Name: Produção, cristalização e determinação da estrutura de C. difficile PPEP-1 via microdispersão e Zinco-SAD (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Aprenda a produzir cristais de alta qualidade de PPEP-1 de Clostridium difficile usando microsemeadura para determinação estrutural por difração de raios X. Este método supera cristais intercrescidos.

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Agradecemos a equipe do X06DA beamline na Fonte de Luz suíço, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Suíça para a sustentação durante a coleta de dados síncrotron. Somos gratos a Monika Gompert para excelente suporte técnico. O projecto foi apoiado pela Universidade de Colónia e conceder INST 216 / 682-1 fugg do Conselho de Investigação alemã. A bolsa de doutoramento da Escola de Pós-Graduação Internacional em Saúde Desenvolvimento e Doença de CP é reconhecido. A investigação conducente a estes resultados foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7 / 2007-2013) ao abrigo do contrato de concessão No. 283570 (BioStruct-X).

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Os autores não têm nada a divulgar.

Cristalografia de raios-X ainda é o método mais rápido e mais preciso para determinar tridimensionais estruturas de resolução de quase-atómicas de proteínas 28. No entanto, isso exige o crescimento dos cristais individuais bem ordenadas. Estes são muitas vezes difíceis de obter e estado cristalino é artificial. No entanto, uma comparação de estruturas de proteína determinada por cristalografia de raios-X com os determinados por outros métodos, especialmente RMN, mostra geralmente uma boa concordância. No caso...

Clostridium difficile é uma das principais causas de infecções diarreia associada a antibióticos nosocomiais 1. Esta bactéria anaeróbia Gram-positiva são transmitidos através da sua forma de esporos através da via fecal-oral. Na década passada, o novo &#39;&#39; epidemia &#39;&#39; ou &#39;&#39; hipervirulento &#39;&#39; estirpes (por exemplo BI / NAP1 / 027) causou um aumento drástico em novas infecções e taxas de mortalidade na América do Norte e na Europa 2. C. doença -associated difficile (CDAD) é uma ameaça à vida inflamação do cólon com altas taxas de mortalidade 3. Os sintomas variam de 4 a diarreia colite pseudomembranosa 5 e o megacólon tóxico, muitas vezes fatal 6. Tratamento de CDAD é difícil, pois as estirpes virulentas são multi-resistente ea taxa de recorrência é alta 7. No momento em terapia inclui a antibióticos metronidazol, vancomicina ou fidaxomicina, ou em repetiticasos recorrentes vely transplante de microbiota fecal. Novas estratégias terapêuticas são urgentemente necessários 8. Algum progresso está registada como a terapêutica anticorpo monoclonal Bezlotoxumab, visando C. difficile Toxina B 9, foi recentemente passou com êxito ensaios clínicos fase III e foi apresentado para aprovação com a FDA e EMA. Adicionalmente, novos antibióticos estão a ser testado no momento em diferentes fases de ensaios clínicos 10. Para desenvolver um tratamento eficaz novos alvos terapêuticos devem ser identificados. O recém-descoberto C. difficile protease endopeptidase-1 prolina-prolina (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) é um alvo tão promissor, como a falta de PPEP-1 em uma cepa knock-out diminui virulência de C . difficile in vivo 11. PPEP-1 é uma metaloprotease segregada 12,13 clivagem dois adesinas de C. difficile no seu terminal C 13, libertando assim o bacter aderenteIA a partir do epitélio do intestino humano. Portanto, está envolvido na manutenção do equilíbrio entre o fenótipo séssil e móveis de C. difficile. Para desenvolver inibidores selectivos contra PPEP-1 e para entender como ele reconhece seus substratos conhecimento íntimo de sua estrutura tridimensional é indispensável. Nós resolvemos a primeira estrutura cristalina de PPEP-1 sozinho e em complexo com um péptido substrato 14. PPEP-1 é a protease primeiro conhecido que cliva selectivamente ligações peptídicas entre os dois resíduos de prolina 15. Liga-se o substrato de um modo duplamente dobrada e estabiliza através de uma rede alifático-aromático prolongado de resíduos localizados no S-ciclo que abrange o local de protease activa 14. Este modo de ligação de substrato é exclusivo para PPEP-1 e não foi encontrado na proteases humanos até à data. Isto o torna um alvo terapêutico promissor, e fora do alvo efeitos de inibidores muito improvável. Para desenvolver e tela seletiva PPEP-1 habibitors no futuro, é necessária uma grande quantidade de proteína pura e monodispersas PPEP-1. Além disso, para determinar o modo de ligação dos primeiros inibidores, as estruturas de co-cristal com PPEP-1 terão de ser determinados. Em nossas mãos PPEP-1 produz constantemente cristais solidamente incorpora-. Assim, desenvolvemos um procedimento de optimização para produzir cristais de difracção de qualidade individuais de PPEP-1. Neste protocolo, descrever em detalhes a solução de produção, purificação, cristalização e estrutura da PPEP-1 14. Utilizamos a expressão intracelular em Escherichia coli de uma variante PPEP-1 sem a sequência de sinal de secreção, cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho, com a remoção do marcador de purificação, seguido por microdispersão 16 para uma tela de optimização e a determinação da estrutura por meio de zinco-comprimento de onda único de dispersão anómala (zinco-SAD) 17. Este protocolo pode ser adaptado para a produção e a estrutura determinação de outras proteínas (por exemplo, &lt;/ Em&gt; metaloproteases) e, em particular, para as proteínas produtoras de cristais solidamente incorpora-. No pedido, DNA plasmídeo da construção (pET28a-NHis-rPPEP-1) e dados de difração pode ser fornecida para finalidades educacionais.

