas de superfície celular tem demonstrado ser essencial para a sobrevivência dos podócitos7. Nefrina e podocalyxin são proteínas transmembrana expressadas em podócitos. Nefrina é a espinha dorsal do diafragma fenda glomerular, enquanto podocalyxin é um sialoglycoprotein revestimento os processos secundários pé de podócitos8,9,10. Endocítica tráfico tem sido mostrado anteriormente para Nefrina podocalyxin3,11,12,13,e14.
O melhor de nosso conhecimento, endocitose das proteínas de superfície celular ainda não foi descrita em células endoteliais glomerulares na literatura. No entanto, as células endoteliais expressam em geral todas as proteínas necessárias para os diferentes tipos de endocitose (ou seja, dependente da jangada, dependente de Clatrina endocitose)15,16. Portanto, a célula endotelial tráfico de superfície pode ser estudado com esse método, usando, por exemplo, vascular endothelial (VE)-caderina e molécula de adesão intracelular (ICAM-2), como uma célula de superfície proteínas marcador para células endoteliais glomerulares17 .
Infelizmente, não há nenhum modelo exato em vitro para o delicado filtro glomerular em três camadas no qual célula tráfico de proteína pode ser estudado. O objetivo desse método é, portanto, para estudar proteína glomerular de tráfico na vivo. Além disso, este protocolo contém informações sobre como isolar os glomérulos, permitindo ainda mais a análise do RNA, proteínas ou células glomerular. Semelhante isolamento glomerular técnicas têm sido descritas por diferentes grupos de18,19.
Anteriormente, nós e os outros têm usado ex vivo rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular por biotinylation2,3,4,20,21. No entanto, neste método ex vivo , glomérulos isolados foram expostos ao estresse mecânico, que pode influenciar o tráfico endocítica. Alternativamente, imunofluorescência rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular tem sido usado extensivamente na literatura2,20,22. Com este método, no entanto, apenas um pequeno número de proteínas pode ser analisado dentro de um slide, e quantificação das imagens de imunofluorescência é muitas vezes difícil.
Este método de romance na vivo oferece uma ferramenta confiável para estudar células glomerulares proteína abundância e tráfico com precisão em saudáveis e doentes os rins, e pode ser usada como um complemento para testes de imunofluorescência.

<table><tbody><tr><td>Motic SMZ168 BL</td><td>Motic</td><td>microscópio SMZ168BL</td><td>para cirurgia de camundongos</td></tr><tr><td>KL1500LCD</td><td>Pulch e microscopia Lorenz</td><td>150500</td><td>luz para cirurgia de camundongos</td></tr><tr><td>Rompun (Xylazin) 2%</td><td>Bayer</td><td>PZN:01320422</td><td>anestesia</td></tr><tr><td>Microfederschere</td><td>Braun, tesoura fina Aesculap</td><td>FD100R</td><td>, para corte na aorta</td></tr><tr><td>Durotip Feine Scheren</td><td>Braun, Aesculap</td><td>BC210R</td><td>para corte abdominal</td></tr><tr><td>Anatomische Pinzette</td><td>Braun, Aesculap</td><td>BD215R</td><td>para cirurgia até que o abdômen seja aberto</td></tr><tr><td>Pr&auml; parierklemme</td><td>Aesculap</td><td>BJ008R</td><td>para cirurgia&nbsp;</td></tr><tr><td>Seraflex</td><td>Serag Wiessner</td><td>IC108000</td><td>fio de seda</td></tr><tr><td>Cetamina 10%</td> <td>Medistar</td><td></td><td>anestesia</td></tr><tr><td>Rompun (xilazina) 2%</td> <td>anestesia Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno de furo fino ID 0,28 mm OD 0,61 mm</td><td>Portex</td><td>800/100/100</td><td>Cateter</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno de furo fino ID 0,58 mm OD 0,96 mm</td><td>Cateter Portex</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho Harvard 11 Plus</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2209</td><td>bomba de seringa</td></tr><tr><td>EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotina</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>biotina</td></tr><tr><td>Dynabeads Células T de camundongo intocadas</td><td>Invitrogen</td><td>11413D</td><td>para embolizar glomérulos</td></tr><tr><td>Colagenase A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>para digerir o tecido renal</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>Coletor de ímã</td> <td>123.21D</td></tr><tr><td>100&micro; corante de células m</td><td>Greiner-bio</td><td>542000</td><td>para isolamento glomerular</td></tr><tr><td>Axiovert 40 CFL</td><td>Zeiss</td><td>não disponível</td><td>para confirmar a pureza glomerular</td></tr><tr><td>TissueRuptor</td><td>Quiagen</td><td>9002755</td><td>Homogeneizador de tecidos</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td>para tampão de lise</td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>para tampão</td></tr> <tr>de lise<td>Produtos químicos NaCl</td><td>VWR</td><td>27810295</td><td>para tampão de lise</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td>para tampão de lise</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>para tampão de lise</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34369-07-8</td><td>para tampão de lise</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Siga as instruções do fabricante</td></tr><tr><td>anticorpo de nefrina</td><td>Progen</td><td>GP-N2</td><td>para westernblot</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal de cabra anti-podocalixina</td><td>R & D Systems</td><td>AF15556-SP</td><td>para westernblot</td></tr><tr><td>Streptavidin Agarose Resin</td><td>Thermo Scientific</td><td>20347</td><td>para imunoprecipitação</td></tr><tr><td>Proteína A sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17096303</td><td>para imunoprecipitação</td></tr><tr><td>anticorpo policlonal de coelho anti-p57</td><td>SCBT</td><td>sc-8298</td><td>para imunohistoquímica</td></tr><tr><td>anticorpo monoclonal de actina anti-beta de camundongo, clone AC-74</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td>Western blot controle de carga</td></tr><tr><td>coelho anti-p44 / 42</td><td>sinalização celular</td><td>4695</td><td>para westernblot</td></tr><tr><td>Pierce Streptavidina-HRP de alta sensibilidade</td><td>Thermo Scientific</td><td>21130</td> para <td></td></tr><tr><td>camundongo policlonal westernblot ICAM-2 anticorpo R</td><td>& D Systems</td><td>AF774</td><td>para</td></tr><tr><td>camundongo policlonal westernblot anti-VE-caderina</td><td>R& D Systems</td><td>AF1002</td><td>para westernblot</td></tr></tbody></table>

