Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

O objetivo geral deste protocolo é estudar as estruturas de conjuntos de proteínas supermoleculares insolúveis e não cristalinas em resolução atômica por espectroscopia de RMN de estado sólido de fiação de ângulo mágico. Apresentaremos os passos metodológicos essenciais para o estudo de estruturas atômicas de conjuntos de proteínas biomoleculares por RMN no estado sólido. Estudar as estruturas atômicas desses conjuntos é extremamente desafiador porque eles são inerentemente insolúveis e não cristalinos.

A RMN no estado sólido é uma técnica emergente capaz de estudar a estrutura e a dinâmica molecular na resolução atômica sem ser limitada pelo tamanho do objeto montado ou por sua solubilidade. Ilustramos aqui as principais etapas para visualizar estruturas atômicas de conjuntos de proteínas biomoleculares por RMN de estado vendido, incluindo a preparação de amostras marcadas isotopicamente, a coleta e a análise de dados estruturais de RMN de estado sólido. A primeira etapa em um fluxo de trabalho de RMN de estado sólido é a produção de subunidades de proteínas marcadas com C13 N15 e sua montagem in vitro.

Inocular uma pré-cultura de 15 mil de meio LB pré-aquecido com uma colônia de células E.coli transformadas. Incube a 37 graus Celsius com agitação de 200 RPM durante a noite. Para inocular a cultura principal, transfira toda a pré-cultura para um litro de meio N9 pré-aquecido contendo as fontes de carbono e nitrogênio marcadas isotopicamente necessárias.

Estes podem incluir, cloreto de amônio marcado com N15, glicose marcada uniformemente com C13, glicose marcada seletivamente com C13 ou glicerol marcado seletivamente com C13 Incubar a 37 graus e medir a densidade óptica em 600 nanômetros assim que a cultura se tornar turva. Quando a DO atingir um valor de 0,8, induza a expressão da proteína com um IPTG minimolar de 0,75 por quatro horas. Observe que as condições ideais de indução podem variar de uma proteína para outra.

Recuperar as células por centrifugação durante 30 minutos a 6 000 G e a quatro graus. Após a purificação das subunidades proteicas, elas são montadas in vitro. Concentre a proteína em cerca de um mini molar em uma unidade de filtro centrífugo.

Para isso, introduzir a amostra na unidade filtrante e centrifugar a 4 000 g durante 30 minutos. Entre as etapas de centrifugação, misture suavemente a solução na unidade de filtro com uma pipeta para evitar a deposição de proteínas na membrana do filtro. Repita o procedimento até atingir a concentração desejada.

Transfira a amostra para um tubo de falcão e incube sob agitação por uma semana em temperatura ambiente. Normalmente, a polimerização das subunidades em filamentos é acompanhada pela solução tornando-se turva. Adicione 0,02% de peso por volume de azida de sódio para evitar contaminação bacteriana.

Para colher o conjunto de proteínas, centrifugue a amostra por uma hora a 20.000 G e quatro graus. Aspire a maior parte do sobrenadante deixando apenas líquido suficiente para cobrir a superfície para evitar a secagem da amostra e armazene a amostra a quatro graus até a medição. Apresentaremos os experimentos essenciais para uma análise estrutural por RMN no estado sólido.

A polarização cruzada unidimensional, ou CP, e experimentos ineptos detectados em núcleos C13 são usados para detectar segmentos de proteínas rígidas e flexíveis na montagem, respectivamente. E estimar o grau de homogeneidade estrutural e polimorfismo local. Aqui, usamos valores experimentais padrão.

Faixas de parâmetros típicas são indicadas no protocolo. Insira a rota no ímã de RMN e inicie o ângulo mágico girando conforme descrito no protocolo. Defina a frequência de rotação desejada e garanta a estabilização para mais ou menos 10 hertz.

Registre um único espectro de prótons pulsado e unidimensional usando 16 varreduras. Configure um CP de carbono de prótons 1D. Experimentos de CP mostram os sinais que surgem de resíduos em uma conformação rígida. Os parâmetros iniciais do experimento são obtidos a partir de um procedimento de otimização padrão em um composto de referência.

