Produção, cristalização e determinação da estrutura de C. difficile PPEP-1 via microdispersão e Zinco-SAD

O objetivo geral deste procedimento é cultivar com eficiência cristais de qualidade de difração de rede única da proteína recombinante prolina prolina endopeptidase-1, ou rPPEP-1. Sem esse método, o rPPEP-1 produz instantaneamente cristais altamente interligados que não são adequados para análise de difração de raios X. A principal vantagem desta técnica é que um grande número de cristais bem ordenados e bem difrativos para determinação estrutural de rPPEP-1 pode ser produzido em um curto período de tempo e com entrada limitada de material.

Este procedimento faz uso do método da microcidade e pode ser adaptado para todas as condições de cristalização inicial bem-sucedidas do rPPEP-1, bem como seus complexos peptídicos de substrato. Este método pode ser adaptado para produzir cristais bem ordenados de praticamente todas as proteínas que produzem cristais intercalados. Também pode ser usado em experimentos de semeadura cruzada, variação de proteínas ou em experimentos de cocristalização com pequenas moléculas.

A demonstração visual do manuseio dos métodos de cristalização é crucial, uma vez que mesmo pequenas variações podem ter um impacto significativo na qualidade da difração dos cristais. Realize testes de cristalização no formato de gota sentada usando telas padrão disponíveis comercialmente e um robô de cristalização. Primeiro, concentre a proteína purificada a 12 miligramas por mililitro usando um dispositivo de ultrafiltração centrífuga em intervalos de cinco minutos a 4000 vezes g e quatro graus Celsius.

Misture a proteína após cada intervalo para evitar precipitação e agravamento. Determine a concentração de proteína em 280 nanômetros usando o coeficiente de extinção de 25.900 por centímetro molar. Depois de equilibrar a proteína a 20 graus Celsius, limpe todas as partículas e poeira por centrifugação por 10 minutos a 16000 vezes g e 20 graus Celsius.

Para realizar telas de cristal, use placas de cristalização pré-preenchidas seladas e armazenadas a quatro graus Celsius. Ao configurar testes, trabalhe rapidamente, pois os pequenos volumes secam rapidamente. Use também uma câmara de umidade ao redor da doca do robô, se possível.

Depois de equilibrar todas as placas de cristalização a 20 graus Celsius, configure a tela pipetando o reservatório de proteína ent nos subpoços dois a quatro. Use um volume de gota de 300 nanolitros. Use proporções de proteína para reservatório de 200:100 para o subpoço dois, 150:150 para o subpoço três e 100:200 para o subpoço quatro.

Sele imediatamente a placa e coloque-a em uma câmara a 20 graus Celsius. Inspecione as bandejas após a configuração todos os dias durante a primeira semana e, em seguida, siga com a inspeção semanal. Para uma cocristalização dos complexos peptídicos rPPEP-1 do substrato, misture rPPEP-1 a 24 miligramas por mililitro em uma proporção de 1: 1 com um excesso molar de sete vezes de solução peptídica e solubilizada em solução salina tamponada com tris.

Depois de incubar por 30 minutos a 20 graus Celsius, limpe todas as partículas e poeira por centrifugação por 10 minutos a 16000 vezes g e 20 graus Celsius. Prossiga com a cristalização usando o mesmo procedimento de microssemeadura da proteína rPPEP-1 não ligada. Cristais altamente interligados de rPPEP-1 apareceram após dois dias em uma condição contendo 2,4 molares de fosfato de amônio dibásico e 0,1 molar trisapseal pH 8,5.

Para otimizar a condição inicial, use um software para calcular os volumes e o esquema de pipetagem para obter dois mililitros de cada condição que permite 10 telas de otimização. As condições incluem fosfato de amônio dibásico de 1,8 a 2,55 molares em etapas de 0,15 molar, bem como trisapseal molar de 0,1 molar pH 7,5 a 9,0 em etapas de 0,5 unidades de pH. Prepare uma tela de grade composta por 24 condições de soluções de estoque.

Use o esquema de pipetagem para compor as condições individuais. Pipete 200 microlitros de cada solução de tela de grade nos poços de uma placa de 24 poços e equilibre a placa a 20 graus Celsius. Configure manualmente a placa de cristalização.

Use um volume de gota de três microlitros e uma proporção de proteína para reservatório de 2:1, 1,5:1:5 e 1:2. Aqui, use uma pipeta de deslocamento positivo para evitar a formação de bolhas de ar. Feche imediatamente a placa.

Em seguida, coloque o prato em uma câmara a 20 graus Celsius. Após um a quatro dias, cristais altamente interligados de rPPEP-1 aparecem nas quatro condições contendo 2,55 molares de fosfato de amônio dibásico e 0,1 molar trisapseal pH 7,5 a 9,0, enquanto nenhum cristal é formado nas 20 condições restantes. Realize o procedimento de microssemeadura para obter cristais únicos de rPPEP-1 nessas condições.

Para preparar um estoque de microsementes, primeiro escolha um único cristal intercalado de uma das condições bem-sucedidas. Em seguida, transfira 50 microlitros do respectivo licor-mãe para um tubo de 1,5 mililitro contendo uma pequena conta de vidro altamente polida e um microlitro do licor-mãe para a lâmina da tampa de vidro. Usando um lubrificante de nylon montado, pesque o cristal e transfira-o para a gota na corrediça da tampa de vidro.