<table><tbody><tr><td>Genes / Vetores / cepas celulares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a vetor</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Trombina clivável N-terminal His-tag</td></tr><tr><td>E. coli cepa BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td>RNase H deficiente</td></tr><tr><td>Gene otimizado para códon (para E. coli) de PPEP-1 (CD630_28300)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td><td></td> <td>aminoácidos personalizados 27-220</td></tr> <tr><td>< forte > Nome< / forte ></td> <td>forte <> Empresa < / forte ></td> <td>< forte > Número de catálogo< / forte ></td> <td>< forte > Comentários< / forte ></td></tr> <tr><td>< forte > produtos químicos < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>extrato de levedura</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>triptona</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiespumante B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>emulsão aquosa</td></tr><tr><td>de silicone Ágar</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>canamicina</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>Grau tampão</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>qualquer</td><td></td><td>grau tampão</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>Grau tampão</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de amônio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol 100%</td> <td>qualquer</td><td></td><td>grau mais puro</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Líquido nitrogênio</td><td>qualquer</td><td></td><td>para armazenamento e crioresfriamento de cristais</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento (geral)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitando incubadora</td><td></td><td></td><td>qualquer que forneça temperaturas de 20 &deg; C - 37 &graus; C</td></tr><tr><td>Vidraria</td><td>qualquer</td><td></td><td>frasco Erlenmeyer defletor (50 ml - 2,8 L)</td></tr><tr><td>Centrífuga para grandes volumes de cultura</td><td>qualquer</td><td></td><td>centrífuga para processamento de volumes até 12 L</td></tr><tr><td>Sonicator Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>ou qualquer outro sonicador / disruptor de células</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>qualquer</td><td></td><td>centrífuga que forneça velocidades de até 150.000 x g</td></tr><tr><td>Resina NiNTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vidro Vazio Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>ou qualquer outra coluna vazia de vidro ou plástico</td></tr><tr><td>Coluna de cromatografia de exclusão de tamanho HiLoad Superdex 200 16/600</td> Sistema de cromatografia <td>28989335</td><td></td><td>da GE</td></tr><tr><td>Healthcare &Auml; Purificador KTA</td>, <td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>ou qualquer outro sistema de cromatografia</td></tr><tr><td>, Tubo de diálise Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Fechamentos de tubos de diálise</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de ultrafiltração (concentradores) 10.000 NWCO</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>espectrofotômetro UV-Vis</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento (cristalografia)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de baixo volume 0,1-10 &micro; l</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipeta de deslocamento positivo Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>Robô de cristalização</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de cristalização de 96 poços TTP IQ com três poços de proteína</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>ou qualquer outra placa de cristalização de 96 poços&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa CombiClover Junior de 24 poços</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Fita de vedação cristalina</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de cobertura de vidro siliconizado</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>Telas de cristalização comercial: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>diversas</td><td></td></tr><tr><td>telas de cristalização comercial: Wizard, PACT++, JCSG++</td><td>Jena Bioscience</td><td>diversos</td><td></td></tr><tr><td>JBS Beads-for-Seeds</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (loops de nylon)</td><td>Hampton Research</td><td>diversos</td><td>tamanhos de loop 0,025 mm - 0,5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap Vial</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Espuma criogênica Dewar 800 ml</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Espuma criogênica Dewar 2 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>Braçadeira de frasco, Reta</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>CrystalWand Magnética, Reta</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 Suporte de frasco</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane Codificador de cores - White</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropinça reta</td><td>qualquer</td><td></td><td>para manipulação de fita de vedação. etc.</td></tr><tr><td>Agulha de acupuntura</td><td>qualquer</td><td></td><td>por exemplo de uma farmácia</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>qualquer</td><td></td><td>para inspeção de placas de cristalização e montagem de cristal, ampliação de até 160X</td></tr></tbody></table>

