Name: Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Aprenda a estudar estruturas de complexos proteicos supramoleculares insolúveis em resolução atômica por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de estado sólido com rotação no ângulo mágico.

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Este trabalho é financiado pela ANR (13-PDOC-0017-01 para B.H. e ANR-14-CE09-0020-01 para A.L.), "Os investimentos para o futuro" programa IdEx Bordeaux/CNRS (PPEs 2016 para B.H.) referência ANR-10-IDEX-03-02 para B.H., da Fondation pour la Recherche Médicale ( FRM-AJE20140630090 para A.L.), o programa do 7PQ (FP7-pessoas-2013-CIG para A.L.) e o Conselho Europeu de investigação (CEI) sob Horizonte 2020 investigação e inovação programa da União Europeia (ERC começando Grant para A.L., acordo n 639020) e o projeto " WEAKINTERACT."

Os autores não têm nada para divulgar.

NMR Solid-State (SSNMR) é um método de escolha para caracterizar assemblies de proteína macromolecular no nível atômico. Uma das questões centrais na determinação da estrutura baseada em SSNMR é a qualidade espectral do sistema investigado, que permite estabelecer modelos estruturais 3D de precisão vários, geralmente variando de modelos de baixa resolução (contendo o secundário estrutura elementos e pouca informação 3D) para estruturas 3D pseudo atômicas. A quantidade e qualidade de informações estruturais, extraídas de experiências multidimensionais de SSNMR é a chave para calcular uma estrutura NMR de alta resolução da Assembleia.
O protocolo descrito baseia-se na detecção de 13C -13C e 15N -13C estruturais restrições que exigem a gravação dos vários espectros 2D (e às vezes 3D) com alto sinal-ruído. Em frequências de MAS moderadas (&#60; 25 kHz), a amostra é introduzida em rotores com tamanhos de 3.2-4 mm de diâmetro permitindo a quantidades de proteína de até ~ 50 mg, dependente da hidratação de amostra. A quantidade de amostra no interior do rotor é diretamente proporcional a relação sinal-ruído em espectros SSNMR, um factor decisivo para a detecção de restrições de distância de longo alcance e sua atribuição inequívoca.
A resolução espectral é um parâmetro crucial durante a atribuição de ressonância sequencial e a coleção de restrições. Para obter melhores resultados, os parâmetros de preparação de amostra precisam ser otimizado, particularmente na purificação da subunidade e as condições de montagem (pH, tampão, agitação, temperatura, etc.). Para a otimização de amostra, é recomendável para preparar amostras sem rótulo para várias condições distintas para as quais tem sido observada a montagem e para gravar um 1D 1H -13C CP espectro (descrito no passo 2.1) em cada amostra preparada. Os espectros servem para comparar a resolução espectral e dispersão entre as preparações diferentes, com base em que as condições ideais podem ser determinadas.
A qualidade dos dados SSNMR depende fortemente da escolha dos parâmetros de aquisição NMR, especialmente para as etapas de transferência de polarização. O uso de alta intensidade de campo magnético (frequência de ≥600 MHz 1H) é essencial para a alta sensibilidade e resolução espectral, necessária quando encaramos o complexos alvos como assemblies de proteína macromolecular.
Em muitos casos, um factor limitativo é a disponibilidade do espectrômetro. Portanto, uma escolha criteriosa das amostras para ser preparado deve preceder a sessão espectrômetro. Em qualquer caso, um uniformemente 13C, 15amostra N-etiquetado é um pré-requisito para realizar a atribuição de ressonância sequencial e intra residual. Para proteínas atribuídas por NMR Solid-State técnicas consulte71. Determinação da estrutura de conjuntos macromoleculares em frequências de MAS moderados seletivamente requer 13C-rotulado de amostras; para a detecção de longo alcance 13C -13C e 13C -15N entra em contato com amostras baseadas em 1,3 -13C - e 2 -13C-gylcerol e/ou 1 -13C - e 2 -13C-glicose rotulagem são comumente utilizados, como descrito acima. A escolha entre os dois esquemas de rotulagem baseia o espectral relação sinal-ruído e resolução. Para distinguir entre intrae intermoleculares contatos de longo alcance, mistas etiquetadas e diluídas amostras revelaram-se eficientes.