isolamento de glomérulos e in vivo de rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Proteinúria resulta do rompimento do filtro glomerular que é composto o endotélio fenestrado, membrana basal glomerular e podócitos com seus diafragmas de fenda. A estrutura delicada do filtro glomerular, especialmente o diafragma de fenda, baseia-se sobre a interacção das proteínas de superfície celular diversos. Estudar estas proteínas de superfície celular até agora tem sido limitada a estudos em vitro ou análise histológica. Aqui, apresentamos um biotinylation murino na vivo rotulagem método, que permite o estudo de proteínas de superfície celular glomerular sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Este protocolo contém informações sobre como perfundir os rins do rato, isolar glomérulos e executar imunoprecipitação endógena de uma proteína de interesse. Semi quantificação da abundância de superfície celular glomerular é prontamente disponível com este novo método e todas as proteínas acessíveis à perfusão de biotina e imunoprecipitação pode ser estudada. Além disso, o isolamento de glomérulos com ou sem biotinylation mais permite análise da glomerular RNA e proteína, bem como a cultura de células glomerular primária (ou seja, cultura de células primárias podocyte).

Para isolar glomérulos com precisão, é necessário perfundir murino rins com PBSCM primeiro. Perfusão com PBSCM transforma os rins pálidos (Figura 1A). Embolização de glomérulos com grânulos magnéticos será visível como pontos marrons na superfície do rim (Figura 1B). Isolamento de glomérulos com o apanhador de ímã pode apresentar contaminação com túbulos renais (Figura 1</str...

Aqui nós apresentamos um protocolo para murino na vivo rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular com biotina. Este protocolo contém informações sobre como perfundir os rins do rato, isolar glomérulos e executar endógena imunoprecipitação da proteína de interesse.

