Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização

O objetivo geral deste procedimento é identificar moléculas pequenas que modulam os níveis intracelulares do segundo mensageiro ciclodiguanilato (c-di-GMP) no patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa por meio de uma triagem de bioindicador de alto rendimento. Este método pode ajudar a descobrir moléculas pequenas que interferem na bioinformação de Pseudomonas aeruginosa e em outras partículas por meio da modulação do c-di-GMP. A principal vantagem desta técnica é sua alta robustez e versatilidade, permitindo a triagem de mais de 3.500 compostos em 48 horas.

As implicações dessa técnica estendem-se ao desenvolvimento de terapias inovadoras que potencialmente sensibilizam a Pseudomonas aeruginosa ao sistema imunológico ou a antibióticos existentes, exercendo menor pressão seletiva sobre as bactérias. Inocule cinco mililitros de caldo lisogênico, ou meio LB, com uma única colônia de P. aeruginosa, a sete graus Celsius, sob agitação a 200 rpm. Em seguida, transfira dois mililitros da cultura de incubação noturna para 200 mililitros de meio LB fresco em um frasco de um litro e incube a 37 graus Celsius sob agitação a 200 rpm.

Monitore a densidade óptica em 600 nanômetros ou OD 600 a cada 30 minutos, coletando uma amostra de 1 mililitro do frasco e analisando com um espectrofotômetro. Quando o OD 600 atingir entre 0,3 e 0,5, transfira 40 mililitros da cultura para um tubo cônico de centrífuga de 50 mililitros. Peliculize as células por centrifugação a 8000 rpm durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Descarte o sobrenatante e ressuspenda as células em 40 mililitros de solução estéril de sacarose 300 milimolar gelada. Após centrifugar as células uma segunda vez, ressuspenda-as em 20 mililitros de solução estéril de sacarose 300 milimolar gelada. Centrifugue as células novamente e ressuspenda-as em 400 microlitros da solução de sacarose 300 milimolar. Resfrie as células em gelo por 30 minutos, após o que estarão prontas para eletroporação.

Em seguida, adicione um microlitro de uma solução de 0,2 microgramas por microlitro do plasmídeo que codifica o promotor CdrA ao gene que codifica a proteína verde fluorescente em 40 microlitros das células eletrocompetentes de P. Aeruginosa previamente preparadas, em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro pré-resfriado em gelo. Misture a suspensão e transfira-a para uma cubeta de eletroporação com entreferro de 2 milímetros previamente resfriada. Remova a umidade da superfície externa da cubeta com papel absorvente e coloque a cubeta na câmara de amostra do eletroporador.

Aplicar um pulso à solução com uma voltagem de 2,5 quilovolts, capacitância de 25 microfarad e uma resistência de 200 ohms. Remover a cubeta e adicionar um mililitro de meio LB. Em seguida, transferir as células para um tubo microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro e incubar por duas horas a 37 graus Celsius com agitação a 200 rpm.

Após a incubação, espalhe alíquotas de 10 microlitros, 50 microlitros e 100 microlitros da cultura em placas de ágar LB estéreis suplementadas com ampicilina e incube as placas a 37 graus Celsius durante a noite. Confirme a expressão de GFP examinando a placa sob um microscópio de fluorescência com canal padrão para GFP. Escolha uma colônia isolada e inócula em cinco mililitros de LB. Após incubação durante a noite, misture 0,5 mililitros da cultura de overnight com 0,5 mililitros de glicerol a 50% em um tubo de rosca de 2 mililitros e armazene a menos 80 graus Celsius.

Dois dias antes do ensaio, plaque a linhagem preparada de P.aeruginosa proveniente do estoque a menos 80 graus Celsius em uma placa de ágar LB, espalhando suavemente as bactérias pela placa com um alça de inoculação estéril. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius. Na véspera do ensaio, inocule uma única colônia de P.aeruginosa da placa em 10 mililitros de meio LB em um tubo.

Incube a pré-cultura durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 200 rpm. No dia do ensaio, prepare uma subcultura a partir da pré-cultura noturna diluindo-a primeiro com meio LB fresco até uma DO 600 de 1,0 e, em seguida, diluindo-a ainda mais com LB 5% até uma DO 600 de 0,4. Adicione uma barra magnética estéril ao recipiente e agite a cultura em velocidade mínima em um agitador magnético por 30 minutos à temperatura ambiente.

Isso permite que as bactérias se aclimatizem ao meio antes de serem distribuídas em placas de 384 poços. Para preparar o controle positivo, adicione 20 microlitros de Sulfato de Tobramicina a 10 mililitros da subcultura preparada e misture suavemente. Pipete 40 microlitros da cultura controle positivo nos poços A23 a P23.

