Name: Um método simples para o isolamento de aplicativo para análises de expressão de Gene transiente e protoplastas de soja (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a preparar protoplastos de soja em grandes quantidades para estudar mecanismos regulatórios e de sinalização em células vivas. Este método simples utiliza digestão enzimática de folhas unifoliadas em estágio específico.

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Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa do genoma de plantas da National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).

1. o crescimento das plantas
<ol><li>5-10 sementes de soja (82 Williams) em uma panela de 13 cm em estufa sob condições de longo-dia (16 h de luz em 1.500 µmol m-2 s-1) a 25 ° C, a mistura de solo personalizada da porca para soja (a 1: proporção de 1:1 de areia do solo, perlite e torpedo).</li>
</ol>2. preparação do ADN do plasmídeo
<ol><li>Usando a ponta da pipeta estéril ou palito de dente, escolher uma única colônia ou estoque de glicerol congelados de Escherichia coli , carregando o plasmídeo contendo o gene de interesse e inoculá-lo em 20 mL de meio líquido de Luria-Bertani (LB) com antibióticos apropriados em um balão de 50 mL.</li>
	<li>Incube o frasco a 37 ° C durante a noite em uma coqueteleira. Recolha as bactérias por centrifugação a suspensão a 12.000 x g, à temperatura ambiente por 5 min e descartar o sobrenadante. Extrair e purificar o plasmídeo seguindo o procedimento do fabricante de um kit de preparação do plasmídeo.</li>
</ol>3. isolamento de protoplastos
<ol><li>Corte recém-expandido unifoliate folhas de plântulas de soja 10 dias de idade (Figura 1). Nota: A seleção das folhas em uma fase do desenvolvimento é a chave para o sucesso de preparação de protoplastos de soja. Só use folhas apenas expandidas em estágios iniciais do desenvolvimento. Como folhas maduras, paredes celulares tornam-se mais difícil de digerir.</li>
	<li>Com uma lâmina de barbear fresca, retire a nervura central da folha unifoliate e em seguida, corte os restos em 0,5-1 mm tiras. Nota: Duas folhas unifoliate digeridas em 10 mL de solução de enzima dará protoplastas suficientes para mais de 10 transformações.</li>
	<li>Usando um par de pinças, transferência a folha retira imediatamente e suavemente em 10 mL de solução recentemente preparada de enzima (tabela 1) em um tubo de 15 mL. Vácuo infiltrar a folha tiras para 15 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incube as tiras de folha na solução enzimática com agitação suave (40 rpm) sob condições de pouca luz para 4-6 h à temperatura ambiente. Certifique-se de que a solução de enzima ficar verde-amarelo, como os protoplastas são liberados. Verifique se a solução de enzima/protoplastas sob o microscópio (X10). Nota: Os protoplastas lançados são esféricos, enquanto as células não digeridas tem forma oval ou irregular.</li>
	<li>Transferir a 10 mL da solução de enzima/protoplastos em um tubo de 50ml derramando suavemente e adicionar 10 mL de solução de W5 (tabela 1) à temperatura ambiente para parar a digestão. Inverta o tubo suavemente várias vezes. Despeje delicadamente a solução enzimática/protoplastas em uma malha de nylon limpo 75 µm colocada em cima de um tubo de 50 mL para remover os tecidos da folha não digerido.</li>
	<li>Centrifugue a solução de fluxo através da enzima/protoplastas em 100 g de x no tubo de 50 mL por 1-2 min à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta sorológica 10ml sem perturbar o sedimento de protoplastos.</li>
	<li>Ressuspender os protoplastas e diluir para uma concentração de 2 x 105 mL-1 , na solução de W5 refrigerada a 4 ° C, contando número de protoplastos em um hemacytometer sob o microscópio (x10). Manter os protoplastas no gelo por 30 min.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de 100 g de x para 1-2 min à temperatura ambiente e remova cuidadosamente a solução W5 usando uma pipeta de 1ml sem perturbar o sedimento de protoplastos. Ressuspender os protoplastas em solução MMG (tabela 1) na concentração de 2 x 105 mL-1 , à temperatura ambiente.</li>
</ol>4. transformação de protoplastos
<ol><li>Faça 100 alíquotas µ l de protoplastas (2 x 104 protoplastas em 2 x 105 mL-1) em tubos de microcentrifuga de baixa adesão de 1,5 mL usando sem cortes pontas de pipetas 200 µ l. Colocar uma alíquota de lado para servir como controle negativo. Adicione 10 µ l de plasmídeo (10-20 µ g) em cada uma das parte alíquota do resto dos protoplastas.</li>
	<li>Lentamente, adicionar 110 µ l de solução recentemente preparada de PEG (tabela 1) na parede interna do tubo de microcentrifuga de 1,5 mL e depois inverta suavemente e rodar o tubo até que a solução se torne homogênea.</li>
	<li>Incube a mistura de transformação à temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Para parar a transformação, lentamente adicione 400 µ l de solução W5 no tubo de 1,5 mL à temperatura ambiente e inverta suavemente o tubo até que a solução se torne homogênea. Centrifugar o tubo a 100 g para 1-2 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de solução WI (tabela 1) para o tubo e ressuspender delicadamente pipetando 1 - 2 vezes. Adicione 1 mL de soro de 5% (vol/vol) bezerro estéril em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 6-poços para revestir a superfície e evitar os protoplastas de degola para a placa.</li>
	<li>Após alguns segundos, descarte o soro de vitela com uma pipeta. Transferi os protoplastas ressuspensão em um poço da placa de cultura. Cubra o prato com uma tampa.</li>
</ol>5. protoplastos incubação e colheita
<ol><li>Incube os protoplastas à temperatura ambiente durante 1-2 dias no escuro. Nota: Achamos que dois dias de incubação rende mais forte sinal de proteína fluorescente, em geral, em relação à incubação de um dia, e que o sinal de proteína fluorescente pode durar até 3-4 dias.</li>
	<li>Transferi a solução de protoplastos para um tubo de microcentrifugadora de baixa adesão de 1,5 mL. Centrifugar o tubo a 100 x g por 1-2 min à temperatura ambiente a colheita protoplastas. Remover o sobrenadante com uma pipeta e transferir 10 protoplastas µ l numa lâmina de vidro.</li>
	<li>Observe o sinal fluorescente sob fluorescência ou microscopia confocal. Use protoplastas não-transformadas como controlo negativo (nenhum sinal deve ser observado).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Este protocolo para a isolação de protoplastas de soja e o aplicativo para estudos de expressão transiente tem sido exaustivamente testado e funciona muito bem em nosso laboratório. Os procedimentos são simples e fáceis e exigem equipamento normal e custo mínimo. Nosso protocolo produz grandes quantidades de protoplastas uniforme, de alta qualidade em comparação com métodos anteriormente relatados34,35,36,<sup class="...