Os parâmetros de calibração e desacoplamento de pulso podem ser otimizados na amostra quando a sensibilidade é alta o suficiente. Aqui, registramos um CP com 16 varreduras. O tempo de contato CP e os níveis de potência são escolhidos com base na intensidade máxima do sinal, conforme demonstrado aqui para a otimização do tempo de contato CP.

A intensidade máxima neste exemplo é atingida em 800 milissegundos. Os parâmetros de desacoplamento também devem ser reajustados daqueles originalmente definidos na calibração do composto de referência. Por fim, observe cuidadosamente a localização das bandas laterais giratórias na frequência de rotação do ângulo mágico dada, mostrada aqui em 18 kilohertz, para evitar sobreposição com o sinal.

Registre um espectro CP de carbono de prótons 1D de referência que serve como uma impressão digital espectral unidimensional. Aqui, acumulamos 128 varreduras com tempo de contato CP de 800 milissegundos, força de desacoplamento de 100 kilohertz, atraso de reciclagem de três segundos e tempo de aquisição de 20 milissegundos. Processar o experimento de PC sem apatização.

Escolha um pico isolado para estimar o C39 dentro da amostra, indicativo de ordem estrutural e homogeneidade. Aqui, a largura da linha, medida como a largura total a meia altura, é de cerca de 60 a 70 hertz, indicativo de uma estrutura de proteína bem ordenada na montagem. Configure um experimento unidimensional de carbono de prótons inepto para sondar partes altamente móveis do conjunto de proteínas.

Registre um experimento inepto de referência para servir como impressão digital para os segmentos de proteína móveis. Os parâmetros típicos são 128 varreduras e um tempo de aquisição de 25 milissegundos. Processe o experimento inepto de carbono de prótons.

O número de sinais e suas posições são indicativos da extensão da mobilidade do resíduo e da composição de aminoácidos, respectivamente. Aqui, apenas o sinal do tampão de torção CH2 merit-y é observado, pois toda a proteína está em um regime rígido na estrutura de montagem. A análise conformacional da estrutura da proteína é baseada nas atribuições de ressonância de RMN de estado sólido para todos os resíduos rígidos do conjunto.

Isso é possível porque as mudanças químicas são sondas altamente sensíveis para o ambiente químico local e podem ser usadas para prever a estrutura secundária da proteína. Uma determinação completa da estrutura 3D é então baseada na coleta de dados estruturais, como restrições de distância que codificam proximidades de átomos intra e intermoleculares de até nove angstrom. Aqui, mostraremos como os experimentos bidimensionais básicos são registrados e daremos um exemplo de uma atribuição sequencial.

Em seguida, daremos uma breve demonstração sobre como coletar restrições de distância de experimentos registrados em amostras marcadas seletivamente com C13. Configure o experimento PDSD de carbono de carbono bidimensional de curto tempo de mistura para detectar a correlação de carbono de carbono intra-resíduo. Copie os valores para a etapa inicial de polarização cruzada de carbono de prótons do experimento CP unidimensional.

A mistura pode ser ajustada para 50 milissegundos para amostras uniformemente marcadas com C13. Aqui, escolhemos o tempo de aquisição de 15 e 20 milissegundos nas dimensões indireta e direta, respectivamente. Para processar o espectro PDSD, usamos uma função de janela QSINE com deslocamento de sino de 3,5.

Para habilitar a atribuição específica de resíduos, use as configurações do PDSD de tempo de mistura curto para registrar um PDSD de tempo de mistura intermediário com um tempo de mistura de 100 a 200 milissegundos. Observe que espectros adicionais, incluindo experimentos detectados por nitrogênio, são frequentemente necessários para uma atribuição completa de ressonância e são detalhados no protocolo. Escolha um programa de análise de RMN, como o CCPNMR Analysis.

Carregue os espectros 2D no software e crie um objeto molecular com a sequência primária da proteína. Comece com a identificação dos tipos de aminoácidos que são visíveis no espectro PDSD de curto tempo de mistura. A conexão dos átomos de carbono dos sistemas de centrifugação permite a atribuição específica do tipo de resíduo.