Em suma, os passos críticos para um estudo estrutural de SSNMR atômico são: (i) a preparação das subunidades e a necessidade de montagem de ser otimizado para obter a amostra de excelente quantidade e qualidade, (ii) o espectrômetro campo força e aquisição parâmetros precisam ser escolhidas com cuidado; (iii) seletivas estratégias de rotulagem são necessárias para a determinação da estrutura 3D e a quantidade de dados necessárias depende da qualidade dos dados e a disponibilidade de dados complementares.
Apesar de sua aplicabilidade a uma ampla gama de sistemas supramoleculares variando de proteínas de membrana de homomultimeric nano-objetos, SSNMR é muitas vezes limitada pela necessidade de mg-quantidades de material desvendar rotulada. Os recentes desenvolvimentos tecnológicos no ultra rápido MAS (≥100 kHz) SSNMR aberta uma via para 1H-detectado NMR e empurrar o limite da quantidade de amostra mínima para sub-mg 72,73,74. No entanto, para estudos detalhados estruturais 13C-rotulado amostras são indispensável, que limita a aplicação de SSNMR para amostras montadas em vitro ou sistemas expressados em organismos que sobrevivem em meio mínimo onde na célula SSNMR é um método emergente (para comentários Veja 75,,76,7778).
Um fator importante na aplicação de SSNMR para obter estruturas 3D de alta resolução é a resolução espectral: heterogeneidade conformacional intrínseca em um assembly pode limitar a análise de espectros e resolução espectral. Resíduo específico 13C rotulagem pode em alguns casos fornecem uma alternativa para obter informações específicas de distância estratégicas resíduos a fim de obter modelos estruturais (para uma recente exemplos ver 79,,80).
SSNMR para determinação da estrutura 3D ainda requer a recolha de vários conjuntos de dados com tempos de coleção de dados muitas vezes longos em instrumentos sofisticados, dependendo da abordagem e o sistema de vários dias ou semanas em um 600-1000 MHz (frequência de1H) espectrômetro. Portanto, o acesso ao tempo de espectrômetro pode ser um fator limitante em um estudo aprofundado de SSNMR.
No caso de conjuntos de proteínas homomultimeric, levando a dados SSNMR de qualidade suficiente para identificar um elevado número de apoios estruturais, tais como em 3,57,64,70, SSNMR Ainda dá sem acesso às dimensões microscópicas. Portanto, em uma determinação de estrutura de novo SSNMR de um conjunto de homomultimeric, EM ou massa-por-comprimento (MPL) dados complementam idealmente SSNMR dados para derivar os parâmetros de simetria. SSNMR dados sozinhos fornecer o atômica intrae intermoleculares interfaces
SSNMR é altamente complementar com técnicas estruturais, tais como medições EM ou MPL, mas os dados também perfeitamente podem ser combinados com estruturas atômicas obtidas por cristalografia de raios x ou NMR do solução em subunidades mutadas ou truncadas. Um número crescente de estudos pode ser encontrado na literatura, onde o conjunto de dados estruturais diferentes permitiu determinar atômicos modelos 3D de conjuntos macromoleculares (consulte a Figura 6 para exemplos representativos).
No campo da biologia estrutural, SSNMR surge como uma técnica promissora para estudarinsolúveis e não cristalina assemblies nos atômico nível, ou seja, fornecendo dados estruturais na escala atômica. A este respeito, SSNMR é o pendente de solução NMR e cristalografia de raios x para assemblies moleculares, incluindo proteínas de membrana em seus conjuntos de ambiente e proteína nativos como envelopes virais, bacterianos filamentos ou amiloides, bem como a RNA e Complexos de RNA-proteína (ver, por exemplo,81). Suas aplicações altamente versátil em vitro e no contexto celular, tais como o acompanhamento de alterações estruturais secundárias, terciárias e quaternários, identificação de superfícies de interação com moléculas de parceiro na escala atômica (por exemplo, 82) e mapeamento de dinâmica molecular no contexto dos complexos montados, indicam o potencial importante de SSNMR em futuros estudos estruturais complexas biomolecular assemblies.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente de</td>
			<td>M9 médio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0,5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6,7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mistura de vitamina MEM 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-glicose</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Composição do meio de expressão mínima para a proteína recombinante produção em Escherichia coli células de BL21.

