Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização Pseudomonas aeruginosa

O objetivo geral deste procedimento é identificar pequenas moléculas que modulam os níveis intracelulares do segundo mensageiro cíclico-di-GMP no patógeno oportunista, Pseudomonas aeruginosa, por meio de uma tela bio-repórter de alto rendimento. Este método pode ajudar a descobrir pequenas moléculas que interferem na bioinformação de Pseudomonas aeruginosa e outras partículas por meio da modulação cíclica-di-GMP. A principal vantagem desta técnica é que ela é muito robusta e versátil, permitindo a triagem de mais de 3.500 compostos em 48 horas.

As implicações desta técnica estendem-se ao desenvolvimento de novas terapias que potencialmente sensibilizam para Pseudomonas aeruginosa, para o sistema imunológico ou para antibióticos existentes, exercendo uma pressão menor e seletiva sobre as bactérias. Inocular cinco mililitros de caldo de lisogenia, ou meio LB, com uma única colônia de P. aeruginosa, sete graus Celsius, com agitação a 200 rpm. Em seguida, transfira dois mililitros da cultura durante a noite para 200 mililitros de meio LB fresco em um frasco de um litro e incube a 37 graus Celsius com agitação a 200 rpm.

Monitore a densidade óptica em 600 nanômetros ou OD 600, a cada 30 minutos, retirando uma amostra de 1 mililitro do frasco e examinando usando um espectrofotômetro. Quando o OD 600 atingir entre 0,3 e 0,5, coloque 40 mililitros da cultura em um tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros. Pulverize as células centrifugando a 8000 rpm por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 40 mililitros de solução estéril de sacarose a 300 milimolares gelada. Depois de centrifugar as células uma segunda vez, ressuspenda em 20 mililitros de solução estéril de sacarose 300 milimolar gelada Centrifugue as células novamente e ressuspenda em 400 microlitros da solução de sacarose 300 milimolar. Refrigere as células no gelo por 30 minutos, após os quais elas estão prontas para eletroporação.

Em seguida, adicione um microlitro de uma solução de 0,2 micrograma por microlitro de plasmídeo que codifica o promotor CdrA ao gene que codifica a proteína fluorescente verde a 40 microlitros das células eletrocompetentes de P.Aeruginosa preparadas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro que foi pré-resfriado em gelo. Misture a suspensão e transfira-a para uma cubeta de eletroporação pré-resfriada de 2 milímetros. Remova a umidade do lado de fora da cubeta com papel de seda e coloque a cubeta na câmara de amostra do eletroporador.

Pulse a solução com uma tensão de 2,5 quilovolts, capacitantes de 25 microfarad e uma resistência de 200 ohms. Retire a cubeta e adicione um mililitro de meio LB. Em seguida, transfira as células para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro e incube por duas horas a 37 graus Celsius com agitação a 200 rpm.

Após a incubação, espalhe alíquotas de 10 microlitros, 50 microlitros e 100 microlitros da cultura em placas de ágar LB estéreis fornecidas com ampicilina e incube as placas a 37 graus Celsius durante a noite. Confirme a expressão de GFP examinando a placa sob um microscópio de fluorescência com um canal GFP padrão. Escolha uma única colônia e inocule em cinco mililitros de LB. Após a incubação durante a noite, misture 0,5 mililitros da cultura noturna com 0,5 mililitros de glicerol a 50% em um tubo com tampa de rosca de 2 mililitros e armazene a 80 graus Celsius negativos.

Dois dias antes da triagem, coloque a cepa de P.aeruginosa preparada do estoque de 80 graus Celsius negativos em uma placa de ágar LB, espalhando suavemente a bactéria sobre a placa usando um laço de inoculação estéril. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius. Na noite anterior à triagem, inocular uma única colônia de P. aeruginosa da placa em 10 mililitros de meio LB em um tubo.

Incube a pré-cultura durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 200 rpm. No dia da triagem, prepare uma subcultura da pré-cultura durante a noite, diluindo-a primeiro com meio LB fresco para um OD 600 de 1,0 e, em seguida, diluindo ainda mais com 5% LB para um OD 600 de 04. Adicione uma barra de agitação magnética estéril no recipiente e mexa a cultura em velocidade mínima em um agitador magnético por 30 minutos em temperatura ambiente.