Isolamento de glomérulos e In Vivo de rotulagem das proteínas de superfície celular Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da nefrologia sobre o papel do tráfico de proteínas superficiais celulares na doença renal proteinúrica e não proteinúrica. As principais vantagens dessa técnica são que facilita o estudo do tráfico de proteínas superficiais celulares in vivo e que mais de uma proteína pode ser analisada por experimento. Embora este método possa fornecer informações sobre o tráfico de superfície celular glomerular, também pode ser aplicado a outros sistemas de órgãos que são perfumados e são acessíveis por técnicas de isolamento.Comece confirmando a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo do dedo e desinfetando o lado ventral do mouse anestesiado com isopropílico de 70%. Faça um corte mediano através da pele da pelve para o esterno e use pinças para remover a pele da fáscia abdominal. Corte a pele em ambos os lados da linha média abdominal e faça um médio através da camada muscular abdominal da bexiga para o xiphoide.Use a tesoura e fórceps para dividir os músculos em quatro quadrantes e use dois grampos cirúrgicos para fixar os dois quadrantes superiores em direção ao pescoço dos animais. Coloque o animal sob um microscópio dissecando e use uma troca estéril para afastar os órgãos viscerais. Usando uma tesoura fina, corte o ligamento frênico hepático.Usando pinças cirúrgicas finas, coloque uma sutura ao redor da artéria mesentórica hepática branial das artérias renais. E ao redor da aorta, proximal às artérias renais, na glândula suprarrenal. Liberte a aorta distal da fáscia, gordura e outros tecidos.Em seguida, fixar a veia cava e a aorta no auge da bifurcação e colocar outra sutura ao redor da aorta distal das artérias renais. Use pinças para apertar a sutura aórtica proximal, atenuando o fluxo sanguíneo e cortando um pequeno orifício metade do diâmetro da aorta na aorta, distal às artérias renais. Insira um cateter de 10 centímetros ligado a uma seringa de 10 mililitros contendo cinco mililitros de PBS gelado mais cálcio e magnésio na aorta.E conserte o cateter com as ligaduras preparadas. Então comece a perfundar os rins a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto. Usando uma tesoura fina para fazer um buraco na veia renal nas artérias renais e apertando a sutura ao redor das artérias hepáticas e mesentóricas.Após todo o volume de PBS ter sido entregue substitua o perfusato por cinco mililitros de PBS gelado mais cálcio e magnésio suplementados com 0,5 miligramas por biotina mililitro para rotulagem superficial. Continue perfunde os rins a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto. Quando todo o volume for entregue, conecte uma seringa contendo cinco mililitros de PBS gelado mais cálcio e magnésio suplementados com glicina de 100 milimolars ao cateter.Sacie o glomeruli com todos os cinco mililitros da solução glicina a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto. Em seguida, perfunde os rins com cinco mililitros de PBS gelado mais cálcio e magnésio suplementados com 200 microliters de contas magnéticas por mililitro a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto. A embolização do glomeruli com as contas magnéticas marrons será visível na superfície dos rins.Quando todas as contas tiverem sido entregues, remova a cápsula dos rins e colde os rins no hilum. Coloque os rins em um prato de cultura celular de 10 centímetros contendo 15 mililitros de PBS mais cálcio e magnésio. Use uma nova lâmina de dois gumes para cortar os rins nos menores pedaços possíveis.Transfira o tecido para um tubo de dois mililitros contendo um mililitro de colagenase A por 30 minutos a 37 graus Celsius, misturando a solução de tecido suavemente antes e depois da digestão com uma ponta de pipeta de 1000 microliter modificada. No final da incubação, filtrar o tecido digerido através de um coador de células de 100 mícrons. Use um raspador de células e PBS gelado mais cálcio e magnésio para amassar o tecido restante através do coador celular.Traga o volume final da suspensão de célula única renal até 50 mililitros com PBS gelado fresco mais cálcio e magnésio e colete as células renais por centrifugação. Remova o supernasce e suspenda novamente a pelota com pouco menos de 1,5 mililitros de PBS gelado mais cálcio e magnésio enquanto o vórtice e transfira a suspensão glomerular em um novo tubo de dois mililitros. Para lavar o glomeruli, coloque o tubo em um ímã para agregar o glomeruli.Após um minuto, use uma pipeta de 1000 microliter para remover o supernatante. E remova o tubo do ímã. Adicione um mililitro de PBS mais cálcio e magnésio aos tecidos.Pipeta o glomeruli para cima e para baixo uma vez e vórtice das células. Devolva o tubo ao ímã e lave o glomeruli novamente como apenas demonstrado. Até que uma pureza amostra tenha atingido pelo menos 90% por análise de microscópio leve em uma ampliação de 40 a 100 X.Em seguida, coletar o glorificado de contas magnéticas por centrifugação. Para alcançar uma pureza superior a 95%, o glomeruli precisava ser lavado completamente como demonstrado. A perfusão de biotina facilita a rotulagem dos laços capilares em rins de camundongos perfusados não controlados.A precipitação imunológica da fração de biotina de extratos glomerulares revela que as proteínas transmembranas glomerulares nephrin e podocalyxina são imunoprecipitadas com a biotina, mas não com a fração de controle. A coloração da fração imunoprecipitada com streptavidin confirma ainda mais a presença de neferin biotina na biotina perfumada, mas não controla animais perfusados. A cadherina endotelial de proteína endotelial e a molécula de adesão intracelular dois também são imunoprecipitadas dentro da fração de biotina.Na fase inicial da nefrite nefrotóxica uma expressão reduzida da nefrina da superfície celular é observada em animais de nefrrite nefrotóxica em comparação com os controles. De fato, a análise densitoótica mostra uma redução significativa da nefrina biotina em animais de nefrêrite nefrotóxica em comparação com os controladores. A análise quantitativa da razão nefrina total para actina não revela diferenças significativas entre o controle e os camundongos nefrortoxicos.Além disso, quantidades iguais de podocitos são observadas em nefrite neftóxica nefortoxixic e animais de controle. No final da nefrite nefrotóxica tardia, os animais nefróticos nefrotóxicos exibem uma recuperação da expressão nefríria sem diferenças significativas na nefrina da superfície celular medida entre o controle e os camundongos nefrotóxicos neftóxicos e uma redução total da nefrínia em animais nefóticos neforfróxicos. Além disso, o número de podocyte é reduzido em comparação com os animais de controle.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as seringas livres durante sua conexão, a fim de evitar a embolia do ar do glomeruli e trabalhar sob condições frias de gelo uma vez que a perfusão renal tenha começado. Após este procedimento, outros métodos como o isolamento do RNA glomeruli e da proteína podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre expressão proteica ou interações em rins saudáveis e doentes.

isolation-glomeruli-vivo-labeling-glomerular-cell-surface

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Isolando células gliais entéricas da submucosa e lâmina própria de um camundongo

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