Uma purificação e ensaio de atividade In Vitro para um ppGpp (p) sintetase de Clostridium difficile

Aqui, descrevemos um método para a purificação de enzimas pyrophosphokinase histidina-tag e utilizando cromatografia em camada fina dos produtos a ensaiar para a atividade enzimática em vitroe substratos marcadas com radioisótopos. O ensaio da atividade da enzima é amplamente aplicável a quinase, ciclase nucleotídeo ou reação de transferência de fósforo, cujo mecanismo inclui a hidrólise de nucleotídeos trifosfato.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre enzimas fosfotransferas, incluindo especificidade de substrato de enzimas e cinética de reação. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a coleta rápida de múltiplos conjuntos de dados que são muito consistentes, permitindo quantificação estatisticamente robusta da atividade enzimápica. A demonstração visual deste método é fundamental porque detectar as reações nas placas de TLC e quantificar as espécies radioativas nas reações é muito mais fácil de demonstrar do que explicar.

Além de Astha, demonstrando o procedimento será Asia Poudel, outra estudante de pós-graduação do meu laboratório. Inicie este protocolo com superexpressão indutível de uma proteína marcada por histidina, conforme descrito no protocolo de texto. Prepare um mililitro de resina de ácido nitriloacético de níquel em uma coluna de gravidade para purificar a proteína.

No dia anterior ao uso, equilibre a coluna durante a noite em quatro graus Celsius com dois mililitros de tampão de equilíbrio. No dia seguinte, leve a coluna de quatro graus Celsius à temperatura ambiente antes de carregar o lysate esclarecido e deixe-a ficar por aproximadamente duas a três horas. Em seguida, resuspense a pelota no tampão de lise.

Sonicar as células no gelo por intervalos de 10 segundos, parando 30 segundos entre pulsos. Esclareça o lise por centrifugação a 3.080 vezes g durante 30 minutos a quatro graus Celsius usando uma microcentrifuagem. Prepare o lise esclarecido com volumes iguais de tampão de lise, em seguida, aplique o lysate preparado, esclarecido na coluna e colete o fluxo-through.

Reaplique o fluxo de lise clarificada para a coluna e colete o fluxo secundário. Em seguida, lave a coluna com cinco mililitros de tampão de lavagem um e colete o fluxo através. Lave a coluna novamente com cinco mililitros de tampão de lavagem dois e colete o fluxo através.

Agora aplique dois mililitros de tampão de elução. Coletar fluxo em duas frações de um mililitro cada. Durante a purificação de proteínas, a inclusão do cloreto de magnésio nos tampões de purificação, uma modificação no protocolo do fabricante, é essencial para a atividade enzimática.

Para avaliar qualitativamente a purificação de proteínas pela SDS-PAGE, execute 20 alíquotas de microliter de todas as frações de coluna em um empilhamento de 4%, 10% executando gel de poliacrilamida por 60 minutos a 170 volts. Manche o gel com 0,1% azul Coomassie à temperatura ambiente por cinco horas, balançando suavemente em um roqueiro de bancada. Em seguida, destain o gel em 40% metanol-10% ácido acético glacial durante a noite à temperatura ambiente, balançando no roqueiro benchtop.

Diálise a fração elucida dois contra o tampão de diálise em uma proporção de 200:1 usando um dispositivo de diálise de um mililitro com um corte de peso molecular de 20 quilodalton durante a noite a quatro graus Celsius. Determine a concentração da amostra de proteína dialisada medindo a absorvância em 280 nanômetros e usando o coeficiente de extinção molar calculado. Armazene alíquotas de 100 microliter da amostra de proteína dialisada a menos 80 graus Celsius até o uso.

Antes de realizar a reação, prepare as placas de cromatografia de camada fina de celulose PEI lavando-as em água deionizada. Coloque as placas em uma câmara de vidro com água duplamente destilada a uma profundidade de aproximadamente 0,5 centímetros. Depois de permitir que a água migrem para o topo da placa, leve as placas para fora da câmara de vidro e deixe em um rack de bancada para secar durante a noite.

Marque as placas secas a dois centímetros de uma borda com um lápis macio para indicar onde as amostras serão aplicadas para TLC. Para amostras de dois microliter, aplique amostras não inferiores a um centímetro de distância. Ao planejar experimentos, deixe sempre um ponto em cada placa não uso para servir como uma faixa em branco para quantificação da amostra.

Para realizar o ensaio de atividade enzimática, prepare reações individuais usando o ATP gama P32, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione o RSH após a mistura dos outros componentes, pois a adição de RSH à mistura contendo nucleotídeos inicia o ensaio de atividade enzimática. Para controlar a hidrólise ATP a partir da atividade nuclease contaminante, monte uma reação de 10 microliter contendo nenhuma proteína e incuba-a em paralelo.

