Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular
6 de junho de 2019
Aqui, nós apresentamos uma aproximação combinatória usando a microscopia de alta resolução, as ferramentas computacionais, e a rotulagem da único-pilha em embriões vivos de C. elegans para compreender a única dinâmica da pilha durante o neurodevelopment.
Este protocolo permite o rastreamento eficiente de linhagens celulares e identidades em embriões vivos, ao mesmo tempo em que analisa morfologias celulares detalhadas, como axônios e dendritos no desenvolvimento de neurônios C.elegans. Em comparação com a microscopia confocal, microscopia de iluminação de plano seletiva de visão dupla ou diSPIM oferece maior sinal ao ruído, resolução espacial mais isotropica, e é mais adequado para imagens in vivo de longo prazo. Comece adicionando 500 microlitros de solução de 1%de metilcelulose na depressão de um slide de microscópio côncavo.
Usando uma picareta de fio de platina, transfira os adultos de uma placa média de crescimento nematoide para a solução de metilcelulose M9. Use as pontas afiadas de 18 agulhas hipodérmicas de calibre 18 para cortar cada animal transversalmente no corpo médio para pelo menos um a quatro embriões celulares. Com um bocal aspirador mantido suavemente entre os dentes, preenchia uma pipeta microcapilar com 10 a 15 microliters de tampão M9 e aspirar suavemente vários embriões do slide para o capilar.
Distribua os embriões no retângulo central da tampa de uma câmara de imagem de aço cheia de tampão M9 fresco. Oriente suavemente os embriões verticalmente para que o longo eixo de cada embrião seja perpendicular ao longo eixo da fenda. Em seguida, coloque a câmara de imagem de aço no suporte da amostra no estágio de um diSPIM.
Para preparar os embriões para imagem, abra o microgerencial e defina as intensidades de laser para 179 microwatts 0,5% de equivalência para 488 nanômetros e 79 microwatts 0,25% de equivalência para 561 nanômetros. A calibração entre o ajuste do software e a saída real do laser deve ser feita com antecedência, a fim de definir o escopo para microwatts específicos. No menu plugins, selecione o controle do dispositivo e aplique diSPIM de imagem científica para abrir a janela de microscopia de iluminação de plano de visão dupla invertida de imagem científica.
Na guia de aquisição, confirme se os parâmetros estão definidos como indicado. Sob a guia de foco automático, defina os parâmetros conforme indicado. Observe que o canal de foco automático deve especificar o canal de fluorescência nuclear para os experimentos de lineamento planejados.
Verifique as caixas de feixe e folha para o caminho A ou B e clique ao vivo para iniciar a aquisição da imagem. Uma janela de visualização ao vivo será aberta. Em seguida, desenhe uma caixa em torno do embrião de interesse para selecionar a região de análise de foco automático do embrião e clique em iniciar a captura de imagem multidimensional de longo prazo.
Para visualização de imagens, processamento e análise de linhagem celular, após baixar e extrair o pacote de software, clique duas vezes no arquivo CytoSHOW_app. jnlp para começar a executar CytoSHOW. No menu de arquivos, selecione o novo e diSPIM monitore micro gerenciador para localizar a pasta de conjunto de dados raiz onde as imagens brutas do micro gerenciador foram salvas.
Selecione qualquer pasta de ponto de tempo e clique em abrir. As janelas de navegação multidimensionais serão abertas automaticamente para SPIM A e SPIM B.Utilizando a ferramenta de seleção de polígonos, clique logo fora das bordas anterior, posterior, dorsal e ventral do embrião de interesse para gerar um padrão de gravata borboleta sobre o embrião nas visualizações SPIM A e SPIM B e clique em diSPIM. Alinhe os canais verde e vermelho para cada braço SPIM e clique novamente em diSPIM.
Os turnos serão acionados em todas as outras janelas de posição. Em seguida, clique em diSPIM e fusível para abrir a caixa de diálogo de volumes de dados brutos diSPIM e defina os parâmetros conforme indicado. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, clique em sim e especifique o diretório de saída para salvar os arquivos processados antes de clicar em OK. Na janela de visualização, mova a barra de t-scroll para o ponto de tempo dois da janela e mova o controle deslizante z até que a visão diretamente ao longo do eixo longo do embrião seja mostrada.
