Optimizado coloração negativa: um protocolo de alta capacidade para Examinando pequeno e assimétrico Estrutura de proteínas por microscopia eletrônica

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de proteínas pequenas e assimétricas utilizando um protocolo otimizado de alto rendimento de microscopia eletrônica com contraste negativo. Isso é realizado primeiramente incubando a proteína em uma estação de incubação preparada, ao mesmo tempo em que se prepara uma estação de contraste negativo. O segundo passo do procedimento consiste em lavar rapidamente a amostra em três gotas de água sequenciais.

O terceiro passo é corar cuidadosamente a amostra em três gotas de corante sequencialmente. O passo final é remover a solução em excesso por meio de absorção pela parte traseira da grade de ME e, em seguida, secar suavemente sob gás nitrogênio. Por fim, os resultados podem mostrar imagens de alta resolução de proteínas pequenas por meio de imagem de ME em condições de baixo desfoque.

A principal vantagem desta técnica em relação à microscopia eletrônica criogênica é estabelecida. Ela pode permitir a análise de alto rendimento e a obtenção de imagens com alto contraste de estruturas proteicas pequenas e assimétricas, ao mesmo tempo que reduz os artefatos estruturais provenientes da coloração negativa convencional. Embora este método possa fornecer informações sobre a base estrutural dos mecanismos de proteínas pequenas, como a proteína transferidora de éster de colesterol.

Ele também pode ser aplicado a outras proteínas, como a IgG, um anticorpo, a lipoproteína de alta densidade e o proteassoma, que variam amplamente em tamanho. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas de lavagem e coloração são difíceis de aprender devido à variação nos tempos, e até o borramento da amostra pode causar efeitos drásticos na proteína corada final. A demonstração do procedimento será realizada por Z.A., pesquisador colaborador do meu laboratório. Ao se preparar para este protocolo, é necessário preparar uma solução de formol a 1% com a máxima atenção para minimizar sua exposição à luz.

Isso inclui embrulhar as partes do filtro de 0,2 mícron da seringa em papel alumínio quando for a hora de filtrar pela primeira vez a solução. Após a filtração, armazene alíquotas de dois mililitros em frascos embrulhados em papel alumínio a menos 80 graus Celsius no dia do experimento. Descongele uma alíquota em banho-maria à temperatura ambiente após o descongelamento completo.

Filtre novamente através de um filtro de 0,02 mícron com as partes envolvidas em papel alumínio. O frasco de coleta também deve ser envolvido em papel alumínio. Transfira a coloração negativa para uma caixa de gelo até o momento de uso.

Faça uma folha para suporte de gotas pressionando um pedaço de param com oito polegadas de comprimento contra um suporte de ponteiras de pipeta. Isso cria reentrâncias côncavas que funcionam como poços de cinco milímetros de diâmetro. Após criar seis fileiras de poços, nivele o gelo na superfície de uma bandeja de isopor e, em seguida, posicione a folha sobre o gelo.

Em seguida, adicione 35 microlitros de água DI nos três primeiros poços da folha no lado esquerdo. Depois, carregue os três poços da direita na folha com 35 microlitros da solução de contracoloração preparada. Cubra a bandeja para minimizar a exposição da solução à luz.

Isso servirá como uma estação de coloração. Agora prepare uma estação de incubação de grades de microscopia eletrônica a partir de uma caixa vazia de ponteiras com um suporte no qual pinças possam ser fixadas. Encha a caixa até a metade com gelo, de modo que a superfície do gelo fique próxima à ponta das pinças quando estas estiverem fixadas.

Primeiro, faça uma descarga elétrica nas grades de cobre EM de 300 malhas com revestimento fino de carbono por cerca de 10 segundos. Em seguida, pegue uma grade com pinças que se prendem à estação de incubação de grades EM. Pendure as pinças com a grade, de modo que a grade fique inclinada a 45 graus e a meia polegada acima do gelo.

Agora dilua a amostra proteica em DPBS a 50 a 100 microgramas de proteína por mililitro de solução. Aplique imediatamente cerca de quatro microlitros da diluição à grade de ME. Deixe a amostra incubando por cerca de um minuto.

Após um minuto, tampone rapidamente a malha com papel de filtro para remover a solução em excesso. Em seguida, na estação de coloração, encoste a malha na primeira gota de água sobre o filme de parafina. Repita rapidamente o processo de secagem do filtro e umedecimento com a próxima gota.