Detectar amostras de dois microliter em T igual a zero e no final do experimento para garantir que a ATP não fosse hidrolisada na ausência de proteína. Imediatamente após a adição de RSH, remova dois microliters e localizá-lo na placa pei-celulose rotulada como a amostra T é igual a zero minuto. Incubar a reação a 37 graus Celsius, removendo alíquotas de dois microliter nos pontos de tempo desejados.

Depois de todas as alíquotas coletadas, realize cromatografia de camada fina preenchendo a câmara de cromatografia com fosfato monobásico de potássio monobásico de 1,5metros a uma profundidade de 0,5 centímetros. Mergulhe a borda inferior da placa em solvente e deixe o solvente migrar para a parte superior da placa ao longo de aproximadamente 90 minutos. Retire a placa do tanque de cromatografia e coloque-a em um rack de secagem no banco para secar durante a noite.

Depois que a placa estiver seca, enrole a placa em filme plástico para evitar a transferência de material radioativo para o de imagem e analise por autoradiografia. Exponha a placa pei-celulose contendo reações separadas a um fosforrimager por quatro horas em temperatura ambiente. Após a exposição, imagem do em um fosforrimager.

Usando um software de imagem com uma interface gráfica de usuário, desenhe regiões de interesse ou ROIs primeiro selecionando Draw a Rectangle, em seguida, use o mouse para desenhar ROIs retangulares em torno de uma pista inteira e os pontos ATP e guanosina-tetrafosfato contidos dentro dessa faixa. Use os comandos Selecionar, Copiar e Colar para desenhar ROIs idênticos nas outras pistas para garantir que os ROIs estejam medindo o sinal em áreas idênticas em cada faixa. Inclua ROIs de uma pista não utilizada para ser usado como espaços em branco.

Usando o Analyze, Tools, ROI Manager, Adicionar comandos do software de imagem, selecione todos os ROIs desenhados na placa PEI-celulose. Agora use os comandos Analisar, Definir Medidas, Medir para quantificar a intensidade do sinal dentro de cada ROI e exportar as medições como um spreadsheeet. Na planilha, subtraia valores de ROI em branco a partir de sinais experimentais.

A conversão dos dados para a porcentagem de guanosina-tetrafosfato sintetizada é fundamental, pois garante que os conjuntos de dados coletados em dias diferentes com diferentes lotes de proteína ou diferentes ATP gama P32 são consistentes e podem ser agrupados para rigor estatístico. Este desenho mostra como regiões de interesse são usadas para definir uma pista que contém o sinal radioativo total em uma amostra e o componente ATP radioativo e regiões de tetrafosfato de guanosina de interesse. Os sinais de tetrafosfato ATP e guanosina são normalizados para o sinal total em vez de relatar os valores absolutos porque o erro de pipetação ou a decomposição do substrato radioativo podem afetar o sinal total na amostra, mas não afetam a atividade enzimápica.

Mostrado aqui é uma placa TLC real de uma reação realizada usando C.difficile RSH purificado. Uma reação de controle que não contém proteína permite quantificação da hidrólise ATP nãocatalisada, enquanto uma faixa em branco permite quantificação precisa do sinal. Nos pontos ATP e guanosina-tetrafosfato, a enzima transfere o fosfato radioativo do substrato ATP para o precursor do PIB, criando tetrafosfato radioativo de guanosina.

Isso confirma que a tetase de tetrafosfato de guanosina putativa de C.difficile é uma enzima ativa. Através da amostragem da reação em intervalos, o progresso pode ser observado. Aqui o sinal bruto é observado em cada ponto de tempo.

ATP está diminuindo e o tetrafosfato de guanosina está aumentando. Mostrado aqui estão os dados normalizados. As barras de erro são muito menores porque a normalização explica qualquer erro de pipetação.

Ao tentar este procedimento, é importante ter cuidado para não arranhar a resina na placa TLC, pois isso pode interferir na migração de solventes. Esta é uma técnica muito acessível com análise de dados simples que pode fornecer rapidamente quantificação robusta da atividade enzimápica. Usamos para confirmar que clostridium difficile sintetiza tetrafosfato de guanosina, que nunca foi relatado anteriormente.

Não se esqueça que trabalhar com radioatividade pode ser extremamente perigoso e você deve seguir as regras da sua instituição para o armazenamento e uso de materiais radioativos durante a realização deste procedimento. Este método pode fornecer insights sobre a síntese de tetrafosfato de guanosina, mas também pode ser aplicado a outras reações de fosfotransfer, incluindo atividade de quinase proteica e síntese de diguanito cíclico.