Um método simples para o isolamento de aplicativo para análises de expressão de Gene transiente e protoplastas de soja

O objetivo geral deste método é obter células de protoplastos de alta qualidade da soja para examinar mecanismos regulatórios e de sinalização em células vivas de soja. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em redes reguladoras, como qual é seu gene alvo imediato, fator de transfusão aberto, e qual é seu parceiro de interação, abrir uma proteína. A principal vantagem dessa técnica é a arte.

Produz grandes quantidades de células uniformes de protoplastos de soja e é simples e fácil. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é muito difícil obter bons protoplastos das folhas de soja, a menos que você se unifolie em um estágio específico. A seleção de folhas em um estágio de desenvolvimento adequado é a chave para uma preparação bem-sucedida do protoplasto da soja.

Corte as folhas unifoliadas recém-expandidas de mudas de soja com 10 dias de idade. Para garantir que, quando uma amostra der um alto rendimento de protoplastos, colete pelo menos três amostras de folhas unifoliadas em estágios de desenvolvimento ligeiramente diferentes. Com uma lâmina de barbear nova, remova a nervura central de cada folha unifoliada e, em seguida, corte os restos em tiras de 0,5 a um milímetro.

Usando uma pinça, transfira suavemente as tiras de folhas imediatamente para 10 mililitros de solução enzimática recém-preparada em um tubo de 15 mililitros. Infiltre as tiras de folhas por 15 minutos em temperatura ambiente. Incubar as tiras de folhas na solução enzimática com agitação suave sob pouca luz durante quatro a seis horas à temperatura ambiente.

À medida que os protoplastos são liberados, a solução enzimática fica verde-amarelada. Verifique a solução de protoplasto enzimático ao microscópio com ampliação de 10x para selecionar a amostra com a melhor digestão de protoplasto. Os protoplastos liberados são de forma esférica, enquanto as células não digeridas têm formas irregulares ou ovais.

Para interromper a digestão, despeje suavemente os 10 mililitros de solução enzimática de protoplastos com a melhor digestão de protoplastos em um tubo de 50 mililitros e adicione 10 mililitros de solução W5 em temperatura ambiente. Inverta suavemente o tubo algumas vezes. Em seguida, despeje suavemente a solução de protoplasto enzimático em uma malha de náilon limpa de 75 mícrons colocada em cima de um tubo de 50 mililitros para remover os tecidos foliares não digeridos.

Em seguida, centrifugue o fluxo através da solução enzimática de protoplastos a 100 vezes G por um a dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para remover suavemente o sobrenadante sem perturbar o pellet de protoplasto. Ressuspender o protoplasto em solução W5 gelada e manter o tubo de 50 mililitros no gelo.

Depois de contar o número de protoplastos em um hemocitômetro ao microscópio, diluir até uma concentração de duas vezes 10 elevado ao quinto protoplastos por mililitro em solução W5 resfriada. Mantenha o protoplasto no gelo por 30 minutos. Centrifugar a suspensão a 100 vezes G durante um a dois minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, use uma pipeta de um mililitro para remover suavemente a solução W5 sem perturbar o pellet de protoplasto. Ressuspender o protoplasto em solução de MMG à temperatura ambiente a uma concentração de duas vezes 10 elevado ao quinto protoplasto por mililitro. Para preparar o protoplasto para transformação, use pontas de pipeta de 200 microlitros não cortadas para fazer alíquotas de 100 microlitros de protoplastos em tubos de microcentrífuga de baixa adesão de 1,5 mililitro.

Separe uma alíquota para servir como controle negativo. À alíquota restante de protoplastos, adicione 10 microlitros de DNA de plasmídeo. Adicione lentamente 110 microlitros de solução de pino recém-preparada na parede interna do tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Em seguida, inverta e gire suavemente o tubo até que a solução fique homogênea. Incubar as misturas de transformação durante 15 minutos à temperatura ambiente. Para interromper a transformação, adicione lentamente 400 microlitros de solução W5 a cada tubo de 1,5 mililitro à temperatura ambiente e inverta suavemente o tubo até que a solução se torne homogênea.

Centrifugue os tubos a 100 vezes G por um a dois minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante. Adicione um mililitro de solução WI a cada tubo.

Cubra a superfície do poço de uma placa de cultura de tecidos de seis poços para evitar que os protoplastos grudem na placa. Adicione um mililitro de soro de bezerro estéril a cinco por cento em cada poço e, após alguns segundos, remova o soro de bezerro usando uma pipeta. Transfira os protoplastos ressuspensos para os poços da placa de cultura e cubra a placa com uma tampa.

Antes da colheita, incubar os protoplastos à temperatura ambiente durante dois dias no escuro. Após dois dias, transfira a solução de protoplasto para um tubo de microcentrífuga de baixa adesão de 1,5 mililitro. Centrifugue os tubos a 100 vezes G por um a dois minutos à temperatura ambiente.

Remova o sobrenadante usando uma pipeta. Transfira 10 microlitros de protoplasto para uma lâmina de vidro. Observe os sinais fluorescentes sob fluorescência ou microscopia confocal usando protoplastos não transformados como controle negativo.

As células de protoplastos foram preparadas a partir de diferentes órgãos de soja com 10 dias de idade e observadas ao microscópio. As paredes celulares hipocaudal e epicaudal foram dificilmente digeridas. E algumas células permaneceram ligadas umas às outras.

No chumbo caudal e na raiz, as paredes celulares foram removidas apenas em uma pequena porção das células. Em contraste, um grande número de protoplastos foi observado quando o unifoliado foi usado. As mudas nesta foto da esquerda para a direita ilustram folhas unifoliadas que não estão expandidas, apenas expandidas ou totalmente expandidas.

Enquanto as folhas unifoliadas não expandidas e apenas expandidas resultaram em altos rendimentos de protoplastos, o tamanho dos protoplastos do unifoliado recém-expandido foi mais uniforme do que o unifoliado não expandido. Para o unifoliado totalmente expandido, as paredes celulares ainda estavam intactas na maioria das células. O teste de uma variedade de quantidades diferentes de DNA plasmidial sugeriu que quantidades maiores de DNA resultaram em maior eficiência de transformação.

Imagens confocais de protoplastos de soja transformados com a construção que expressa GFP fundida ao gene E1 específico da leguminosa, mostraram localização nuclear da proteína de fusão E1 GFP, consistente com o estudo anterior usando o sistema de protoplastos Arabidopsis. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de otimizar cada condição experimental empiricamente, como a seleção do estágio correto do material foliar, a duração do tempo de digestão da parede celular, a idade da concentração e a quantidade de DNA plasmidial para transformação. Após este procedimento, outros métodos, como replicação de RNA e proteínas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais genes ou quais proteínas são reguladas ou não regulamentadas?

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter células de protoplasto de soja de alta qualidade.