Optimizado coloração negativa: um protocolo de alta capacidade para Examinando pequeno e assimétrico Estrutura de proteínas por microscopia eletrônica

Mais da metade das proteínas são pequenas proteínas (massa molecular <200 kDa) que são um desafio tanto para elétron imagem ao microscópio e reconstruções tridimensionais. Coloração negativa otimizado é um protocolo robusto e de alto rendimento para a obtenção de alto contraste e imagens de pequenas proteínas ou complexos assimétricas em diferentes condições fisiológicas relativamente alta resolução (~ 1 nm).

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de proteínas pequenas e assimétricas usando um protocolo otimizado de alto rendimento de microscopia eletrônica de coloração negativa. Isso é feito primeiro incubando a proteína em uma estação de incubação preparada enquanto prepara uma estação de trabalho de coloração negativa. A segunda etapa do procedimento é lavar rapidamente a amostra em três gotículas de água sequencialmente.

O terceiro passo é corar cuidadosamente a amostra em três gotículas de coloração sequencialmente. A etapa final é remover o excesso de solução enxugando a parte traseira da grade EM e, em seguida, secando suavemente sob gás nitrogênio. Em última análise, os resultados podem mostrar imagens de alta resolução de pequenas proteínas por meio de imagens TEM sob uma condição de baixa desfocagem.

A principal vantagem desta técnica sobre a crioeletromicroscópica é definida. Ele pode permitir exames de alto rendimento e imagens de alto contraste de estruturas proteicas pequenas e assimétricas, reduzindo os artefatos de estrutura da coloração negativa convencional. Embora este método possa fornecer informações sobre a base estrutural de pequenos mecanismos de proteína, como a proteína de transferência de éster de colesterol.

Também pode ser aplicado a outras proteínas, como IgG, um anticorpo, lipoproteína de alta densidade e proteassoma, que variam amplamente em tamanho. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de lavagem e coloração são difíceis de aprender devido à variação no tempo e até mesmo o blotting da amostra pode causar efeitos dramáticos na proteína corada acabada Demonstrar o procedimento será perdido entre os pesquisadores Z.A do meu laboratório. Ao se preparar para este protocolo, é necessário fazer uma solução de urinol a 1% em forma de oito com a máxima atenção para minimizar sua exposição à luz.

Isso inclui embrulhar as peças do filtro da seringa N 0,2 mícron em papel alumínio quando for a hora de filtrar a solução pela primeira vez. Após a filtragem, armazene alíquotas de frascos embrulhadas em papel alumínio de dois mililitros a 80 graus Celsius negativos no dia do experimento. Descongele uma alíquota em banho-maria em temperatura ambiente depois de completamente descongelada.

Filtre-o novamente através de um filtro de 0,02 mícron com as peças envoltas em papel alumínio. O frasco para injetáveis de recolha também deve ser embrulhado em papel alumínio. Transfira a mancha negativa para uma geladeira até que seja usada.

Faça uma folha de retenção de gotículas pressionando um comprimento de oito polegadas de param em um suporte de ponta de pipeta. Isso faz com que as reentrâncias das estradas sirvam como poços de cinco milímetros de diâmetro. Depois de fazer seis fileiras de poços, alise o gelo na superfície de uma bandeja de isopor e posicione a folha sobre o gelo.

Em seguida, adicione 35 microlitros de água DI nos três primeiros poços da folha do lado esquerdo. Em seguida, carregue os três poços certos na folha com 35 microlitros da solução de coloração negativa preparada. Cubra a bandeja para minimizar a exposição à luz à solução.

Isso servirá como uma estação de coloração. Agora prepare uma estação de incubação de grade EM a partir de uma caixa de ponteira de pipeta vazia com um acessório no qual as pinças podem ser montadas. Encha a caixa até a metade com gelo para que a superfície do gelo fique perto da ponta das pinças quando elas forem montadas.

A primeira descarga incandescente as grades EM de cobre de 300 mesh revestidas de carbono fino por cerca de 10 segundos. Em seguida, pegue uma grade com pinças que se conectam à estação de incubação da grade EM. Pendure a pinça com a grade, de modo que a grade fique com uma inclinação de 45 graus meia polegada acima do gelo.

Agora dilua a amostra de proteína em DPBS a 50 a 100 microgramas de proteína por mililitro de solução. Aplique imediatamente cerca de quatro microlitros da diluição na grade EM. Deixe a amostra incubar por cerca de um minuto.