produção, cristalização e determinação da estrutura de<em&gt; c. difficile</em&gt; ppep-1 via microdispersão e zinco-sad

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Novas terapias são necessárias para tratar infecções por Clostridium difficile que são uma grande ameaça à saúde humana. A metaloprotease PPEP-1 de C. difficile é um alvo para o desenvolvimento futuro de inibidores para diminuir a virulência do patógeno. Para realizar a caracterização biofísica e estrutural, bem como a triagem de inibidores, serão necessárias grandes quantidades de proteína pura e ativa. Desenvolvemos um protocolo para produção e purificação eficiente de PPEP-1 pelo uso de E. coli como hospedeiro de expressão, produzindo quantidades suficientes e pureza de proteína para cristalização e determinação da estrutura. Além disso, usando microssemeadura, cristais altamente interligados de PPEP-1 podem ser cultivados em cristais bem ordenados adequados para análise de difração de raios-X. Os métodos também podem ser usados para produzir outras proteínas recombinantes e estudar as estruturas de outras proteínas que produzem cristais intercalados.

rPPEP-1 é sobre-expressa em várias estirpes de E. coli, com o rendimento mais elevado em E. coli BL21 (DE3) Star (Figura 1C). Após o primeiro passo de cromatografia de afinidade NiNTA a 6xHis-tag pode ser clivado com sucesso fora da maior parte da proteína e no segundo passo NiNTA proteína não digerida pode ser completamente separada da proteína digerida com trombina (Figura 1D). Em um S200 16/600 coluna rPPEP-1 não marcado migra como m...

A prolina-prolina endopeptidase-1 (PPEP-1) é uma metaloprotease secretada e um alvo promissor do patógeno humano Clostridium difficile. Aqui descrevemos todos os métodos necessários para a produção e determinação da estrutura desta proteína.

Produção, cristalização e determinação da estrutura de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via microdispersão e Zinco-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar com eficiência cristais de qualidade de difração de rede única da proteína recombinante prolina prolina endopeptidase-1, ou rPPEP-1. Sem esse método, o rPPEP-1 produz instantaneamente cristais altamente interligados que não são adequados para análise de difração de raios X. A principal vantagem desta técnica é que um grande número de cristais bem ordenados e bem difrativos para determinação estrutural de rPPEP-1 pode ser produzido em um curto período de tempo e com entrada limitada de material.Este procedimento faz uso do método da microcidade e pode ser adaptado para todas as condições de cristalização inicial bem-sucedidas do rPPEP-1, bem como seus complexos peptídicos de substrato. Este método pode ser adaptado para produzir cristais bem ordenados de praticamente todas as proteínas que produzem cristais intercalados. Também pode ser usado em experimentos de semeadura cruzada, variação de proteínas ou em experimentos de cocristalização com pequenas moléculas.A demonstração visual do manuseio dos métodos de cristalização é crucial, uma vez que mesmo pequenas variações podem ter um impacto significativo na qualidade da difração dos cri

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui é descrito o procedimento implementado no Grupo Biologia Caffrey Membrana Estrutural e Funcional para configurar manualmente ensaios de cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

Concepção de fármacos com base Estrutura desempenha um papel importante no desenvolvimento de medicamentos. Prosseguindo alvos múltiplos em paralelo aumenta a chance de sucesso para a descoberta de chumbo. O seguinte artigo destaca como o Seattle Center Structural Genomics para Doenças Infecciosas utiliza uma abordagem multi-alvo para determinação da influenza A subunidade PB2 gene-to-estrutura.

