Visualizando neuroblasto Cytokinesis Durante C. elegans Embriogênese

Este protocolo descreve como as células em divisão imagem dentro de um tecido em Caenorhabditis elegans embriões. Embora vários protocolos descrevem como a divisão celular imagem no embrião precoce, este protocolo descreve como imagem divisão celular dentro de um tecido em desenvolvimento em meados embriogénese tardia.

O objetivo geral do experimento a seguir é observar a divisão de células dentro de um tecido em desenvolvimento durante a embriogênese C elegance. Para estudar genes que controlam a divisão celular, isso é conseguido criando ou obtendo uma cepa de C elgan que expressa de forma estável marcadores transgênicos que rotulam as células de interesse. Como segundo passo, derrube seletivamente um gene de interesse, alimentando D-S-R-N-A para larvas de L quatro por 24 a 48 horas.

Os embriões de RNAI são coletados de hermafroditas gráficos e transferidos para uma almofada aros para imagens ao vivo. Em seguida, usando microscopia de campo amplo ou confocal, embriões são fotografados para visualizar fenótipos de divisão celular. Os resultados mostrarão como os neuroblastos se dividem durante a embriogênese do sea elgin e o papel dos genes necessários para sua divisão.

Este método pode ajudar a revelar questões-chave no campo da biologia celular e do desenvolvimento. Por exemplo, este método pode revelar genes e mecanismos que estão envolvidos na regulação da mitose durante o desenvolvimento do tecido, comunicação celular celular, migração celular ou polaridade celular. Use vermes transgênicos que expressem os marcadores apropriados mantidos em placas de controle ou RNAI por 24 a 48 horas.

Escolha de quatro a seis adultos graves e transfira-os para 20 a 30 microlitros de tampão M nove em uma lâmina de depressão Para liberar os embriões, use um bisturi estéril, corte os vermes de cada lado da espermateca ou vulva. Em seguida, colete os embriões usando um capilar puxado, que é preso a um bulbo de pipeta e é largo o suficiente para passar os embriões. Transfira os embriões para uma almofada aros recém-preparada usando um cílio colado a um palito de dente.

Crie grupos de cinco a 10 embriões empurrando os embriões um ao lado do outro. Cubra a lâmina com uma lamínula e adicione mais tampão M nove, se necessário, em seguida, sele a lamínula com valla líquida pré-aquecida. Use um microscópio de campo amplo epifluorescente que inclua filtros automatizados.

Objetivas, uma câmera CCD de alta resolução e um palco altamente motorizado. Tudo controlado com software. Embora este sistema não os tenha, o uso de LEDs e um EMCD limitará a fototoxicidade ao embrião com baixa ampliação.

Concentre-se manualmente nos embriões para obter imagens do neuroblasto. Aumente a ampliação e escolha embriões submetidos a intercolação dorsal ou início ao fechamento ventral no microscópio de campo amplo. Escolha os filtros vermelhos GFP e Texas e determine os planos Z ideais no sistema de campo amplo.

Usar menos Zacks e menos pontos de tempo reduzirá a fototoxicidade também fechando a abertura para 30% e, se possível, diminuir a intensidade da luz reduzirá ainda mais a fototoxicidade. Como alternativa, use um microscópio confocal de campo varrido de varredura ao vivo ou um microscópio confocal de disco giratório com software que controla as objetivas dos lasers de varredura, câmera EMCD e uma platina altamente motorizada. Agora que as configurações de aquisição foram otimizadas, imagine os embriões no microscópio de campo amplo.

Recomenda-se filmar embriões de controle antes de embriões RNAI. Com o sistema de campo varrido. Defina os lasers 4 88 e 5 61 100 miliwatts para 40% de potência com uma fenda de 50 e um tempo de exposição de 300 milissegundos.

É importante observar que essas configurações serão diferentes para outros microscópios. Coloque a lâmina no microscópio e use uma objetiva de baixa ampliação para encontrar os embriões. Em seguida, mude para a objetiva de imersão em óleo de 60 ou 100 x.