Isso permite que as bactérias se aclimatem ao meio antes de serem dispensadas em placas de 384 poços. Para preparar o controle positivo, adicione 20 microlitros de sulfato de tobramicina a 10 mililitros da subcultura preparada e misture delicadamente. Pipetar 40 microlitros da cultura de controle positivo nos poços A23 a P23.

Para preparar o controle negativo, adicione 30 microlitros de Dimetilsulfóxido a 10 mililitros da subcultura preparada e misture delicadamente. Pipetar 40 microlitros da cultura de controle negativo nos poços A24 a P24. Para cada uma das placas umedecidas com as pequenas moléculas, inocular um volume de 40 microlitros das culturas diluídas durante a noite nos poços A1 a P22.

Sele as placas com uma vedação de tampa permeável ao ar e incube por seis horas a 37 graus Celsius. Aproximadamente 30 minutos antes da medição espectrofotométrica, pré-aqueça o leitor de placas a 37 graus Celsius para evitar condensação. Remova cuidadosamente a vedação da tampa permeável ao ar da placa antes de ler.

Em seguida, meça a densidade óptica em um comprimento de onda de 600 nanômetros com uma configuração de 10 flashes por poço e um tempo de estabilização de 0,2 segundos. Antes de medir a fluorescência, faça um ajuste automático de ganho e foco com base no poço de controle negativo A24 e defina o valor alvo de ganho em 75%Selecione o ajuste de foco e o canal A à direita da janela. Meça a fluorescência do repórter GFP a uma excitação máxima de 485 nanômetros e uma emissão máxima de 520 nanômetros com uma configuração de 10 flashes por poço e um tempo de estabilização de 0,2 segundos.

Colete dados de todas as placas examinadas. As leituras de dados são salvas automaticamente como padrão pelo software de controle do leitor de placas. Para analisar os dados, visualize as leituras clicando no ícone Marte no software de controle para abrir o pacote de análise estatística.

Recupere os dados clicando duas vezes no número da placa de interesse para acessar os dados para análise. Avalie a uniformidade e a reprodutibilidade do ensaio usando uma análise robusta de primos Z. Em seguida, calcule a porcentagem de inibição do crescimento e avalie a porcentagem de inibição do nível intracelular de c-di-GMP, conforme detalhado no protocolo de texto.

Esta figura descreve dados brutos representativos para OD 600 e GFP da tela de alto rendimento. Um mapa de calor de gradiente de cores com cores quentes a frias indicando valores baixos a altos foi aplicado aos valores do poço. Os dados gerados são analisados quanto à porcentagem de inibição e são representados aqui para as leituras OD 600 e GFP.

Pequenas moléculas que potencialmente inibem o crescimento e o c-di-GMP intracelular tendem a estar em verde, enquanto as pequenas moléculas que potencialmente promovem o crescimento e os níveis intracelulares de c-di-GMP tendem a estar em vermelho. Os gráficos de dispersão são utilizados para comparar a porcentagem de inibição obtida de cada pequena molécula testada. Cada pequena molécula é representada por um pequeno ponto e a distribuição percentual de inibição para cada uma das leituras OD 600 e GFP é mostrada.

Um corte de mais ou menos 50% é selecionado para identificação de ocorrência. Os possíveis acertos são destacados em vermelho. Ensaios de dose-resposta são realizados em cada composto interessante.

Aqui, dois compostos identificados são testados em um ensaio de dose-resposta de 10 pontos com uma concentração máxima de dois milimolares e uma série de diluição dupla. Ajustando uma função logística de quatro parâmetros aos dados, obteve-se valores de concentração inibitória semi-máxima para cada composto de 158 micromolares e 193 micromolares. Uma vez dominada, esta técnica pode ser usada para rastrear mais de 3.500 compostos em 48 horas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rastrear Pseudomonas aeruginosa de forma robusta em busca de compostos que interferem na sinalização cíclica-di-GMP. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as condições de triagem comparáveis ao fazer a triagem por vários dias. Seguir uma tela de ponto único executando uma tela de resposta dirsk usando o mesmo protocolo pode validar as ocorrências.

Essa técnica abre caminho para os pesquisadores identificarem pequenas moléculas potenciais que interferem na informação bélica de Pseudomonas aeruginosa e na resistência a antibióticos. É importante ressaltar que essa técnica pode ser adaptada para ser usada para qualquer bactéria de interesse e pode ser modificada para examinar outras saídas ou entradas, como um impacto na viabilidade bacteriana. Finalmente, não se esqueça de que trabalhar com Pseudomonas aeruginosa pode ser perigoso.

E precauções como o uso de equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.