Utilize um total de três gotas de água e faça isso o mais rapidamente possível. A lavagem da grade com água deve ser realizada rapidamente para evitar efeitos adversos da alteração do tampão sobre a proteína. Após remover com leve toque a última lavagem em até três segundos, comece a flutuar a grade na primeira gota da solução de coloração negativa.

Deixe-o flutuar por 10 segundos. Enquanto isso, limpe a pinça pressionando as pontas no papel de filtro. Algumas vezes após os dez segundos de flutuação, absorva a solução com papel de filtro e inicie outra flutuação na próxima gota de corante por dois segundos.

Limpe a pinça durante os dois segundos. Em seguida, seque a grade com papel de filtro e coloque-a sobre a terceira gota. Cubra a estação de coloração durante um minuto inteiro nesta etapa.

A remoção do corante deve ser feita tocando o verso da grade de ME por um tempo preciso para garantir que a grade seja seca uniformemente. Se o papel filtro tocar o corante por muito tempo, pode-se remover corante em excesso, levando a uma má qualidade de imagem. Em seguida, prossiga com a secagem da grade.

Primeiro, encoste todo o lado não carbonado no papel-filtro até que a solução seja transferida. Em seguida, aplique um fluxo suave de gás nitrogênio. Agora, transfira a grade para um recipiente forrado com papel-filtro e cubra parcialmente o recipiente.

Deixe a grade secar no recipiente por 30 minutos à temperatura ambiente. Alternativamente, amostras contendo lipídios podem ser aquecidas a 40 graus Celsius por uma hora. Após secagem completa, transfira a grade de microscopia eletrônica para uma caixa de armazenamento de grades de ME antes de iniciar o primeiro alinhamento do MET.

Verifique a resolução do anel de degelo visível mais alto com o espectro de potência de uma área de filme de carbono da grade com contraste negativo, que deve ser melhor do que a resolução almejada. Em seguida, para ajustar o alinhamento, verifique cuidadosamente o espectro de potência na área de filme de carbono do espécime. Em condições de alinhamento adequado, mais de 20 anéis de T tho podem ser visualizados, o que corresponde a uma visualização melhor do que cinco angstroms.

Os anéis foram produzidos por transferência de peleiro de uma imagem de carbono amorfo sob um desfoque de 1,6 mícrons e uma dose de 20,4 elétrons por angstrom quadrado. Agora, retorne o foco a uma condição próxima ao foco de Scherzer, cerca de 0,1 mícrometros, para a imagem de proteínas pequenas durante o exame da grade de ME. Idealmente, as áreas coradas geralmente estão próximas à borda de áreas nubladas mais espessas e coradas, em baixa magnificação.

A estrutura de espécimes de lipoproteínas foi observada com OPNS. Exemplos incluem HDL recombinante, plasma humano, LDL, IDL de plasma humano e VLDL de plasma humano. Estruturas menores, como CETP de 53 kilodaltons, também foram observadas.

Esta é uma das menores proteínas já obtidas com sucesso por microscopia eletrônica de emissão. A superposição da estrutura cristalina da CETP corresponde muito bem à imagem, sendo altamente dinâmica. Proteínas heterogêneas também foram observadas em anticorpos de imunoglobulina G de 160 quilodaltons.

Três subdomínios eram claramente visíveis. Um exame mais detalhado do anticorpo IgG um foi utilizado para fazer uma comparação com sua estrutura cristalina. A estrutura cristalina do anticorpo IgG um coincide com a visualização em microscopia eletrônica desses anticorpos de várias maneiras, como nas posições dos domínios e nas suas formas.

Outras moléculas visualizadas incluem a apolipoproteína A-1 livre de lipídeos de 28 kilodaltons, o EL e os proteassomos. Essencialmente, o método OPNS avança significativamente os limites da imagem em microscopia eletrônica para estruturas pequenas e assimétricas, bem como para estudos mecanicistas associados durante a tentativa do procedimento. É importante reduzir ao máximo a exposição à luz do reagente corante, lavar rapidamente o espécime e utilizar foco quase no ponto de congelamento para a obtenção de imagens após este procedimento.

Outros métodos, como a tomografia eletrônica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como as estruturas de resolução em nanômetros de moléculas individuais e as mudanças conformacionais entre elas. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia estrutural explorarem os mecanismos de transferência de ésteres em aglomerados entre as lipoproteínas plasmáticas humanas.