Aqui, atribuímos o sistema de spin de um resíduo de ténio. As transferências de polarização entre os núcleos C-alfa, C-beta e C-gama levam a picos cruzados físicos no espectro PDSD. Tente identificar o maior número possível de resíduos com este procedimento.

Sobreponha o espectro PDSD de tempo de mistura curto e intermediário. Os picos suplementares visíveis no tempo intermediário de mistura PDSD geralmente surgem do contato entre resíduos sequenciais. Marque os picos de ressonância de um sistema de spin e encontre correlações no tempo intermediário de mistura PDSD com frequências de ressonância de outros sistemas de spin.

Mostramos a atribuição sequencial com o ténio 33 ao isolutano 32 em nossa montagem de proteínas filamentosas. As frequências de ressonância do sistema de spin do ténio são visíveis em uma frequência de carbono dos isolutos em 32 e vice-versa. Os procedimentos para atribuição com espectros detectados de nitrogênio e para obtenção da estrutura secundária da proteína a partir das atribuições são descritos no protocolo.

Após a atribuição completa de ressonância, podemos prosseguir com a identificação de restrições de longo alcance. As restrições de longo alcance são proximidades intra ou intermoleculares de carbono carbono entre resíduos distantes que definem tanto a dobra terciária das subunidades monoméricas quanto o arranjo das subunidades dentro do conjunto. Aqui, amostras marcadas seletivamente com C13 são de particular importância.

Sobreponha um tempo de mistura intermediário PDSD com um longo tempo de mistura de carbono PDSD de carbono registrado com um tempo de mistura entre 400 milissegundos a um segundo em uma amostra marcada seletivamente com C13. Se possível, ambos os PDSD devem ter sido registrados na mesma amostra rotulada seletivamente. Picos suplementares surgem de correlações entre átomos de C13 mais distantes.

Durante a atribuição de ressonância, leve em consideração o esquema de rotulagem seletiva. Neste caso, 1-3-glicerol. Aqui, destacamos um exemplo de um pico de contato de longo alcance e atribuição inequívoca em ambas as dimensões.

Tênio 33 C-beta com proteína 45 C-alfa. Depois de completar a identificação de longa distância, as restrições são classificadas como inequívocas ou ambíguas, bem como intra ou intermoleculares. As listas de restrições a serem preparadas para a modelagem estrutural estão listadas no protocolo.

Tutoriais sobre modelagem estrutural usando diferentes programas podem ser encontrados online. Os dados de RMN de estado sólido, por si só ou em conjunto com dados complementares, podem permitir a determinação da estrutura em nível atômico de conjuntos supermoleculares. As vantagens da RMN em estado sólido são, por um lado, a capacidade de fornecer informações de estrutura secundária e restrições de distância atômica de interfaces intramoleculares, que podem ser integradas ao processo de modelagem.

No entanto, por outro lado, a característica única da espectroscopia de RMN de estado sólido reside em sua capacidade de coletar restrições de distância atômica em interfaces intermoleculares de montagem supermolecular intacta. A detecção e distinção entre atribuições de restrição intra e intermolecular pode, no entanto, ser um processo tedioso e normalmente requer uma preparação de amostras marcadas seletivamente com C13. No entanto, com novos desenvolvimentos em estratégias de rotulagem seletiva, design de hardware de espectrômetro e metodologias de RMN de estado sólido, a técnica está cada vez mais cumprindo seu potencial teórico de fornecer informações moleculares de nível atômico sem limitações de tamanho do objeto, ordem de longo alcance ou cristalinidade.

Este método nos permite estudar a estrutura atômica de conjuntos biomoleculares. É muito importante preparar cuidadosamente a amostra para otimizar a condição de RMN, para obter dados de alta resolução. Com este protocolo, podemos obter resoluções atômicas que são informações de montagens de proteínas.

E essa técnica pode ser combinada com outras técnicas em biologia estrutural para obter modelos tridimensionais.