Avanços na magia-ângulo girando espectroscopia da ressonância magnética nuclear Solid-State (SSNMR) para oferecer uma ferramenta eficiente para a caracterização estrutural de assemblies de proteína macromolecular em uma resolução atômica. Esses assemblies de proteína são onipresentes sistemas que desempenham funções essenciais em muitos processos biológicos. Suas estruturas moleculares, interações e a dinâmica é acessível através de estudos SSNMR, como foi demonstrado por viral (capsids1) e mecanismos de infecção bacteriana (secreção sistemas2,3, pili4), a membrana proteína complexos5,6,7,8 e funcional amiloides 9,10,11. Este tipo de montagem molecular pode também provocar patologias tais como em doenças neurodegenerativas onde proteínas montar nos Estados de misfolded, amiloides e causam comportamento aberrante cela ou célula morte 12,13. Assemblies de proteína são construídos frequentemente pela oligomerização simétrica de cópias múltiplas de subunidades proteicas em grandes objetos supramoleculares de várias formas, incluindo fibras, filamentos, poros, tubos ou nanopartículas. A arquitetura do quaternária é definida por interações fracas entre subunidades proteicas para organizar a montagem espacial e temporal e para permitir a sofisticadas funções biológicas. Investigações estruturais em uma escala atômica sobre esses assemblies são um desafio para técnicas de alta resolução desde sua insolubilidade intrínseca e muitas vezes sua cristalinidade-não restringe o uso de cristalografia de raios x convencional ou solução NMR aproxima-se. Magia-ângulo girando SSNMR (MAS) é uma técnica emergente para obter dados de resolução atômica sobre conjuntos macromoleculares insolúveis e provou sua eficiência para resolver 3D modelos atômicos para um número crescente de sistemas biomoleculares complexas incluindo filamentos bacterianos, assemblies amiloides e partículas virais 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Avanços técnicos na altos campos magnéticos, desenvolvimentos metodológicos e preparação da amostra estabeleceu SSNMR MAS em um método robusto para investigar proteínas insolúveis em vários ambientes, nomeadamente na sua biologicamente relevantes macromoleculares montados estaduais ou nas membranas celulares, tornando a técnica altamente complementares para microscopia cryo-elétron. Em muitos casos, um elevado grau de simetria caracteriza tais conjuntos de proteína. MAS SSNMR explora esse recurso, como todas as subunidades de proteína em uma montagem de homomolecular teria a mesma estrutura local e, portanto, praticamente a mesma SSNMR assinatura, reduzindo drasticamente a complexidade da análise.
Um protocolo eficiente para estudos estruturais de assemblies de proteína macromolecular por MAS moderadas (&#60; 25 kHz) SSNMR é apresentado neste vídeo e pode ser subdividido em diferentes etapas (Figura 1). Vamos demonstrar as fases críticas de fluxo de trabalho de um estudo estrutural de SSNMR, exemplificado em um conjunto de proteínas filamentosas (consulte destacada as etapas na Figura 1), com exceção de purificação de proteínas subunidade, diferindo para cada proteína montagem, mas de fundamental importância para estudos estruturais e sem entrar nos detalhes técnicos/metodológicos de cálculo de estrutura e espectroscopia SSNMR de que tutoriais especializados estão disponíveis online. Enquanto o presente protocolo terá como principal foco no estado sólido NMR experimentos, realizados em condições MAS, o uso de alinhado ambientes biológicos 23,24,25,26 , 27, tais como bicelles alinhados, permitem a investigação de conformação de proteínas e interação dinâmica da proteína-proteína na membrana, como mídia sem tecnologia MAS. Vamos mostrar a expressão da proteína e passos de montagem, bem como a gravação de espectros de SSNMR cruciais e sua análise e interpretação. O nosso objectivo é fornecer insights sobre o pipeline de análise estrutural, permitindo o leitor a realizar um estudo estrutural de resolução atômica de um assembly macromolecular por técnicas SSNMR.
O protocolo abrange 3 seções:
1. produção de amostra NMR Solid-State
Como um pré-requisito para uma análise de NMR Solid-State, os componentes proteicos da montagem macromolecular precisam ser expressos, isótopo-etiquetadas, purificada e montado em vitro no estado complexo como de um nativo (para um ver exemplo Figura 2) . Para garantir alta sensibilidade NMR, enriquecimento de isótopo em 13C e 15N rotulagem é necessário através da utilização de meios de expressão bacteriana mínimo suplementados com 13C e fontes de N 15, como uniformemente 13 C-rotulado glicose/glicerol e 15NH4Cl respectivamente. Em fase posterior do protocolo, 13C-rotulado amostras produziram seletivamente com seletivamente 13fontes C-rotulados como (1,3 -13C)- e (2 -13. C)-glicerol (ou (1 -13. C)- e (2 -13. C)- glicose) são usados para facilitar a análise de NMR. Mista rotulada amostra correspondente a uma mistura equimolar de 50% 13C-rotulados ou 50% e 50% 15N - (1,3 -13C)- e 50% (2 -13. C)-glicose são introduzidos para descrever a detecção de intermoleculares interações. Um alto grau de pureza da proteína, bem como condições rigorosas durante a etapa de montagem são factores-chave para garantir uma ordem estrutural homogênea da amostra final.
