Name: Um ensaio de competição de placa como uma rápida avaliação preliminar de supressão da doença (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Aprenda um ensaio de competição de placa para avaliar rapidamente compostos com propriedades de supressão contra Rhizoctonia solani. Este método simples e acessível permite triagem em dois a três dias, acelerando a certificação de compostos para controle biológico.

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O Vermont agrícola Experiment Station competitiva Hatch programa VT-HO1609 financiou a pesquisa. Lynn Fang usou o método como parte de sua tese de M.S. na Universidade de Vermont6.

1. preparar com antecedência
<ol><li>Cultura de fungosa mestre (organismo de teste)<ol>
<li>Encomendar o American Type Culture Collection, coleção de microbiologia9, pelo seu teleomorfo Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) ou MYA 4031.</li>
		<li>Como alternativa: Colete locais isolados como feito pelos autores. Mudas de vermelho rabanete (Raphanus sativus) funcionam bem como uma planta de isca; colete o solo de um local conhecido por ter um histórico de umedecimento-fora ou raiz podridão causada por r. solani. Plantar sementes no solo e isolar-se de lesões de raiz quando mudas são 3 a 4 semanas de idade.<ol>
<li>Retire as mudas do solo e enxágue com água da torneira. Olhe para o tecido marrom na região hypocotyl entre as folhas e a raiz (Figura 1).</li>
			<li>Use uma única lâmina afiada para cortar segmentos de 1 cm do hypocotyl ou raiz que têm uma cor marrom. Use chama-esterilizados fórceps para mergulhar os segmentos em solução de 10% de alvejante doméstico por 1 min, seguido de um enxágue s 10 em água estéril. Nota: A parte superior e inferior de uma placa de Petri estéril são recipientes úteis para esta etapa.</li>
			<li>Uso chama-esterilizados fórceps para transferir a planta pedaços para dentro de uma toalha de papel para pat seco e em seguida coloque sobre a superfície de uma placa de Petri com ágar água (15 g em 1 L).</li>
			<li>Coloque o prato de Petri dentro de um recipiente plástico com tampa e incubar à temperatura ambiente (cerca de 20 ° C). Limpe o interior do recipiente com 10% de lixívia ou 75% de etanol e deixe secar antes de colocar o prato.</li>
			<li>Manter os isolados em armazenamento a longo prazo em uma mídia mínima do ágar farinha de milho inclinações (17 g em 1 L) (a 5 ° C).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58767/58767fig1.jpg"> Figura 1: sintomas da doença. Solo, contendo o r. solani resulta em germinação irregular e estabelecimento (à esquerda). Os sintomas em mudas de rabanete ocorrerem como lesões marrons do hypocotyl (à direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58767/58767fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2"><li>Use placas de ágar batata dextrose (39 g em 1 L) de inóculo para este ensaio de placa.<ol>
<li>Estabelecer uma cultura de filha de Rhizoctonia cultura em ágar dextrose batata, um ou dois dias antes do ensaio garantir está bem estabelecido na placa de cultura, antes do ensaio. Começa a cultura filha transferindo um pequeno pedaço (10 mm de diâmetro) de r. solani de cultura mestre para o centro de um prato fresco de ágar de batata dextrose (Figura 2). Nota: Trabalhar em uma capa de fluxo laminar ou limpar uma bancada de laboratório com 10% de lixívia ou 75% etanol para minimizar o risco de contaminação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Autoclave tubos de ensaio de 25 mL com alíquotas de 10 mL de água destilada (2 x número de amostras).</li>
</ol>2. preparação de amostras para teste
<ol><li>Adicione duas amostras independentes de 0,5 g de cada amostra de adubo para 10 mL de água esterilizada em tubos de ensaio de 25 mL. Agite os tubos de ensaio durante a noite.<ol>
<li>Etiquete os tubos de ensaio com números da amostra original e cada membro do par como uma (referência) ou B (amostra).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após 24 h, adicione 1,5 g de ágar-ágar simples para 90 mL de água destilada em frascos de dois 125 mLconical.</li>
	<li>Autoclave ambos os Matrases com agar e a uma amostra de cada par por 20 min com uma configuração de escape lento.</li>
	<li>Depois da autoclave, coloca os frascos cónicos com ágar em um banho de água de 45 ° C até atingirem o equilíbrio (cerca de 30 min). Não coloque qualquer slurries de amostra em banho-maria até ter arrefecido a 45 ° C.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58767/58767fig2.jpg"> Figura 2: ilustração do protocolo. Plugues de r. solani são colocados em placas de Petri contendo extrato de água de adubo. O diâmetro do crescimento micelial é medido após 1-2 dias com o auxílio de um microscópio estéreo para melhorar a resolução e contraste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58767/58767fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="5"><li>Despeje o chorume de adubo A amostra (referência autoclavados) o ágar fundido do balão A agar. Agitar o frasco para dispersar o adubo sobre o agar.</li>
	<li>Despeje o ágar fundido do frasco B ágar, o chorume de adubo B amostra (amostra). Agitar o frasco para dispersar o adubo sobre o agar.</li>
	<li>Despeje a mistura de cada balão em cinco pratos de Petri plástico que são de 100 mm de diâmetro.</li>
	<li>Deixe a noite legal de placas para que o ágar endurece.</li>
</ol>3. Adicione o desafio de Rhizoctonia
<ol><li>Utilizando técnica asséptica, transferir pedaços de tamanho igual de r. solani para cada par de placas de ágar de amostra (3 a 5 mm corkborer funciona bem para estabelecer pedaços de tamanhos iguais). Pegue pedaços da colônia da margem externa da colônia para segurar o micélio está crescendo ativamente. Nota: Trabalhar em uma capa de fluxo laminar ou limpar uma bancada de laboratório com 10% de lixívia ou 70% de etanol.</li>
	<li>Incube as placas em temperatura ambiente por 1-2 dias até que o crescimento da colônia atinge cerca de meio caminho até a borda das placas A.</li>
</ol>4. medida de r. solani crescimento
<ol><li>Medir o raio do micélio em cada placa para o mais próximo 1 mm com uma régua plana claro usando um microscópio estéreo com iluminação transmitida. Nota: Iluminação de campo escuro ou oblíqua será mais fácil de ver e medir as hifas transparentes. Neste ponto, zonas de inibição será visíveis ao redor fragmentos de adubo na placa B se o adubo é supressivo.</li>
	<li>Gravar o raio em três lugares por placa e calcular uma média dos três para servir como uma medida representativa.</li>
	<li>Subtrai a média das placas das placas A B. Se B &lt; A então existem micróbios nas placas de B que são supressivos ao patógeno r. solani .</li>
	<li>Divida o raio médio pelo número de dias de desafio para expressar unidades de supressão relativa como uma taxa, micélio mm por dia.</li>
</ol>