Protoplastas são células vegetais que possuem paredes celulares removidas. Como eles mantêm a maioria dos recursos e atividades das células vegetais, protoplastas são um bom modelo sistema para observar e avaliar diversos eventos celulares e são ferramentas valiosas para estudar a hibridação somática1 e regeneração2da planta. Protoplastas tem sido também amplamente utilizados para planta transformação3,4,5, desde paredes celulares caso contrário iria bloquear a passagem de DNA para a célula. Protoplastas de possuam algumas das respostas fisiológicas e processos celulares de plantas intactas, oferecendo, portanto, o valor fundamental na pesquisa básica para estudar a localização Subcellular da proteína6,7,8, de9,de interações proteína-proteína10e o promotor atividade11,12,13 em células vivem.
O isolamento dos protoplastas de planta foi primeiramente relatado em 196014 e os protocolos para isolamento e transformação de protoplastas foram desenvolvidos e optimizados. Um procedimento padrão de isolamento de protoplastos envolve o corte de folhas e digestão enzimática das paredes celulares, seguido de separação de protoplastas lançados de restos de tecido não-digeridos. Estratégias de transformação inclui electroporation15,16, microinjeção17,18e baseadas em polietileno glicol (PEG)4,5,19 métodos. Uma grande variedade de espécies têm sido relatados bem sucedida para o isolamento de protoplastos, incluindo cítricas20, Brassica21, Solanaceae22 e outras famílias de plantas ornamentais23,24. Enquanto o tecido diversos tipos são usados em várias espécies, um sistema de expressão transiente em protoplastos de mesofilo de Arabidopsis (TEAMP) isolado de folhas da planta modelo Arabidopsis thaliana tem sido bem estabelecida25 e amplamente adotado para diversas aplicações.
Feijão de soja (Glycine max (L.) Merr.) é uma das mais importantes proteínas e óleo para as culturas26. Ao contrário de Arabidopsis e arroz, obtenção de plantas transgênicas de soja é conhecido por ser um pouco difícil e baixa eficiência. Agrobacterium tumefaciens-mediada por infiltração foi usada popularmente para estudos de expressão transiente gene nas células epidérmicas em tabaco27 e mudas em Arabidopsis28,29, Considerando que Agrobacterium rhizogenes tem sido usado para transformação de raízes peludas na soja30. Abordagens de silenciamento de gene induzida por vírus têm sido utilizadas para downregulation de alvo genes31,32 e transiente expressão33 de forma sistêmica. Protoplastas fornecem uma alternativa valiosa e versátil para essas abordagens. Protoplastas podem ser obtidos de materiais na superfície do feijão de soja e permitam a expressão do transgene rápida e sincronizada. No entanto, desde o isolamento de sucesso inicial de protoplastas de soja no 198334, houve limitados relatórios sobre a aplicação da protoplastas em soja35,36,37, 38, principalmente devido à relativamente baixos rendimentos de protoplastas de soja.
Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficiente para o isolamento de protoplastas de soja e sua aplicação para estudos de expressão transiente de gene. Usando o jovens unifoliate folhas de plântulas de soja, fomos capazes de obter grandes quantidades de protoplastas vitais dentro de algumas horas. Além disso, otimizamos a um método de transformação de PEG-cálcio-mediada que é simples e de baixo custo para entregar o DNA nas protoplastas de soja com alta eficiência.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Celulase CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>CELULASE "ONOZUKA" R-10</td><td>Bateria</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>Polegada</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>ICN Biomedicals</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>malha de nylon</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Tecidos</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Barbear</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>hemacitômetro</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>kit de minipreparação de plasmídeo EZNA</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810</td><td>eppendorf</td><td>5811000827</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5424</td><td>eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Controlador de pipeta</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal Zeiss 710</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Antiaderente, Tubos de Microfuga sem RNase, 1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga de 15 mL</td><td>Denville</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga de 50 mL Denville</td><td></td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Bezerro Recém-Nascido</td><td>Thermo Scientific</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Perlita de berçário</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpedo Sand</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox (Pó)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