2. preliminar caracterização estrutural baseada em NMR Solid-State de unidimensional (1D)
Apresentamos as experiências essenciais para uma análise estrutural por SSNMR. Unidimensional (1D) polarização cruzada (CP) e INEPT / experimentos de28 RINEPT, detectados no 13C núcleos são usados para detectar segmentos de proteína rígida e flexível na montagem, respectivamente e para estimar o grau de estrutural homogeneidade e polimorfismo local (para um ver exemplo, Figura 3).
<st></st>rong &gt; 3. Determinação da estrutura de análise conformacional e 3D
Subseções 1 e 2 dizem respeito a análise conformacional, que baseia-se na atribuição de ressonância SSNMR de todos os resíduos rígidos da Assembleia de proteína, como as mudanças químicas são sondas muito sensíveis ao ambiente local e podem ser usadas para prever a phi/psi diedro ângulos e, assim, determinar a estrutura secundária. A Figura 4 ilustra um exemplo de uma atribuição de ressonância sequencial no núcleo rígida de um conjunto de proteínas. A determinação da estrutura 3D baseia-se a recolha de dados estruturais tais como restrições de distância codificação fechem proximidades (&#60; Å 7-9), que contém ambos intrae intermoleculares informações. Subseções, 3 e 4 descrevem interpretação e coleção de contenção distante de longo alcance. Contatos de longo alcance são definidos como intramolecular 13C -13C proximidades provenientes de resíduos a j, com | i-j | ≥4, definindo assim a dobra de proteína terciária de subunidade monomérica, ou como intermoleculares 13C -13C proximidades, definir as interfaces intermoleculares entre subunidades proteicas no assembly. Intrae intermoleculares interfaces são ilustrados na Figura 5. Apoios SSNMR detectado através de 13C -13C e 15N -13C reassociação experimentos geralmente codificam para distâncias internuclear &#60; 1 nm. Subsecção 4 explica a detecção de restrições de distância intermolecular. Nas assembleias de proteína simétrica, o uso de amostras homogeneamente rotulados (ou seja, 100% uniformemente ou seletivamente rotulado) para identificar as interações intermoleculares subunidade-subunidade é limitado, como ambos intrae inter - molecular contatos levam a sinais detectáveis. A detecção inequívoca de proximidades intermoleculares é conseguida usando amostras etiquetadas mistas, contendo uma mistura equimolar de duas amostras diferente rotuladas, combinado antes da agregação. Subseção 5 introduz brevemente a modelagem da estrutura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Figura 1 : Fluxo de trabalho de um estudo estrutural de resolução atômica por NMR Solid-State. 13 C, 15N isótopo rotulado de produção de proteína, purificação de subunidade, montagem de subunidade, controle de formação de montagem, SSNMR experiências, análise do experimento SSNMR e extração de restrições de distância, e modelagem da estrutura são mostrados. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td><forte>Instrumentos</forte></td>Espectrômetro NMR <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(> 11.7 Tesla)</td><td>Bruker-triplo</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>resonância MAS SSNMR probehead&nbsp;</td><td>Rotores Bruker-SSNMR</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>4mm</td><td>Bruker</td><td>K1910</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5804 R&nbsp;</td><td>Espectrômetro Eppendorf</td><td>5805000629</td><td></td></tr><tr><td>GeneQuant 1300</td><td>Dutscher</td><td>28-9182-13</td><td></td></tr><tr><td>IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td><td>Dutscher</td><td>228001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4450 agitador orbital de bancada</td><td>Dutscher</td><td>78376</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de revólver de tubo</td><td>Dutscher</td><td>79547</td><td></td></tr><tr><td>sonopuls HD 3100</td><td>Bandelin</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser electroporator</td><td>Biorad</td><td>165-2100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>sistema tetracelular mini-PROTEAN</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>AKTA pure system</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td></td></tr><tr><td>pipeta capilar microman M25</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F148502</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Materiais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amiconR ultra-15</td><td>sigma</td><td>Z740199-8EA</td><td></td></tr><tr><td>capilares e pistões</td><td>Gilson&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espátula</td> F148112 <td>Fisher</td><td>13263799</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glicose 13C6</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de amônio-15N</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td></td></tr><tr><td>1,3 13C2 glicerol</td><td>Sigma</td><td>492639</td><td></td></tr><tr><td>2 13C glicerol</td><td>Sigma</td><td>489484</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma</td><td>K1876</td><td></td></tr><tr><td>Carbenilina</td><td>Sigma</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de ferro</td><td>Sigma</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de zinco</td><td>Sigma</td><td>793523</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Vitaminas (100&vezes;)</td><td>Sigma</td><td>M68954</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td></td><td>Sigma T0377</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>azida sódica</td><td>sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfônico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>178837</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unicorn 6.3</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Akta systems</td></tr><tr><td>ccpNMR</td><td>CCPN&nbsp;</td><td></td><td>Sistemas de espectrômetro</td></tr></tbody></table>

escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética nuclear

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Conjuntos supramoleculares proteína papel fundamental nos processos biológicos variando de interação patógeno-hospedeiro, infecção viral para a propagação de doenças neurodegenerativas. Esses assemblies consistem em múltiplas subunidades proteicas, organizadas de forma não-covalente para formar objetos macromoleculares grandes que podem executar uma variedade de funções celulares ou causar consequências prejudiciais. Atômicas insights sobre os mecanismos de montagem e o funcionamento desses assemblies macromoleculares frequentemente permanecem escassos desde sua insolubilidade inerente e não-cristalinidade reduz muitas vezes drasticamente a qualidade dos dados obtidos da maioria das técnicas de usado em biologia estrutural, tais como a cristalografia de raio-x e ressonância magnética Nuclear (NMR) de solução. Aqui apresentamos a espectroscopia de RMN Solid-State de magia-ângulo de giro (SSNMR) como um método poderoso para investigar estruturas de conjuntos macromoleculares em resolução atômica. SSNMR podem revelar detalhes atômicos no complexo montado sem limitações de tamanho e solubilidade. O protocolo aqui apresentado descreve as etapas essenciais da produção de 13C / conjuntos de isótopo-etiquetou a proteína macromolecular15N à aquisição de padrão SSNMR de espectros e sua análise e interpretação. Como exemplo, mostramos o pipeline de uma análise estrutural do SSNMR de um conjunto de proteínas filamentosas.

O fluxo de trabalho típico de SSNMR inclui várias etapas, ilustradas na Figura 1. Geralmente as subunidades de proteína são produzidas por em vitro expressão heteróloga em e. coli, purificadas e montadas sob a tremer, mas às vezes também em condições estáticas. Expressão e purificação de subunidade proteína são seguidos por cromatografia em gel de SDS (Figura 2A). A formação de conjuntos macromoleculares então pode ser confirmada pela análise de microscopia de elétron (EM) (ver Figura 2B para obter um exemplo de um assembly filamentoso).
Após a introdução da assembleia para o rotor SSNMR de proteína, o rotor é inserido o espectrômetro, a frequência de MAS e a temperatura são regulamentadas e registam-se os espectros. Primeiras percepções podem ser obtidas por técnicas SSNMR 1, D. A Figura 3 mostra um típico FID SSNMR, detectado no canal 13C em uma amostra de proteína estruturalmente homogênea, uma 1H -13C CP espectro, revelando as ressonâncias13C presentes no núcleo rígido de subunidade em proteína a montagem e um espectro C INEPTO 2D 1H -13, que representa os resíduos móveis. Para atômicas insights sobre o núcleo rígido da estrutura de montagem, multidimensional SSNMR experiências precisam ser gravadas em uniformemente e seletivamente rotulado amostras para atribuir primeiro as ressonâncias SSNMR e então detectar proximidades de longo alcance (ver Figura 4 de ).
Todos os espectros são processados e analisados com o software adequado para atribuir as ressonâncias SSNMR e extrair intrae apoios de distância intermolecular (Figura 5). As restrições de distância SSNMR também são utilizadas isoladamente ou em conjunto com dados de técnicas complementares, que podem ser integrados ao programa de modelagem.