<ol><li>Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review.+Biology+and+systematics+of+the+form+genus+Rhizoctonia%5BTitle%5D)+AND+%22Spanish+Journal+of+Agricultural+Research%22%5BJournal%5D)">Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia.</a> Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).</li>
<li>Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+soilborne+fungal+diseases+with+organic+amendments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments.</a> Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).</li>
<li>Noble, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+and+benefits+of+soil+amendment+with+composts+in+relation+to+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Australasian+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens.</a> Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).</li>
<li>Wichuk, K. M., McCartney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compost+stability+and+maturity+evaluation+-+a+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Civil+Engineering%22%5BJournal%5D)">Compost stability and maturity evaluation - a literature review.</a> Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).</li>
<li>Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+composted+olive+mill+wastes+to+predict+potential+plant+disease+suppressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness.</a> Biological Control. 3, 199-207 (2011).</li>
<li>Fang, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biological+indicators+of+compost-mediated+disease+suppression+against+the+soilborne+plant+pathogen+Rhizoctonia+solani%22">Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani</a>. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).</li>
<li>Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+characteristics+of+organic+soil+amendments+that+suppress+soilborne+plant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).</li>
<li>Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecoenzymes+as+indicators+of+compost+to+suppress+Rhizoctonia+solani%5BTitle%5D)+AND+%22Compost+Science+and+Utilization%22%5BJournal%5D)">Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani.</a> Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).</li>
<li>American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx">https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx</a> (2018).</li>
<li>Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gamma-sterilization+and+autoclaving+on+soil+organic+matter+structure+as+studied+by+solid+state+NMR%2C+UV+and+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Soil+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy.</a> European Journal of Soil Science. 59, (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Sabemos por pesquisas anteriores, que certos compostos são eficazes na supressão de r. solani e que os efeitos supressivos são devido os micróbios que vivem no adubo, não as propriedades abióticos de adubo6,8. O uso de autoclave como um meio para 'matar' a microbiota tem sido criticado porque afeta a química do carbono da mídia10. Comparou-se o uso de autoclave a vácuo filtração através de papel Whatman n º 1. Tratamentos que não ...