Abordagem de processamento paralelo multi-alvo para Gene-a-estrutura Determinação da polimerase da gripe PB2 Subunidade

Fonte: Figueroa, D. M., et.al. Produção e visualização de esferoplastos e protoplastos bacterianos para caracterizar a localização de peptídeos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a produção de esferoplastos de Escherichia coli inibindo primeiro a divisão celular para induzir a filamentação, seguida pela digestão enzimática da parede celular. O processo inclui a adição controlada de um agente quelante, DNase, e um estabilizador osmótico para garantir a formação e...

Preparação de E. coli Spheroplasts

Estudos biofísicos e bioquímicos das interações entre os domínios membrana-proteína embutidos enfrentar muitos desafios técnicos, a primeira das quais é a obtenção de material de estudo adequado. Este artigo descreve um protocolo para a produção e purificação de complexos estabilizados por dissulfureto transmembranares peptídicas que são adequadas para análise estrutural por ressonância solução magnética nuclear (RMN) e de outras aplicações analíticas.

Complexos de produção de transmembrana Disulfide-estabilizados Peptídicos para estudos estruturais

β proteínas da membrana externa (OMPs) servem a muitas funções dentro das membranas externas de bactérias Gram-negativas, mitocôndrias e cloroplastos. Aqui, esperamos aliviar um gargalo conhecido em estudos estruturais, apresentando protocolos para a produção de OMPs de β barril em quantidades suficientes para determinação de estrutura por cristalografia de raios-X ou espectroscopia de RMN.

A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

É apresentado um protocolo simplificado para realizar uma extensa Caracterização bioquímica e estrutural de uma proteína de ligação do substrato de hidrato de carbono do Streptococcus pneumoniae .

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Aqui nós apresentamos um protocolo para produzir Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) spheroplasts e Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplastas claramente Visualizar e caracterizar rapidamente interações de peptídeo-bactérias. Isso fornece um método sistemático para definir membrana localizando e se peptídeos.

Produção e visualização de Spheroplasts bacterianas e protoplastas para caracterizar a localização de peptídeo antimicrobiano

Descrevemos protocolos para a determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO por cristalografia de raios-X. Os métodos incluem expressão de proteína, purificação e caracterização, bem como estratégias para otimização de cristal bem-sucedida e determinação da estrutura da proteína em sua forma desvinculada.

Produção, cristalização e determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO

Este protocolo foi desenvolvido para estudar a transição dimer-dodecamer de TmPep1050, uma aminopeptidase M42, no nível estrutural. É um pipeline simples desde a purificação de proteínas até o processamento de dados de raios-X. A cristalogênese, a indexação do conjunto de dados e a substituição molecular foram enfatizadas através de um caso de estudo, a variante TmPep1050H60A H307A.

Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Um dispositivo microfluido versátil é descrito que permite a cristalização de uma enzima usando o método de contra-difusão, a introdução de um substrato nos cristais por imersão, e a determinação da estrutura 3D da enzima:complexo substrato por uma análise serial de cristais dentro do chip à temperatura ambiente.

Cristalização e Determinação Estrutural de uma Enzima:Complexo de Substrato por Cristalografia Serial em um Chip Microfluido Versátil

A determinação da estrutura dos complexos macromoleculares utilizando o crioEM tornou-se rotina para certas classes de proteínas e complexos. Aqui, este pipeline é resumido (preparação de amostras, triagem, aquisição e processamento de dados) e os leitores são direcionados para recursos e variáveis mais detalhados que podem ser alterados no caso de espécimes mais desafiadores.

Microscopia crio-elétron de partículas únicas: da amostra à estrutura

Aprenda a produzir cristais de alta qualidade de PPEP-1 de Clostridium difficile usando microsemeadura para determinação estrutural por difração de raios X. Este método supera cristais intercrescidos.

Produção, cristalização e determinação da estrutura de

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