Para estruturas atômicas representativas dos conjuntos macromoleculares resolvidos por técnicas SSNMR Figura 6 ilustra vários assemblies filamentos de apêndices bacterianas e amiloides.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Figura 6:estruturas filamentosas macromoleculares, determinadas por uma abordagem de NMR Solid-State: filamentos bacterianos e fibrilas de proteína amiloide. A) tipo 1 pilus de uropathogenic e. coli, PDB código 2N7H 4; B) ASC filamento, PDB código 2N1F 63; C) agulhas de sistema de secreção tipo III, PDB códigos 2MME, 2LPZ e 2MEX 2,3,64; D) fibrilas de amiloide-beta AB42, PDB código 2NAO, 5KK3, 2MXU, 65,,66,67 e Osaka mutante PDB código 2MVX 57, Iowa mutante PDB código 2MPZ 58; E) fibrilas de alfa-synuclein, 2N0A de código PDB 68; F) domínio do prião HET-s, 2RNM de código PDB, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Estruturas de conjuntos supramoleculares proteína em resolução atômica são de alta relevância, por causa de seus papéis cruciais em uma variedade de fenômenos biológicos. Neste documento, apresentamos um protocolo para realizar estudos estruturais de alta resolução em assemblies de proteína macromolecular insolúvel e não cristalina por magia-ângulo girando espectroscopia da ressonância magnética nuclear Solid-State (MAS SSNMR).

Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

O objetivo geral deste protocolo é estudar as estruturas de agregados proteicos supramoleculares insolúveis e não cristalinos em resolução atômica por espectroscopia de RMN em estado sólido com rotação no ângulo mágico. Apresentaremos os passos metodológicos essenciais para o estudo das estruturas atômicas de agregados proteicos biomoleculares por RMN em estado sólido. O estudo das estruturas atômicas desses agregados é extremamente desafiador porque são inerentemente insolúveis e não cristalinos.A RMN em estado sólido é uma técnica emergente capaz de estudar a estrutura molecular e a dinâmica com resolução atômica, sem ser limitada pelo tamanho do objeto montado ou pela sua solubilidade. Ilustramos aqui os passos principais para visualizar estruturas atômicas de montagens proteicas biomoleculares por RMN em estado sólido, incluindo a preparação de amostras marcadas isotopicamente, a coleta e a análise de dados estruturais provenientes da RMN em estado sólido. O primeiro passo em um fluxo de trabalho de RMN em estado sólido é a produção de subunidades proteicas marcadas com C13 e N15 e seu montagem in vitro.Inocule um pré-cultivo de 15 mL de meio LB pré-aquecido com uma colônia de células de E. coli transformadas. Incube a 37 graus Celsius com agitação a 200 RPM durante a noite. Para inocular o cultivo principal, transfira todo o pré-cultivo para um litro de meio N9 pré-aquecido contendo as fontes necessárias de carbono e nitrogênio marcados isotopicamente.Estes podem incluir cloreto de amônio marcado com N15, glicose uniformemente marcada com C13, glicose seletivamente marcada com C13 ou glicerol seletivamente marcado com C13. Incubar a 37 graus e medir a densidade óptica a 600 nanômetros assim que o cultivo ficar turvo. Quando a DO atingir um valor de 0,8, induzir a expressão proteica com IPTG 0,75 milimolar por quatro horas. Observar que as condições ótimas de indução podem variar de uma proteína para outra.Recupere as células por centrifugação durante 30 minutos a 6.000 G e quatro graus. Após a purificação das subunidades proteicas, elas são montadas in vitro. Concentre a proteína até cerca de um milimolar em uma unidade de filtro centrífugo.Para tanto, introduza a amostra na unidade de filtração e centrifugue a 4.000 G por 30 minutos. Entre os passos de centrifugação, misture suavemente a solução na unidade de filtração com uma pipeta para evitar a deposição de proteínas na membrana do filtro. Repita o procedimento até que a concentração desejada seja atingida.Transfira a amostra para um tubo cônico e incube sob agitação por uma semana à temperatura ambiente. Geralmente, a polimerização das subunidades em filamentos é acompanhada pelo turvamento da solução. Adicione azida de sódio a 0,02% peso por volume para evitar contaminação bacteriana.Para colher o conjunto proteico, centrifugue a amostra por uma hora a 20.000 G e quatro graus. Aspire a maior parte do sobrenatante, deixando apenas líquido suficiente para cobrir a superfície, evitando a secagem da amostra, e armazene a amostra a quatro graus até a medição. Apresentaremos os experimentos essenciais para uma análise estrutural por RMN em estado sólido.Experimentos unidimensionais de polarização cruzada, ou CP, e de inept detectados em núcleos de C13 são utilizados para detectar segmentos proteicos rígidos e flexíveis na