Rhizoctonia representa um amplo complexo de fungos, dos qual Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk (anamorfo = Rhizoctonia solani Kühn) é o agente patogênico causando podridão de raiz e umedecimento-fora1. Rhizoctonia solani é um patógeno agressivo e uma Saprófita que pode sobreviver como esclerócios sob condições ambientais adversas1. Como resultado, tem uma distribuição global e podem causar doenças em ampla gama de hospedeiros de planta incluindo Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae e Brassicaceae, resultando em sérios prejuízos econômicos.
O adubo tem a capacidade de abrigar agentes de biocontrole para determinados agentes patogénicos de planta2. No entanto, nem todos os compostos são iguais, nem eles afetam todos os agentes patogénicos da mesma forma3. Carbono à base de madeira tem lignina mais elevada rácios de celulose de compostos à base de feno ou palha-carbono. R. solani prefere carbono prontamente disponível encontrado em palha. Em contraste, o controle biológico de fungos, como Trichoderma spp., são mais eficazes quando o carbono é menos prontamente disponível. Benéficos fungos e bactérias em adubo podem suprimir a doença de planta através de competição, antagonismo ou regulador de crescimento de planta3. O ensaio proposto primeiramente detecta antagonismo criado pela produção de antibióticos, ecoenzymes ou quelantes que são prejudiciais ao patógeno.
Bioensaios de planta são um padrão-ouro para determinar se o terriço favorece ou impedir o crescimento de planta4. No entanto, a planta bioensaios são demoradas (semanas a meses) para concluir que pode ser mais do que o desejado e exige mais trabalho para extrair plantas com raízes para quantificar a severidade de sistemas da raiz. Comparativamente robusto, mas, mais rápido os ensaios (dias) seria ideais para programas de controle de qualidade. O objetivo deste trabalho é demonstrar um teste relativamente rápido e exato para prever potencial supressivo de adubo. O método foi padronizado após Alfano et al 5 com duas exceções, adubo extratos foram diluídos e ágar água foi usada no lugar de ágar de batata dextrose (PDA). R. solani cresce rapidamente em meios de ágar simples água Considerando que PDA promoveu o crescimento de bactérias e outros fungos que contaminou a cultura6.
Este ensaio de placa serve como um indicador de supressão que se aplica a uma gama de patógenos vegetais que sobrevivem no solo como saprófitas, incluindo r. solani7início definha Alternaria, murcha de Fusarium, podridão radicular de Phytophthora e Pythium podridão de raiz. O ensaio de competição de placa é útil para a tela uma gama de produtos de adubo para que contém comunidades de micróbios que servem como agentes de controle biológico de patógenos de solo. O ensaio foi um dos indicadores mais consistentes de supressão da doença em adubo comercial produtos6,8. Produtos foram escolhidos para sua variação na receita, maturidade e processo de produção.

<table><tbody><tr><td>frasco cônico de vidro autoclavável de gargalo estreito</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-040D</td> Tubos de ensaio de vidro autoclaváveis de <td>125 mL</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-925J</td><td>Ágar</td></tr><tr><td>granulado desidratado</td> de 25 mL <td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td>500 g quantidade</td></tr> luvas <tr><td>resistentes ao calor</td><td>Fisher Scientific</td><td>MEMGG1314WL</td><td>várias marcas disponíveis</td></tr><tr><td>Parafilme (tiras de 2-3 cm de largura)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PM992 13-374-16</td><td>5 ou 10 cm de largura funcionam</td></tr><tr><td>placas de Petri de poliestireno descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>R80116</td><td>vem em mangas de 20/ea ou caixas de 500</td></tr><tr><td>ágar dextrose de batata desidratada</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0013-15-8</td><td>vem em quantidades de 100, 500 e 2000 gramas de</td></tr><tr><td>agitador recíproco de bancada</td><td>Thomas Scientific</td><td>1227Y31</td><td>outros modelos funcionarão</td></tr><tr><td>em banho-maria</td><td>ThermoScientific</td><td>S37363</td><td>5L</td></tr><tr><td>régua transparente de uso geral, plana, pelo menos 10 cm</td><td>Qualquer</td><td></td><td>uso regra métrica</td></tr><tr><td>Cultura ATCC Coleção</td><td>de Cultura de Tipo Americano</td><td>ATCC 10154</td><td>teleomorfo Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) ou MYA 4031;</td></tr><tr><td>fita de laboratório</td><td>Fisher Scientific</td><td>15935</td><td>autoclavável e removível, marcador resistente à água preferido de 1" de largura</td></tr> para <tr><td></td><td>escritório ou suprimento científico</td><td>Ponta fina Sharpie</td><td>escreva o número da amostra na fita</td></tr></tbody></table>

um ensaio de competição de placa como uma rápida avaliação preliminar de supressão da doença

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

O objetivo era desenvolver e otimizar um bioensaio de simples, acessível e eficaz para detectar a capacidade supressora de doença de um composto específico contra soilborne fungo Rhizoctonia solani. R. solani é um patógeno de uma vasta gama de hospedeiros de planta em todo o mundo. O fungo sobrevive no solo como uma Saprófita e cresce rapidamente em meios de ágar água simples. O ensaio de placa é um método rápido para comparar compostos por sua capacidade de retardar o crescimento de r. solani. O ensaio também se correlaciona bem com a supressão de outros patógenos fúngicos soilborne que sobrevivem como saprófitas em solos como início definha Alternaria, murcha de Fusarium, podridão radicular de Phytophthora e Pythium podridão de raiz.