Para preparar o controle negativo, adicione 30 microlitros de dimetilsulfóxido a 10 mililitros da subcultura preparada e misture suavemente. Pipete 40 microlitros da cultura controle negativo para os poços A24 a P24. Para cada uma das placas tratadas com as moléculas pequenas, inocule um volume de 40 microlitros das culturas diluídas de overnight nos poços A1 a P22.

Sobreponha as placas com um selo de tampa permeável ao ar e incube por seis horas a 37 graus Celsius. Aproximadamente 30 minutos antes da medição espectrofotométrica, pré-aqueça o leitor de placas a 37 graus Celsius para evitar condensação. Remova cuidadosamente o selo de tampa permeável ao ar da placa antes da leitura.

Em seguida, meça a densidade óptica em um comprimento de onda de 600 nanômetros com um ajuste de 10 flashes por poço e um tempo de estabilização de 0,2 segundos. Antes de medir a fluorescência, realize um ajuste automático de ganho e foco com base no poço controle negativo A24 e defina o valor-alvo de ganho em 75%. Selecione o ajuste de foco e o canal A no lado direito da janela. Meça a fluorescência do repórter GFP em um máximo de excitação de 485 nanômetros e um máximo de emissão de 520 nanômetros com um ajuste de 10 flashes por poço e um tempo de estabilização de 0,2 segundos.

Colete os dados de todas as placas examinadas. As leituras de dados são automaticamente salvas como padrão pelo software de controle do leitor de placas. Para analisar os dados, visualize as leituras clicando no ícone de Marte dentro do software de controle para abrir o pacote de análise estatística.

Recupere os dados clicando duas vezes no número da placa de interesse para acessar os dados para análise. Avalie a uniformidade e a reprodutibilidade do ensaio utilizando uma análise robusta do fator Z primo. Em seguida, calcule a porcentagem de inibição do crescimento e avalie a porcentagem de inibição do nível intracelular de c-di-GMP conforme detalhado no protocolo descrito no texto.

Esta figura descreve dados brutos representativos de OD 600 e GFP obtidos a partir da triagem de alto rendimento. Um mapa de calor com gradiente de cores, variando de quentes a frias para indicar valores baixos a altos, foi aplicado aos valores dos poços. Os dados gerados são analisados quanto à porcentagem de inibição e são aqui representados tanto para as leituras de OD 600 quanto de GFP.

As moléculas pequenas que potencialmente inibem o crescimento e os níveis intracelulares de c-di-GMP tenderão a aparecer em verde, enquanto as moléculas pequenas que potencialmente promovem o crescimento e os níveis intracelulares de c-di-GMP tenderão a aparecer em vermelho. Gráficos de dispersão são utilizados para comparar a porcentagem de inibição obtida a partir de cada molécula pequena testada. Cada molécula pequena é representada por um pequeno ponto, e a distribuição da porcentagem de inibição para cada uma das leituras de OD 600 e GFP é mostrada.

É selecionado um corte de mais ou menos 50% para a identificação de hits. Os hits potenciais são destacados em vermelho. Ensaios de resposta dose-dependente são realizados para cada composto interessante.

Aqui, dois compostos identificados são testados em um ensaio de resposta à dose com 10 pontos, com uma concentração máxima de dois milimolares e uma série de diluições de duas vezes. O ajuste de uma função logística de quatro parâmetros aos dados gerou valores de concentração inibitória半-máxima para cada composto de 158 micromolares e 193 micromolares. Uma vez dominada, esta técnica pode ser usada para triar mais de 3.500 compostos em até 48 horas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar uma triagem robusta de Pseudomonas aeruginosa para compostos que interfiram na sinalização de di-GMP cíclico. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as condições de triagem comparáveis ao realizar a triagem em vários dias. Após uma triagem de ponto único, realizar uma triagem de resposta em faixa utilizando o mesmo protocolo pode validar os compostos ativos.

Essa técnica abre caminho para que pesquisadores identifiquem potenciais moléculas pequenas que interfiram na formação de biofilmes e na resistência a antibióticos de Pseudomonas aeruginosa. É importante destacar que essa técnica pode ser adaptada para uso com qualquer bactéria de interesse e pode ser modificada para examinar outras entradas ou saídas, como o impacto na viabilidade bacteriana. Por fim, não se esqueça de que trabalhar com Pseudomonas aeruginosa pode ser perigoso.

E precauções, como o uso de equipamento de proteção individual, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.