montagem, respectivamente, e para estimar o grau de homogeneidade estrutural e polimorfismo local. Aqui, utilizamos valores experimentais padrão.As faixas típicas de parâmetros são indicadas no protocolo. Insira o rotor no ímã de RMN e inicie a rotação no ângulo mágico conforme descrito no protocolo. Ajuste a frequência de rotação desejada e garanta a estabilização dentro de mais ou menos 10 hertz.Registre um único espectro pulsado de próton unidimensional utilizando 16 varreduras. Configure um experimento CP de próton carbono 1D. Os experimentos CP mostram os sinais provenientes de resíduos em uma conformação rígida. Os parâmetros iniciais do experimento são obtidos a partir de um procedimento padrão de otimização em um composto de referência.A calibragem do pulso e os parâmetros de desacoplamento podem ser otimizados na amostra quando a sensibilidade for suficientemente alta. Aqui, registramos um CP com 16 varreduras. O tempo de contato CP e os níveis de potência são escolhidos com base na intensidade máxima do sinal, conforme demonstrado aqui para a otimização do tempo de contato CP.A intensidade máxima neste exemplo é atingida em 800 milissegundos. Os parâmetros de desacoplamento também devem ser reajustados em relação aos inicialmente definidos para a calibração do composto de referência. Por fim, observe cuidadosamente a localização das bandas laterais de rotação na frequência de rotação no ângulo mágico fornecida, mostrada aqui em 18 quilohertz, para evitar sobreposição com o sinal.Registre um espectro de referência de carbono-1D com polarização cruzada de prótons que sirva como uma impressão digital espectral unidimensional. Aqui, acumulamos 128 varreduras com tempo de contato de polarização cruzada de 800 milissegundos, intensidade de desacoplamento de 100 quilohertz, atraso de reciclagem de três segundos e tempo de aquisição de 20 milissegundos. Processe o experimento de polarização cruzada sem apodização.Escolha um pico isolado para estimar o C39 dentro da amostra, indicativo de ordem estrutural e homogeneidade. Aqui, a largura da linha, medida como a largura total na metade da altura, é de cerca de 60 a 70 hertz, indicativa de uma estrutura proteica bem ordenada no conjunto. Configure um experimento unidimensional de inept de próton-carbono para investigar as partes altamente móveis do conjunto proteico.Registre um experimento inept de referência para servir como impressão digital dos segmentos proteicos móveis. Os parâmetros típicos são 128 varreduras e um tempo de aquisição de 25 milissegundos. Processe o experimento proton carbon inept.O número de sinais e suas posições indicam, respectivamente, o grau de mobilidade dos resíduos e a composição dos aminoácidos. Aqui, apenas o sinal proveniente do grupo CH2 do tampão twist merit-y é observado, já que toda a proteína encontra-se em um regime rígido na estrutura do agregado. A análise conformacional da estrutura da proteína baseia-se nas atribuições de ressonância de RMN no estado sólido para todos os resíduos rígidos do agregado.Isso é possível porque os deslocamentos químicos são sondas altamente sensíveis ao ambiente químico local e podem ser usados para prever a estrutura secundária da proteína. A determinação completa da estrutura tridimensional é então baseada na coleta de dados estruturais, como restrições de distância que codificam proximidades atômicas intra e intermoleculares até nove angstrom. Aqui, mostraremos como os experimentos básicos bidimensionais são registrados e daremos um exemplo de uma atribuição sequencial.Em seguida, daremos uma breve demonstração sobre como coletar restrições de distância a partir de experimentos registrados em amostras marcadas seletivamente com C13. Configure o experimento bidimensional PDSD de curto tempo de mistura entre carbonos para detectar correlação entre carbonos da mesma resíduo. Copie os valores do passo inicial de polarização cruzada próton-carbono do experimento CP unidimensional.A mistura pode ser ajustada em 50 milissegundos para amostras uniformemente marcadas com C13. Aqui, escolhemos um tempo de aquisição de 15 e 20 milissegundos nas dimensões indireta e direta, respectivamente. Para processar o espectro PDSD, utilizamos uma função de janela QSINE com deslocamento de sino senoidal de 3,5.Para permitir a atribuição específica de resíduos, utilize as configurações do PDSD de curto tempo de mistura para registrar um PDSD de tempo de mistura intermediário com um tempo de 100 a 200 milissegundos. Observe que espectros adicionais, incluindo experimentos detectados por nitrogênio, são frequentemente necessários para uma atribuição completa de ressonâncias, e são detalhados no protocolo. Escolha um programa de