Adubo terminado deve ser estável e maduro, dois termos que frequentemente são utilizados indistintamente, portanto pode com segurança ser embalado e transportado e não causa efeitos adversos durante a sua utilização final4. Estabilidade é uma resistência à decomposição e geralmente é determinada usando índices de atividade microbiana. Medidas gerais da respiração microbiana podem medir a estabilidade de adubo, mas não necessariamente doença supressão de um...

Apresentado é um protocolo para um ensaio de competição de placa identificar se um adubo específico é susceptível de conter bactérias e fungos que inibem o crescimento de Rhizoctonia solani.

Um ensaio de competição de placa como uma rápida avaliação preliminar de supressão da doença

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave relacionadas ao controle biológico de patógenos vegetais transportados pelo solo. O padrão-ouro para testar materiais como adubo é ter um bioensaio vegetal para testar se é tóxico para as plantas. No entanto, isso leva três semanas.Este método pode ser feito em cerca de dois a três dias. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples, acessível e eficaz. Este ensaio é uma rápida triagem de composto específico para suprimir o crescimento da Rizoctonia solani.No entanto, este ensaio também pode ser usado contra outros patógenos vegetais transportados pelo solo, como Fusariums, Pythiums e Phytophthoras. A demonstração visual deste método é fundamental porque é preciso isolar e manter uma cultura pura de fungo, evitando a contaminação. Demonstrando o procedimento de isolamento será Taylor Readyhough, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.Emma Wright, uma estudante de graduação do meu laboratório, vai demonstrar o ensaio da competição. Para começar, semeie sementes de rabanete vermelho no solo conhecido por ter um histórico de doença causada por R.solani. Após três a quatro semanas, retire as mudas do solo e enxágue-as com água da torneira.Usando uma lâmina de barbear, corte segmentos de um centímetro do hipocotyl e raiz que tenham uma cor marrom. Em seguida, use fórceps esterilizados por chamas para mergulhar os segmentos em solução de alvejante de 10% por um minuto. Depois disso, enxágue os segmentos em água estéril.Em seguida, use fórceps esterilizados por chamas para transferir os segmentos para uma toalha de papel. Bata os segmentos secos, e transfira-os para uma placa de Petri com ágar de água. Coloque a placa de Petri dentro de um recipiente com tampa, e incubar os segmentos à temperatura ambiente.Para estabelecer uma cultura filha, transfira um dos segmentos para o centro de um prato fresco de dextrose de batata ágar. Depois disso, autoclave tubos de ensaio de 25 mililitros contendo 10 mililitros de água. Adicione duas amostras de 0,5 gramas de cada amostra de teste a um par de tubos de ensaio autoclaved com 10 mililitros de água estéril, e agite os tubos de ensaio durante a noite.Após 24 horas, adicione 1,5 gramas de ágar simples e 90 mililitros de água destilada a um par de frascos cônicos. Depois de autoclavar os frascos, coloque-os em um banho de água Celsius de 45 graus por 30 minutos. Em seguida, despeje a amostra de referência autoclavada e a amostra viva no ágar derretido.Despeje as misturas de cada frasco em cinco pratos de Petri. Para proteger os micróbios indígenas, é importante não adicionar o adubo enquanto o ágar estiver muito quente. Portanto, deixe o ágar esfriar a 45 graus Celsius antes de adicionar o adubo.Utilizando técnica asséptica, transfira peças de R.solani para cada par de placas de amostra. Em seguida, incubar as placas em temperatura ambiente por um a dois dias. Finalmente, use uma régua clara e plana e um microscópio estéreo para medir o raio do micélio em cada placa até o milímetro mais próximo.Neste protocolo, extratos de compostos vivos suprimiram significativamente mais o crescimento de R.solani do que amostras autoclavadas, demonstrando que o efeito era microbiano e não à base de nutrientes. A supressividade é medida como uma redução do crescimento em comparação com o controle autoclaved. O crescimento não foi afetado pela duração do amadurecimento ou cura do composto.O crescimento foi significativamente afetado pelo método de compostagem e ingredientes de receita, especificamente com vermicompost, processos de windrow e receitas com casca de madeira. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode ser candidata à certificação comercial de composto para propriedades supressivas de doenças.

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