Immunoblotting quantitativa de linhas celulares como um padrão para validar a imunofluorescência para quantificar proteínas biomarcador em amostras de tecido de rotina

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da patologia do câncer, quantificando proteínas biomarcadores de material de biópsia rotineiramente processado. As principais vantagens dessa técnica em relação à imunohistoquímica convencional, são que ela é objetiva, tem uma ampla gama dinâmica e permite a quantificação de proteínas em tipos de células específicas. A presença ou ausência de certas proteínas biomarcadoras, ou mais particularmente, a abundância relativa dessas proteínas em amostras de biópsia do câncer pode ser muito útil para fazer um diagnóstico patológico específico de tipos específicos de cânceres.

Mas também pode ser útil para prever a resposta aos tratamentos oncológicos, por isso essa técnica é relevante tanto para o diagnóstico quanto para o tratamento de pacientes com câncer. Este protocolo é principalmente sobre como usar a quantificação proteica em linhas celulares imortalizadas para validar a natureza quantitativa do ensaio baseado em imunofluorescência. Mas é importante notar que a imunofluorescência pode ser facilmente incorporada em uma abordagem multiplexada, e aplicada a amostras de biópsia primária.

Auxiliando e demonstrando esse procedimento estarão Lee Boudreau, técnico, e Shakeel Virk, diretor de operações. Ambos do Laboratório da Rainha para Patologia Molecular. Para começar, centrifugar as células previamente colhidas em um tubo cônico de 50 mililitros a 225 Gs por cinco minutos.

Decante o supernasce, e resuspense a pelota de célula em 10 mililitros de PBS. Em seguida, centrífugue as células resuspended a 225 Gs por cinco minutos. Suspenda a pelota celular com 10 mililitros de 10% NBF.

Em seguida, incubar as células à temperatura ambiente em um roqueiro a 24 RPMs durante a noite. Depois de consertar as células, centrifugar as células a 225 Gs por cinco minutos. Em seguida, remova o supernascer e resuspenja as células em 500 microliters de PBS.

Transfira as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, e pelota as células através de centrifugação. Então, aspirar o supernante. Adicione aproximadamente 500 microliters de 1% de solução agarose a cada tubo contendo células.

Em seguida, pipete a mistura para cima e para baixo para misturar. Depois que a solução celular agarose endurecer, adicione um mililitro de 10% NBF aos tubos. Mais tarde, remova o NBF das amostras.

Use uma lâmina de barbear para remover o plugue da célula e coloque o plugue em uma fita de tecido plástico. Processe amostras durante a noite com um processador de tecido automatizado. Em seguida, incorpore as amostras em cera de parafina, usando métodos de histologia padrão.

Usando um instrumento de matriz de tecido, colde núcleos duplicados de 6 milímetros do bloco de parafina e insira-os em um bloco de parafina vazio. Depois disso, use um microtome para preparar duas seções histológicas da linha celular recém-criada, TMA. Em seguida, monte as seções em um slide de histologia, e desparafina-los.

Primeiro, carregue os dois slides da linha de célulaS TMA em um sistema automatizado de coloração. Colora um lado com a diluição de anticorpos primários ideal, deixando o outro como um slide de controle negativo. Para ambos os slides, aplique uma contra-mancha nuclear e um anticorpo secundário.

Após o processo de coloração, adicione os reagentes de amplificação do sinal de tiragem. Depois disso, escaneie os slides imunossuados usando os comprimentos de onda de excitação e detecção apropriados para os fluoroforos utilizados. Use o software de análise de imagem para identificar o compartimento celular de interesse, seja núcleo ou citoplasma, e quantificar a intensidade média de fluorescência, ou FI, para cada linha.

Para determinar qual linha celular tem a maior abundância da proteína alvo, alíquotas preciosamente preparadas em tubos de microcentrifuuge. Em seguida, adicione 2,5 microliters de tampão laemly 6x e tampão de lise RIPA suficiente para levar o volume total a 15 microliters. Em seguida, carregue um gel de página SDS, com uma escada de proteína, e as amostras previamente preparadas.