Uma vez focado, colete 20 pilhas Z a 0,2 mícrons a cada dois minutos por um total de 10 minutos. O tempo de exposição provavelmente exigirá ajustes. A fototoxicidade deve ser considerada quando embriões de imagem vivos por microscopia fluorescente fecham a abertura, escolhendo menos Zacks ou pontos de tempo.

Diminuir o tempo de exposição pode limitar a fototoxicidade, se possível. O uso de um campo SW ou um microscópio confocal de disco giratório pode ajudar a melhorar esse problema. Determine seu tempo, pontos e planos Z de interesse usando o software de aquisição.

Exporte as imagens desejadas como várias tiffs. Abra os planos Z desejados para cada ponto de tempo e canal de interesse no software de processamento como o Image J e crie uma pilha de neuroblastos que geralmente abrange apenas alguns planos. Empilhe os planos Z para cada ponto de tempo e crie projeções de pilha Z.

Repita isso para canais adicionais. Depois que todas as projeções de Zack para os pontos de tempo desejados forem concluídas, abra as projeções para fazer uma sequência de tempo. Faça isso para cada canal separadamente.

Para cada canal, faça ajustes no brilho e no contraste conforme necessário. Gire as imagens, se necessário. Em seguida, selecione uma região de interesse e corte as imagens.

Agora faça uma imagem mesclada usando a função de canais mesclados. Selecionando uma cor diferente para cada canal. Salve a imagem mesclada como um arquivo RGB para visualizar as imagens com mais clareza.

Use as imagens TIFF de 16 bits e selecione a função inverter em editar para criar imagens em escala de cinza para cada canal. Para determinar o tamanho de um objeto de interesse para os mícrons, desenhe uma linha e multiplique seu comprimento pelo tamanho dos pixels, que é determinado pelos parâmetros de imagem. Agora, faça uma barra de escala que represente uma proporção do comprimento calculado em mícrons.

Por fim, salve as imagens finais como oito bits tiffs. Se desejar, converta os tiffs em filmes usando a imagem J epidérmica. A morfogênese da elegância C ocorre devido a uma combinação de alterações na forma das células epidérmicas, migração e adesão com a ajuda de neuroblastos proliferativos subjacentes.

As células epidérmicas migram para a linha média ventral e formam uma única camada de células para estudar embriões de divisão de neuroblastos, expressando de forma estável coex e marcador específico de neuroblastos marcado com GFP e um marcador de membrana impulsionado pela mãe marcado com m cherry foram fotografados durante o fechamento ventral em aumento de ampliação. Os neuroblastos foram visualizados em divisão, os núcleos dos neuroblastos são mostrados em verde e as membranas circundantes são mostradas em vermelho, as imagens de lapso de tempo do neuroblasto em divisão delineadas com a sonda de membrana mCherry em um embrião de controle foram capturadas usando um microscópio de campo amplo para visualizar melhor a divisão do neuroblasto nos embriões de controle. Cada canal foi mantido em escala de cinza e as imagens foram invertidas usando embriões de controle de microscopia confocal de campo varrido.

Coex expressando presunto um GFP e M Os mesmos embriões tratados com RNAI para derrubar uma expressão doente foram visualizados usando microscopia de campo amplo. Ao contrário dos embriões de controle, muitos neuroblastos pararam ou regrediram durante a divisão e tornaram-se multinucleados usando microscopia de campo varrido.

Também ficou claro que muitos neuroblastos pararam ou regrediram durante a divisão e se tornaram multinucleados. Essa técnica também pode ser usada para obter imagens de células migratórias durante a formação de tecidos. Além disso, se seus Zacks forem usados para permitir imagens mais rápidas, mais informações sobre a dinâmica subcelular podem ser obtidas.

Além disso, com o equipamento apropriado, essa técnica poderia ser usada para a ativação de sondas fotosintonizáveis para realizar optogenética. Além disso, técnicas de microscopia, como fret ou fret, podem ser aplicadas para estudar proteínas, interações proteicas ou dinâmica de proteínas.