Mova a barra de rolagem t de volta para o ponto de tempo um na janela de pré-visualização e use a ferramenta de seleção de linha para desenhar uma linha do núcleo mais redondo do ventral através do plano das placas de metafase da célula AB. Clique no botão de visualização diSPIM para salvar os ajustes finos na orientação do volume visualizado. Defina as barras de t-scroll das janelas do monitor diSPIM para os pontos de tempo de partida e término do período completo de imagens para processar.
Em seguida, clique em OK. Para uma análise eficiente e precisa da linhagem celular, é fundamental obter uma orientação ADL precisa dos volumes de dados antes do processamento da Noite Estrelada. Para abrir a série de rastreamento de linhagem Starry Night no AceTree, abra o arquivo AceTree personalizado fornecido e selecione abrir o arquivo de configuração para localizar o diretório de saída indicado anteriormente. Abra a subpasta do fusível para o embrião de interesse e selecione o arquivo editado.
Em seguida, clique em abrir e proceder com a visualização e edição de linhagem como descrito anteriormente. Protocolos otimizados não induzem qualquer fototoxicidade detectável aos embriões avaliados pelo tempo de eclosão e pelo tempo relacionado aos marcos do desenvolvimento. Usando este protocolo como demonstrado, as células não identificadas nesta proteína fluorescente verde transgênica expressando tensão nematoide foram determinadas a corresponder aos neurônios motores, à célula do canal excretório e a duas células musculares.
Os neurônios identificados foram obliquamente moldados logo aos 360 minutos após a fertilização com o eixo celular mais longo representando o eixo subsequente para o crescimento de neurite. De 385 a 410 minutos após a fertilização, os neurites RMDD estenderam aproximadamente seis micrômetros anteriores aos corpos celulares. De 415 a 445 minutos após a fertilização, ambos os neurites estenderam dorsais dentro e ao redor do anel nervoso presunçoso.
Em média, cada neurite RMDD se estendia aproximadamente 11 micrômetros do corpo celular antes de atingir sincronizadamente sua contraparte contralateral no ápice do anel. Juntos, esses dados demonstram que as características de desenvolvimento neuronal para células identificáveis únicas são capazes de serem examinadas, comparadas e quantificadas usando este protocolo integrado. É importante lembrar de orientar verticalmente os embriões para que o longo eixo de cada embrião seja perpendicular ao longo eixo da fenda.
Usando este protocolo, começamos a explorar o sistema nervoso embrionário nascente de todos os ângulos. Por exemplo, durante o nascimento celular, migração e diferenciação, formação de neurita, crescimento e fasciculação.
Visão Geral
Este estudo apresenta uma abordagem combinatória que utiliza microscopia de alta resolução e ferramentas computacionais para analisar a dinâmica de células individuais durante o neurodesenvolvimento em embriões vivos de C. elegans.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Técnicas de Microscopia
Contexto
- Compreender o neurodesenvolvimento no nível de única célula é essencial para obter insights sobre a função neuronal.
- C. elegans atua como organismo modelo para o estudo da dinâmica celular durante o desenvolvimento.
- Técnicas de imagem de alta resolução aprimoram a capacidade de visualizar estruturas celulares.
- A marcação em nível de única célula permite o rastreamento preciso de linhagens e identidades celulares.
Objetivo do Estudo
- Rastrear linhagens e identidades celulares em embriões vivos de C. elegans.
- Analisar morfologias celulares detalhadas, como axônios e dendritos, em neurônios em desenvolvimento.
- Comparar a eficácia do diSPIM com a microscopia confocal tradicional.
Métodos Utilizados
- Preparação de embriões utilizando solução de metilcelulose para imagem.
- Utilização de microscopia de iluminação seletiva em plano invertido dual (diSPIM) para aquisição de imagens aprimorada.
- Aquisição e processamento de imagens usando software especializado.
- Análise de linhagem celular por meio de protocolos personalizados para minimizar a fototoxicidade.
Resultados Principais
- Identificação de neurônios motores e outros tipos celulares em linhagens transgênicas de C. elegans.
- Morfologias detalhadas de neurônios em desenvolvimento foram registradas ao longo do tempo.
- Padrões de crescimento dos neuritos foram quantificados, revelando características significativas do desenvolvimento.
- Protocolos otimizados demonstraram ausência de fototoxicidade detectável nos embriões.
Conclusões
- Este protocolo integrado permite um exame abrangente do desenvolvimento neuronal.