Em seguida, transfira o líquido contendo o cristal para o tubo e votice em alta velocidade por 30 segundos, certificando-se de que a conta de vidro esteja girando. Faça uma diluição de 1:1000 do estoque de sementes em um novo tubo de 1,5 mililitro contendo a mesma condição recém-preparada e vortex completamente por cinco segundos. Em seguida, remova a vedação da placa que cobre as 20 condições com gotas transparentes.

Pipete 0,5 microlitros do estoque de sementes para os poços. Sele a placa e coloque-a em uma câmara a 20 graus Celsius. Após a aplicação desta técnica de microssemeadura, cristais únicos de alta qualidade de difração aparecem várias horas a vários dias após a configuração em várias condições, contendo fosfato de amônio molar de 1,8 a 2,4 e tris molar de 0,1 pH 7,5 a nove.

Os cristais crescem até um tamanho de 100 a 200 mícrons na maior dimensão. Escolha o tamanho ideal do laço de náilon para o comprimento máximo dos cristais escolhidos, colocando o laço na fita de vedação logo acima do cristal e focando para cima e para baixo. O acesso mais longo típico dos cristais rPPEP-1 é de cerca de 100 a 200 mícrons.

Prepare também a criocondição apropriada. Encha os orvalhadores de espuma com nitrogênio líquido. Em seguida, carregue o frasco com um frasco e pré-resfrie-o no orvalho de espuma de 800 mililitros cheio de nitrogênio líquido.

Coloque um suporte de criocana marcado com um identificador adequado e uma manga criogênica no orvalho de espuma de dois litros cheio de nitrogênio líquido. Em seguida, carregue a varinha magnética com o laço de nylon montado do tamanho certo. Em seguida, abra a fita de vedação na placa de cristalização com um bisturi afiado e remova-a com uma pinça.

Pipetar um microlitro da criocondição na lâmina de cobertura. É particularmente importante trabalhar rápido nesta etapa, pois secar o cristal ou o pequeno volume de criosolução no circuito pode levar a flutuações na qualidade do cristal ou até mesmo a uma perda completa de difração. Todas as etapas de manipulação de cristais devem ser realizadas sob o microscópio estéreo.

Se o cristal grudar na superfície do plástico, separe-o do solo deformando o plástico ao redor com uma agulha de acupuntura. Remova o cristal da gota pescando-o com o laço de náilon montado. Transfira rapidamente o cristal para a gota de criocondição e deixe-o equilibrar por um segundo.

Em seguida, pesque o cristal da gota com o laço de náilon montado o mais rápido possível. Mergulhe imediatamente o cristal recuperado em nitrogênio líquido. Quando o nitrogênio líquido ao redor do loop montado parar de ferver, coloque o loop no frasco.

Coloque o frasco para injetáveis no suporte do criocano. Assim que o suporte estiver carregado com seis frascos, coloque uma manga criogênica ao redor do suporte. Armazene os cristais em um tanque cheio de nitrogênio líquido até o uso.

Para realizar a coleta de dados, recupere cuidadosamente o cristal montado da criocana usando uma pinça e armazene-o em um orvalho de espuma para transporte. Mova o batente do feixe e o detector para a posição de estacionamento e mova o bico criogênico para cima em alguns milímetros. Monte a base da tampa criogênica na cabeça do goniômetro, mantendo a base com os dedos enquanto remove rapidamente o frasco.

Em seguida, mova o bico criogênico e o batente do feixe de volta para o lugar e centralize o cristal. Em todos os momentos, tome cuidado para não tocar no batente do feixe ou no detector. Prossiga para coletar o conjunto de dados de 180 graus com um ângulo de oscilação de 0,1 graus, conforme mostrado aqui.

Aqui são mostrados cristais de rPPEP-1 altamente intercalados obtidos da triagem inicial usando telas de cristalização comerciais em 1,4 citrato de sódio tribásico di-hidratado, 0,1 molar HEPES sódico, pH 7,5. Aqui são mostrados cristais obtidos da triagem inicial com 60% de volume a volume tacsimato, pH 7,0, 0,1 molar BIS-TRIS propano, pH 7,0. Os cristais também apareceram em fosfato de amônio dibásico de 2,4 molares, tris de 0,1 molar, pH 8,5.

Após a aplicação do procedimento de otimização de microssemeadura, os cristais únicos foram contidos em várias condições, incluindo fosfato de amônio dibásico de 2,1 molar, tris 0,1 molar, pH 8 e fosfato de amônio dibásico de 2,25 molares, tris molar, pH 8. Os cristais montados em laços de náilon têm de 100 a 200 mícrons de tamanho e parecem ter uma única rede de inspeção microscópica. A análise de difração de raios-X mostra que esses cristais realmente exibem uma única rede e difratam raios-x para uma resolução quase atômica.

Resolver a estrutura cristalina do complexo peptídico de substrato PPEP-1 recombinante fornece informações sobre o modo de ligação ao substrato de PPEP-1. O peptídeo do substrato pode se difundir no grupo de ligação ao substrato do PPEP-1 em sua confirmação aberta. Então, à medida que o fechamento do loop ocorreria, o substrato interage com o PPEP-1 por meio de ligações de hidrogênio e da rede de cadeia lateral alifática-aromática exclusiva localizada no S-loop.

O substrato se liga em uma conformação dupla dobrada única com dobras na ligação peptídica chiada e na ligação peptídica primária P2 para P3. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir cristais de difração de rede única de PPEP-1 recombinante para estudos estruturais. Abordagens semelhantes podem ser usadas com outras proteínas, produzindo cristais altamente interligados e temperatura de incubação e diluição de estoque C ainda mais variadas.

Devido à sua versatilidade e uso simples, esta técnica simples deve ser experimentada em todos os processos de otimização de cristais.