Após um minuto, enxugue rapidamente a malha com papel de filtro para remover o excesso de solução. E então, na estação de coloração, toque a malha na primeira gota de água no filme para. Repita rapidamente o processo de secagem do filtro e maceração com a próxima gota.

Use um total de três gotas de água e faça isso o mais rápido possível. A lavagem da grelha com água deve ser feita rapidamente para evitar efeitos adversos da mudança de tampão na proteína. Depois de enxugar a última lavagem em três segundos, comece a flutuar a grade na primeira gota da solução de coloração negativa.

Deixe flutuar por 10 segundos. Enquanto isso, limpe a pinça pressionando as pontas no papel de filtro. Algumas vezes após a flutuação de dez segundos, seque a solução com papel de filtro e inicie outra flutuação na próxima gota de mancha por dois segundos.

Limpe a pinça durante os dois segundos. Em seguida, seque a grade e coloque-a na terceira gota. Por um minuto inteiro, cubra a estação de coloração durante esta etapa.

A remoção da mancha deve ser feita tocando na parte de trás da grade EM por um período preciso de tempo para garantir que a grade esteja seca uniformemente. Se o papel de filtro tocar a mancha por muito tempo, muita mancha poderá ser removida, levando a uma imagem ruim. Em seguida, prossiga com a secagem da grade.

Primeiro, toque todo o lado sem carbono no papel de filtro até que a solução seja transferida. Em segundo lugar, aplique um fluxo suave de gás nitrogênio. Agora transfira a grade para um prato forrado com papel de filtro e cubra parcialmente o prato.

Deixe a grelha secar no prato por 30 minutos em temperatura ambiente. Alternativamente, amostras contendo lipídios podem ser cozidas a 40 graus Celsius por uma hora. Depois de totalmente seco, transfira a grade EM para uma caixa de armazenamento de grade EM antes de começar primeiro, alinhe o TEM.

Verifique a resolução do anel de descongelamento visível mais alto com o espectro de potência de uma área de filme de carbono da grade manchada negativamente, que deve ser melhor do que a resolução desejada. Em seguida, para ajustar o alinhamento, verifique cuidadosamente o espectro de potência na área do filme de carbono da amostra. Sob uma condição devidamente alinhada, mais de 20 anéis T tho podem ser visualizados, o que corresponde a uma visualização melhor do que cinco angstroms.

Os anéis foram feitos por transferência mais peleira de uma imagem de carbono amorfa sob uma desfocagem de 1,6 mícrons e uma dose de 20,4 elétrons por quadrado. Angstrom. Agora traga o foco de volta para uma condição de foco próxima de Scherzer cerca de 0,1 micrômetros para imagens de pequenas proteínas durante o exame da grade EM. Idealmente, as áreas manchadas geralmente estão perto da borda de áreas turvas manchadas mais espessas em baixa ampliação.

A estrutura das amostras de lipoproteína foi visualizada com OPNS. Exemplos incluem HDL recombinante, plasma humano, LDL, IDL plasmático humano e VLDL plasmático humano. Estruturas menores como 53 kilodalton, CETP também foram vistas.

Esta é uma das menores proteínas fotografadas com sucesso por eem. A super imposição da estrutura cristalina CETP combina muito bem com a imagem, muito dinâmica. Proteínas heterogêneas também foram vistas em anticorpos de imunoglobulina G de 160 kilodaltons.

Três subdomínios eram claramente visíveis. Um exame mais detalhado do anticorpo IgG um foi usado para fazer uma comparação com sua estrutura cristalina. A estrutura cristalina do anticorpo IgG corresponde à visão EM desses anticorpos de várias maneiras, como nas posições de domínio e suas formas.

Outras moléculas vistas incluem 28 kilodalton, apo lipoproteína A livre de lipídios um crescimento EL e proteassomas. Essencialmente, o método OPNS avança significativamente o limite da imagem EM para pequenas estruturas assimétricas, bem como estudos mecanicistas associados ao tentar o procedimento. É importante reduzir ao máximo a exposição à luz ao reagente da mancha para lavar rapidamente a amostra e usar o foco próximo ao tesouro para obter imagens após este procedimento.

Outros métodos, como a tomografia eletrônica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como as estruturas de resolução nanométrica de moléculas individuais e as mudanças de confirmação entre elas. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia estrutural explorarem os ímãs de uma transferência de éster de cluster entre as lipoproteínas plasmáticas humanas.