Espectroscopia de Nêutrons de Alta Resolução para Estudo da Dinâmica de Proteínas e Água de Hidratação de Picossegundos-Nanossegundos

O retroespalhamento de nêutrons mede a difusão global e a dinâmica interna de proteínas e água de hidratação sem danos por radiação. A espectroscopia de nêutrons acessa simultaneamente correlações espaciais e temporais em nível molecular. Em matéria mole e materiais biológicos, é particularmente interessante obter informações indiretas sobre a ordem local nesses sistemas de desordem de longo alcance.

Assim, o retroespalhamento de nêutrons pode ser usado para estudar dinâmica em biologia, química ou senso material. Outro campo forte é o da energia, com estudos, por exemplo, sobre baterias e células de combustível. O retroespalhamento de nêutrons tem sido usado com sucesso para estudar a dinâmica molecular de proteínas envolvidas em doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e Parkinson.

Os resultados obtidos nos ajudam a entender melhor as características moleculares dessas patologias e podem abrir caminho para o desenvolvimento de melhores diagnósticos. Para preparar o porta-amostras, comece limpando cuidadosamente um porta-amostras plano de alumínio e sua vedação de fio de índio e parafusos com água, seguido de etanol, e depois deixe secar. Pese as diferentes partes do porta-amostras, incluindo o fundo, a tampa e o fio de índio, separadamente em uma balança de precisão.

Coloque o selo de fio de índio de um milímetro no sulco da parte inferior do porta-amostras, deixando uma pequena sobreposição onde as duas extremidades se unem. Adicione cerca de 100 miligramas de proteína liofilizada de modo a preencher a superfície interior da parte inferior do porta-amostras. Em seguida, coloque o porta-amostras em um exsicador com uma placa de Petri contendo pentóxido de fósforo em pó por 24 horas para secar completamente o pó proteico.

Pesar a parte inferior seca do porta-amostras que contém o selo de índio e o pó seco para obter a massa da amostra seca. Retire o pentóxido de fósforo do exsicador e coloque uma placa de Petri com óxido de deutério, bem como a amostra dentro para hidratar o pó. Repita a secagem e hidratação três vezes para completar a troca de hidrogênio por deutério.

Meça a massa de pó regularmente para verificar o nível de hidratação e quando a hidratação estiver ligeiramente acima do nível desejado, espere que a massa diminua lentamente. Uma vez obtida a hidratação desejada, coloque rapidamente a tampa na parte inferior e feche primeiro o porta-amostras com quatro parafusos para interromper a troca de vapor. Coloque e aperte todos os parafusos restantes até que não seja visível nenhum espaço entre a parte inferior e a tampa.

Pesar o porta-amostras selado para verificar se existe qualquer potencial perda de hidratação devido a fugas após a experiência com neutrões. Para preparar a amostra no estado líquido, dissolver a proteína no tampão deuterado. Usando água, determine o volume adequado de líquido a ser colocado no porta-amostras.

Antes de manusear qualquer material, verifique se a dose de radiação ionizante é inferior a 100 microsieverts por hora. Em seguida, seque bem o palito de amostra e remova qualquer amostra anterior. Coloque a amostra no palito de amostra, verifique se há centralização adequada em relação ao centro do feixe e insira o bastão de amostra no forno de crioterapia.

Para adquirir dados no Nomad, vá para a guia de execução e arraste e solte um controlador de criostato de forno na barra de lançamento. Ajuste a temperatura para 200 Kelvin. Use o modo rápido e um tempo limite de 30 minutos para que a temperatura tenha tempo para estabilizar.

Clique no ícone de atualização para executar a rampa de temperatura em segundo plano para aquisição de dados durante a diminuição da temperatura. Arraste e solte o controlador de configurações do Doppler IN16 na barra de ativação. Defina o perfil de velocidade para velocidade precisa, o ajuste para delta E máximo, o deslocamento de energia para 0,00 micro elétron-volt e o número de canais para 128 para obter uma configuração de varreduras de janela fixa elástica.

Arraste e solte um controlador de contagem na barra de ativação, preencha o campo de legenda com um nome que permita fácil identificação dos dados e defina varreduras de 30 segundos com 60 repetições. Em seguida, arraste e solte o controlador de configurações do Doppler IN16 na barra de ativação. Defina o perfil de velocidade para assinar, o definido por velocidade com um valor de 4,5 metros por segundo e o número de canais até 2048 para obter uma configuração de espalhamento de nêutrons quase elástico.

Arraste e solte um controlador de contagem e preencha o campo de legenda com um nome que permita fácil identificação dos dados. Defina varreduras de 30 minutos com quatro repetições. Para a rampa de temperatura, arraste e solte um controlador de criostato do forno, ajuste a temperatura para 310 Kelvin e ajuste a rampa para definir o ponto com um delta de 0,05 Kelvin por seis segundos.

Use um tempo limite de 200 minutos. Use um loop for com 65 repetições. Dentro, insira um controlador de configurações de doppler IN16, seguido pelo controlador de contagem e defina uma única varredura de 30 segundos.

Posteriormente, insira as configurações do Doppler IN16 conforme descrito anteriormente, mas usando um deslocamento de energia de 1,5 micro elétron-volt e 1024 canais. Em seguida, insira o controlador de contagem e defina uma única varredura de três minutos. Para adquirir o último espalhamento de nêutrons quase elástico de 312 Kelvin, arraste e solte as configurações do Doppler IN16 e os controladores de contagem configurados conforme demonstrado anteriormente.

Em seguida, pressione o botão Iniciar para executar o script. As varreduras de janela fixa elástica e inelástica do lisossomo mostraram um aumento no sinal na transferência de baixo momento e baixa transferência de energia, enquanto o sinal na transferência de alta energia e baixa transferência de momento diminuiu. O coeficiente inicial do centro de difusão de massa foi de 15 angstrom ao quadrado por nanossegundo, que então diminuiu exponencialmente ao longo do tempo.

Em temperaturas superiores a 220 Kelvin, a água de hidratação ao redor das fibras de tau foi significativamente mais móvel do que ao redor dos monômeros de tau. A fração de moléculas de água submetidas ao movimento de translação e os coeficientes de translação e rotação de difusão das moléculas de água foram aumentados ao redor das fibras. A concentração de proteínas deve ser de 2000 miligramas por ml ou, pelo menos, de 20 miligramas por ml para as proteínas proteinadas devido às limitações de retroespalhamento de neutrões decorrentes do fluxo de neutrões ou do fundo do tampão do porta-amostras.

O retroespalhamento de nêutrons tem sido aplicado recentemente, por exemplo, para entender como a água, que são as proteínas ambientais naturais, pode ser totalmente substituída por um polímero sintético para aplicação biotecnológica como, por exemplo, a liberação de fármacos.