análise de RMN, como o CCPNMR Analysis.Carregue os espectros 2D no software e crie um objeto molecular com a sequência primária da proteína. Comece com a identificação dos tipos de aminoácidos que são visíveis no espectro PDSD de curto tempo de mistura. A conexão dos átomos de carbono dos sistemas de spin permite a atribuição específica por tipo de resíduo.Aqui, atribuímos o sistema de spin de um resíduo de thenium. As transferências de polarização entre os núcleos C-alfa, C-beta e C-gama geram picos cruzados físicos no espectro PDSD. Tente identificar o maior número possível de resíduos com este procedimento.Sobreponha o espectro PDSD de tempo de mistura curto e intermediário. Os picos suplementares visíveis no espectro PDSD de tempo de mistura intermediário geralmente surgem de contatos entre resíduos sequenciais. Marque os picos de ressonância de um sistema de spins e identifique correlações no espectro PDSD de tempo de mistura intermediário com as frequências de ressonância de outros sistemas de spins.Mostramos a atribuição sequencial com o thenium 33 ao isolutano 32 em nosso arranjo de proteína filamentosa. As frequências de ressonância do sistema de spin do thenium são visíveis em uma frequência de carbono dos isolutas em 32, e vice-versa. Os procedimentos para atribuição com espectros detectados por nitrogênio e para obtenção da estrutura secundária da proteína a partir das atribuições são descritos no protocolo.Após a completa atribuição de ressonâncias, podemos prosseguir com a identificação de restrições de longo alcance. Restrições de longo alcance são proximidades entre carbonos intra ou intermoleculares entre resíduos distantes, que definem tanto a estrutura terciária das subunidades monoméricas quanto o arranjo das subunidades dentro do conjunto. Aqui, amostras com marcação seletiva de C13 são de particular importância.Sobreponha um PDSD com tempo intermediário de mistura a um PDSD de carbono-carbono com tempo longo de mistura, registrado com um tempo de mistura entre 400 milissegundos e um segundo, em uma amostra seletivamente marcada com C13. Sempre que possível, ambos os PDSD devem ter sido registrados na mesma amostra seletivamente marcada. Picos suplementares surgem a partir de correlações entre átomos de C13 mais distantes.Durante a atribuição de ressonância, leve em consideração o esquema de marcação seletiva. Neste caso, glicerol 1-3. Aqui, destacamos um exemplo de um pico de contato de longo alcance com atribuição inequívoca em ambas as dimensões.Thenium 33 C-beta com proteína 45 C-alfa. Após concluir a identificação de distâncias de longo alcance, as restrições são classificadas como não ambíguas ou ambíguas, bem como intramoleculares ou intermoleculares. As listas de restrições a serem preparadas para a modelagem estrutural estão listadas no protocolo.Tutoriais sobre modelagem estrutural utilizando diferentes programas podem ser encontrados online. Dados de RMN em estado sólido, isoladamente ou em conjunto com dados complementares, podem permitir a determinação da estrutura em nível atômico de agregados supramoleculares. As vantagens da RMN em estado sólido são, por um lado, a capacidade de fornecer informações sobre a estrutura secundária e restrições de distância atômica provenientes de interfaces intramoleculares, que podem ser integradas ao processo de modelagem.No entanto, por outro lado, a característica única da espectroscopia de RMN em estado sólido reside na sua capacidade de coletar restrições de distância atômica nas interfaces intermoleculares de montagens supramoleculares intactas. A detecção e distinção entre atribuições de restrições intra e intermoleculares pode, contudo, ser um processo tedioso e normalmente exige a preparação de amostras seletivamente marcadas com C13. Contudo, com os novos avanços nas estratégias de marcação seletiva, no design de hardware dos espectrômetros e nas metodologias de RMN em estado sólido, a técnica está cada vez mais alcançando seu potencial teórico de fornecer informações moleculares em nível atômico sem limitações de tamanho do objeto, ordem de longo alcance ou cristalinidade.Este método permite-nos estudar a estrutura atômica de montagens biomoleculares. É muito importante preparar cuidadosamente a amostra para otimizar as condições de RMN e obter dados de alta resolução. Com este protocolo, podemos obter resoluções atômicas, que fornecem informações sobre montagens proteicas.E esta técnica pode ser combinada com outras técnicas em biologia estrutural para obter modelos tridimensionais.

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JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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