Isolamento de glomérulos e In Vivo de rotulagem das proteínas de superfície celular Glomerular

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da nefrologia sobre o papel do tráfico de proteínas superficiais celulares na doença renal proteinúrica e não proteinúrica. As principais vantagens dessa técnica são que facilita o estudo do tráfico de proteínas superficiais celulares in vivo e que mais de uma proteína pode ser analisada por experimento. Embora este método possa fornecer informações sobre o tráfico de superfície celular glomerular, também pode ser aplicado a outros sistemas de órgãos que são perfumados e são acessíveis por técnicas de isolamento.

Comece confirmando a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo do dedo e desinfetando o lado ventral do mouse anestesiado com isopropílico de 70%. Faça um corte mediano através da pele da pelve para o esterno e use pinças para remover a pele da fáscia abdominal. Corte a pele em ambos os lados da linha média abdominal e faça um médio através da camada muscular abdominal da bexiga para o xiphoide.

Use a tesoura e fórceps para dividir os músculos em quatro quadrantes e use dois grampos cirúrgicos para fixar os dois quadrantes superiores em direção ao pescoço dos animais. Coloque o animal sob um microscópio dissecando e use uma troca estéril para afastar os órgãos viscerais. Usando uma tesoura fina, corte o ligamento frênico hepático.

Usando pinças cirúrgicas finas, coloque uma sutura ao redor da artéria mesentórica hepática branial das artérias renais. E ao redor da aorta, proximal às artérias renais, na glândula suprarrenal. Liberte a aorta distal da fáscia, gordura e outros tecidos.

Em seguida, fixar a veia cava e a aorta no auge da bifurcação e colocar outra sutura ao redor da aorta distal das artérias renais. Use pinças para apertar a sutura aórtica proximal, atenuando o fluxo sanguíneo e cortando um pequeno orifício metade do diâmetro da aorta na aorta, distal às artérias renais. Insira um cateter de 10 centímetros ligado a uma seringa de 10 mililitros contendo cinco mililitros de PBS gelado mais cálcio e magnésio na aorta.

E conserte o cateter com as ligaduras preparadas. Então comece a perfundar os rins a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto. Usando uma tesoura fina para fazer um buraco na veia renal nas artérias renais e apertando a sutura ao redor das artérias hepáticas e mesentóricas.

Após todo o volume de PBS ter sido entregue substitua o perfusato por cinco mililitros de PBS gelado mais cálcio e magnésio suplementados com 0,5 miligramas por biotina mililitro para rotulagem superficial. Continue perfunde os rins a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto. Quando todo o volume for entregue, conecte uma seringa contendo cinco mililitros de PBS gelado mais cálcio e magnésio suplementados com glicina de 100 milimolars ao cateter.

Sacie o glomeruli com todos os cinco mililitros da solução glicina a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto. Em seguida, perfunde os rins com cinco mililitros de PBS gelado mais cálcio e magnésio suplementados com 200 microliters de contas magnéticas por mililitro a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto. A embolização do glomeruli com as contas magnéticas marrons será visível na superfície dos rins.

Quando todas as contas tiverem sido entregues, remova a cápsula dos rins e colde os rins no hilum. Coloque os rins em um prato de cultura celular de 10 centímetros contendo 15 mililitros de PBS mais cálcio e magnésio. Use uma nova lâmina de dois gumes para cortar os rins nos menores pedaços possíveis.

Transfira o tecido para um tubo de dois mililitros contendo um mililitro de colagenase A por 30 minutos a 37 graus Celsius, misturando a solução de tecido suavemente antes e depois da digestão com uma ponta de pipeta de 1000 microliter modificada. No final da incubação, filtrar o tecido digerido através de um coador de células de 100 mícrons. Use um raspador de células e PBS gelado mais cálcio e magnésio para amassar o tecido restante através do coador celular.

Traga o volume final da suspensão de célula única renal até 50 mililitros com PBS gelado fresco mais cálcio e magnésio e colete as células renais por centrifugação. Remova o supernasce e suspenda novamente a pelota com pouco menos de 1,5 mililitros de PBS gelado mais cálcio e magnésio enquanto o vórtice e transfira a suspensão glomerular em um novo tubo de dois mililitros. Para lavar o glomeruli, coloque o tubo em um ímã para agregar o glomeruli.

Após um minuto, use uma pipeta de 1000 microliter para remover o supernatante. E remova o tubo do ímã. Adicione um mililitro de PBS mais cálcio e magnésio aos tecidos.

Pipeta o glomeruli para cima e para baixo uma vez e vórtice das células. Devolva o tubo ao ímã e lave o glomeruli novamente como apenas demonstrado. Até que uma pureza amostra tenha atingido pelo menos 90% por análise de microscópio leve em uma ampliação de 40 a 100 X.

Em seguida, coletar o glorificado de contas magnéticas por centrifugação. Para alcançar uma pureza superior a 95%, o glomeruli precisava ser lavado completamente como demonstrado. A perfusão de biotina facilita a rotulagem dos laços capilares em rins de camundongos perfusados não controlados.

A precipitação imunológica da fração de biotina de extratos glomerulares revela que as proteínas transmembranas glomerulares nephrin e podocalyxina são imunoprecipitadas com a biotina, mas não com a fração de controle. A coloração da fração imunoprecipitada com streptavidin confirma ainda mais a presença de neferin biotina na biotina perfumada, mas não controla animais perfusados. A cadherina endotelial de proteína endotelial e a molécula de adesão intracelular dois também são imunoprecipitadas dentro da fração de biotina.

Na fase inicial da nefrite nefrotóxica uma expressão reduzida da nefrina da superfície celular é observada em animais de nefrrite nefrotóxica em comparação com os controles. De fato, a análise densitoótica mostra uma redução significativa da nefrina biotina em animais de nefrêrite nefrotóxica em comparação com os controladores. A análise quantitativa da razão nefrina total para actina não revela diferenças significativas entre o controle e os camundongos nefrortoxicos.

Além disso, quantidades iguais de podocitos são observadas em nefrite neftóxica nefortoxixic e animais de controle. No final da nefrite nefrotóxica tardia, os animais nefróticos nefrotóxicos exibem uma recuperação da expressão nefríria sem diferenças significativas na nefrina da superfície celular medida entre o controle e os camundongos nefrotóxicos neftóxicos e uma redução total da nefrínia em animais nefóticos neforfróxicos. Além disso, o número de podocyte é reduzido em comparação com os animais de controle.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as seringas livres durante sua conexão, a fim de evitar a embolia do ar do glomeruli e trabalhar sob condições frias de gelo uma vez que a perfusão renal tenha começado. Após este procedimento, outros métodos como o isolamento do RNA glomeruli e da proteína podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre expressão proteica ou interações em rins saudáveis e doentes.