- Células individualizáveis únicas podem ser analisadas e comparadas de forma eficaz.
- Os achados contribuem para a compreensão dos processos neurodesenvolvimentais em C. elegans.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a obtenção de imagens de alta resolução e de longa duração do desenvolvimento neural em embriões de C. elegans, fornecendo resolução subcelular das morfologias neuronais e da dinâmica da linhagem celular. A integração do diSPIM com análise automatizada de linhagem celular apoia a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos, ao associar perturbações genéticas a resultados fenotípicos com resolução em nível de única célula. Essa confiança preditiva auxilia na priorização de hipóteses terapêuticas e na redução de ambiguidades em estágios iniciais de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da correlação entre identidades de linhagem celular e expressão gênica e dinâmicas morfológicas com resolução subcelular.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio do rastreamento preciso do desenvolvimento neuronal e dos padrões de crescimento de neuritos em embriões vivos.
- Confiabilidade Preditiva: Facilita a triagem de portfólios ao quantificar características neurodesenvolvimentais de células únicas identificáveis ao longo do tempo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho downstream ao gerar conjuntos de dados 4D isotrópicos com resolução de aproximadamente 330 nm em todas as dimensões.
- Reprodutibilidade: Permite fluxos de trabalho padronizados de imagem e processamento que minimizam a fototoxicidade e garantem um estadiamento desenvolvimental consistente.
- Saídas Quantitativas: Fornece medidas de extensão de neurites (por exemplo, neurites RMDD estendendo aproximadamente 11 micrômetros) para apoiar a avaliação confiável de compostos em triagens fenotípicas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Fornece um sistema relevante para doenças ao estudar processos neurodesenvolvimentais com relevância direta para a conectividade neuronal e formação de circuitos.
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao permitir a correlação entre linhagem celular e morfologia funcional em um modelo geneticamente manipulável.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de avançar ou não ao oferecer desvio preditivo de riscos por meio de perfis detalhados de morfodinâmica de subtipos neuronais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses na biologia inicial até a identificação de compostos líderes, onde leituras fenotípicas quantitativas orientam a triagem de compostos e estudos sobre o mecanismo de ação.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao associar linhagens celulares específicas (por exemplo, neurônios motores, canal excretor) a fenótipos neurodesenvolvimentais estruturais e funcionais.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de imagens padronizadas e reprodutíveis, permitindo a avaliação em larga escala de perturbações genéticas ou químicas na morfologia neuronal.
- Análises: Gera medidas quantitativas de variáveis dependentes, como comprimento de neuritos, cronologia do crescimento e padrões de fasciculação, que permitem comparações objetivas entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao estabelecer um padrão de referência para o neurodesenvolvimento normal, com o qual modelos de doenças podem ser comparados.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem e análise reutilizável, aplicável a estudos de embriogênese, expressão gênica e neurodesenvolvimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da redução da ambiguidade mecanicista em vias neurodesenvolvimentais.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de imagens 4D de alta resolução para estudos longitudinais.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar/interromper mais eficazes, maior eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados mediante desoneração fenotípica precoce.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, baseadas em métricas quantitativas e subcelulares do desenvolvimento neural.
Considerações de Implementação
- Requer experiência na preparação de amostras vivas, no alinhamento do diSPIM e na fusão de imagens multivisão para obter resolução isotrópica.
- Exige hardware de microscopia de iluminação seletiva em plano invertido dual (diSPIM) e calibração a laser para excitação consistente em 488 nm e 561 nm.
- Exige padronização entre equipes na orientação de embriões, nos parâmetros de aquisição em lapso de tempo e nos fluxos de pós-processamento (por exemplo, CytoSHOW, Starry Night, AceTree).
- Envolve considerações de adaptação ao transferir protocolos entre diferentes origens genéticas ou linhagens com marcadores fluorescentes.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de estadiamento preciso dos embriões e orientação vertical em relação ao eixo do lamínula para garantir o rastreamento preciso da linhagem.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:34
C. elegans Embryo Sample Mounting Preparation
1:48
Dual-View Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM) Embryonic Imaging
3:12
Isotropic High-Resolution Volumetric Data: Cell Lineage Analysis
6:06
Results: Representative Cellular Identification and Single Cell Characterization of Neurite Outgrowth Dynamics
7:43
Conclusion
