Estudos estruturais de macromoléculas em solução usando o pequeno ângulo de espalhamento de raios-x

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da bioquímica, como tamanho, forma e alterações conformais de biomoléculas e seus complexos. A principal vantagem dessa técnica é que os experimentos podem ser realizados sob condições fisiologicamente relevantes de tampão em um ambiente onde as biomoléculas são estáveis. O SAXS é uma técnica complementar para muitos outros métodos biofísicos e estruturais de biologia.

A combinação do SAXS com esses métodos pode nos ajudar no desenvolvimento de terapêuticas baseadas em estruturas. Embora este método possa fornecer insights sobre complexos biomoleculares, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como estudar nanoparticals e versículos de entrega de drogas. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão porque ele aparece como um processo avassalador e complicado, para passar de dados de dispersão bruta para estruturas de baixa resolução.

A demonstração visual desse método é fundamental, pois o pipeline de análise de dados para obter modelos estruturais a partir de dados brutos é difícil de aprender porque envolve o uso de muitos pacotes diferentes de software. Existem alguns pacotes de software que são úteis para a análise de dados SAXS. Estes incluem SCATTER, BioXTAS RAW e a suíte ATSAS.

Neste vídeo, forneceremos uma visão geral das etapas gerais a serem tomadas ao analisar dados brutos do SAXS, usando o conjunto de programas ATSAS. Para começar, instale e carregue o conjunto de programas ATSAS. Abra o programa PRIMUS/Qt e vá para a opção Menu Aberto.

Aqui, selecione até 13 arquivos de dados de interesse. Os arquivos de dados devem estar no formato ASCII, no qual a primeira coluna é o eixo s-vetor e a segunda coluna é a intensidade. Repita esta etapa para os dados apenas do buffer, inserindo esses dados em um segundo menu Ferramentas.

Em seguida, navegue até a janela Processamento de dados e selecione Subtrair. Isso gerará uma curva de dispersão subtraída, representando apenas a dispersão da macromolécula de interesse. Para realizar a análise de Guinier, comece com uma curva de dispersão subtraída de buffer carregada em PRIMUS/Qt.

Próximo clique em Raio de Gyration, que abrirá o Assistente Primus Guinier. Neste ponto, será exibido um gráfico mostrando o registro natural da intensidade versus ângulos de dispersão ao quadrado. Para obter um raio preliminar de giro, encontre a janela Prompt de Comando e use a função Autorg.

Depois de empurrar Autorg, clique no limite superior para cima um e, em seguida, para baixo um para forçar o programa a atualizar as medidas estatísticas. Alternativamente, insira vários arquivos ao mesmo tempo clicando no mesmo prompt aberto e selecionando vários nomes de arquivos de dados, destacando-os da mesma maneira descrita anteriormente. Para iniciar a análise de Kratky, clique para selecionar o nome do arquivo de dados.

Isso irá traçar os dados na janela. E, em seguida, selecione Plot. Em seguida, abaixo do botão Plot, clique em Kratky Plot.

Como resultado, as proteínas globulares exibem um pico GALC-ean enquanto proteínas desdobradas exibirão um platô em vez de um pico e se assemelham a uma trama hiperbólica como a mostrada aqui. Buffer de carga subtraído dados para cada concentração em PRIMUS/Qt mais uma vez. E sob a guia Processamento, clique em Dimensionar e inspecionar cada curva e o número de escala i, que se correlaciona com as diluições feitas a partir da amostra original.

Após a inspeção, mescle os dados clicando no botão Mesclar na janela Processamento. Para gerar o gráfico de distribuição de distância, carregue as curvas de dados mescladas em PRIMUS/Qt e, em seguida, clique em Distribuição de Distância na guia Análise. Ajuste a faixa de dados dos dados mesclados para evitar qualquer ruído significativo na extremidade traseira dos dados brutos.

Além disso, omitir pontos de dados próximos ao beamstop na região de baixo q, selecionando o valor de faixa mais baixa e aumentando o número. Para determinar o Dmax, comece com um intervalo de cinco vezes o raio de giro obtido a partir da análise de Guinier. Em seguida, diminua gradualmente esse valor até que o gráfico de distribuição de distância não caia abruptamente para zero no eixo y e não tenha uma cauda longa antes de se aproximar do zero.

Verifique se o raio experimental de giro versus intensidade, que é derivado da aproximação de Guinier e do raio de distribuição de distância dos números de giro versus intensidade são semelhantes. Aqui, a intensidade da luz dispersa é mostrada plotada contra o ângulo de dispersão, sugerindo tanto a qualidade das biomoléculas nidogen-1, laminina gama-1 e seu complexo, bem como sua forma. A distribuição de distância do par de elétrons determinada a partir dos dados de dispersão sugere que as biomoléculas têm uma forma alongada e o enredo kratky sugere que as proteínas estão em um estado dobrado, pois os dados tendem a planar, ou mesmo aumentar na faixa q maior e não ter uma forma de curva de sino.

Além disso, as parcelas de Guinier, que utilizam dados em ângulo de baixa dispersão, indicam a região linear para determinação do raio de giro, que é mostrado aqui para nidogen-1, laminin gamma-1 e seu complexo. Para estudar complexos proteicos-proteínas, o MONSA foi utilizado para obter a estrutura de baixa resolução de todo o complexo nidogen-1 laminin gamma-1, sugerindo que apenas a região terminal C de ambas as proteínas participam de interações mediadoras, enquanto o resto dos domínios estão distantes entre si. Não se esqueça que trabalhar com radiação síncrotron pode ser extremamente perigoso e as precauções e a segurança descritas por cada linha de feixe diferente devem ser sempre tomadas durante a realização da coleta inicial de dados.