Depois disso, carregue o tampão laemly nos poços vazios. Execute o gel até que o corante azul atinja a parte inferior da placa. Depois de realizar uma transferência de proteína semi-seca, use uma lâmina de barbear para cortar a membrana horizontalmente para separar a proteína de interesse da proteína de controle.

Realizar incubações de bloqueio e anticorpos de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, coloque as tiras de membrana em um saco plástico transparente. Use uma pipeta P1000 para cobrir as membranas com mistura de ECL.

Em seguida, sele o saco e incuba as membranas à temperatura ambiente no escuro por um a dois minutos. Em seguida, coloque o saco plástico contendo as membranas em uma plataforma de imagem digital. Use a quemiluminescência e a detecção de marcadores colorimétricos para capturar várias exposições da membrana.

Usando software de análise de imagem, ou observação visual, determinar qual linha celular expressa a proteína mais alvo. Após imunoblotting uma diluição serial desta linha celular, abra as imagens de exposição usando software de análise de imagem. Use a ferramenta seleções retangulares para selecionar a primeira faixa do gel.

Em seguida, vá para analisar, géis e selecione a primeira pista. Repita este processo movendo a ferramenta de seleções retangulares para a próxima faixa, e vá analisar, géis e selecionar a próxima faixa. Em seguida, vá analisar, géis e faixas de enredo.

Use a ferramenta linha reta para desenhar linhas através das bases de cada pico, para remover o ruído de fundo. Em seguida, use a ferramenta varinha para selecionar cada pico e obtenha a intensidade da banda de cada pico a partir da janela de resultados. Crie uma dispersão de intensidade de banda versus a quantidade de proteína total carregada para cada anticorpo primário usando a saída de densitometria.

Em seguida, use uma linha de melhor ajuste e observação visual para determinar a localização da faixa dinâmica linear de cada anticorpo. Selecione uma concentração proteica que produza uma intensidade de banda dentro da faixa linear, e realize um imunoblot de todas as linhas celulares com essa concentração de proteína, como demonstrado anteriormente. Em seguida, realize a densitometria nas varreduras digitais, selecionando exposições que produzem sinais dentro das faixas lineares previamente identificadas para cada anticorpo.

Depois disso, calcule a razão da intensidade da banda de proteína alvo para a intensidade da banda de controle de carga para cada linha celular. Por fim, utilize um software estatístico para realizar um teste de correlação de Pearson entre os valores obtidos a partir da análise de imagem da coloração if, e aqueles obtidos a partir da imunoblotação. Este protocolo foi usado para confirmar a capacidade do IF de determinar a quantidade relativa da proteína anti-apoptótica Bcl-2.

Diferentes diluições do anticorpo primário foram testadas em tecido amígdale humano com um colorador de imunohistologia. Para este experimento, uma diluição de um a 50 foi determinada como a diluição ideal que rendeu um sinal forte com pouco ruído de fundo. Esta diluição foi usada para manchar a linha celular TMA por imunofluorescência, e a análise de imagem foi usada para quantificar o sinal citoplasmado Cy5 atribuído ao Bcl-2.

Com base no imunobloto para todas as linhas celulares testadas, Granta-519 tinha a maior abundância de Bcl-2. Um imunobloto da diluição seriada de Granta-519 lysate foi então usado para encontrar o alcance dinâmico linear de Bcl-2, e controlar a proteína GAPDH. O alcance dinâmico do Bcl-2 neste ensaio variou de uma intensidade de banda de quase 0, até 7500 unidades.

O alcance dinâmico do GAPDH variou de 3000 a 6500 unidades. O imunobloto foi repetido com exposições dentro dessa faixa linear. E a razão entre Bcl-2 e GAPDH foi calculada para cada linha celular.

Um teste de correlação de Pearson demonstrou que as razões de intensidade da imunoblotação estavam fortemente e positivamente correlacionadas com as leituras de intensidade do IF quantitativo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de expor a membrana final por vários pontos de tempo, a fim de encontrar a exposição ideal onde todas as bandas estão dentro de suas respectivas faixas lineares. Após validar a natureza quantitativa do protocolo IF, ele pode ser modificado para multiplex IF, em amostras de tecido rotineiramente processados, a fim de responder a questões clínicas, como onde uma proteína alvo é expressa.