um método simples para o isolamento de aplicativo para análises de expressão de gene transiente e protoplastas de soja

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Feijão de soja (Glycine max (L.) Merr.) é uma espécie de cultura importante e tornou-se um modelo de vegetal para os estudos das vias genéticas e bioquímicas. Portanto, é importante estabelecer um sistema de expressão de gene transiente eficiente em soja. Aqui, nós relatamos um protocolo simples para a preparação de protoplastas de soja e sua aplicação para análises funcionais transitórias. Nós achamos que o jovens unifoliate folhas de plântulas de soja resultaram em grandes quantidades de protoplastas de alta qualidade. Otimizando um método de transformação PEG-cálcio-mediada, atingimos a eficiência elevada de transformação usando protoplastas de unifoliate de soja. Este sistema fornece um modelo eficiente e versátil para exame dos complexos mecanismos de regulamentação e sinalização em células vivas de soja e pode ajudar a melhor compreender diversos processos celulares, fisiológicos e de desenvolvimento das leguminosas.

Diferentes órgãos de soja 10 dia de idade foram testados para a preparação de protoplastos (Figura 1) e rendimentos foram observados ao microscópio (Figura 2). Paredes celulares do hypocotyl e epicotyl foram mal digeridas, e algumas células ficaram anexadas ao outro (Figura 2B, 2C). No cotilédone (Figura 2D) e raiz (Figura 2A</strong...

Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente para a preparação de grandes quantidades de protoplastas de soja estudar mecanismos complexos regulatórios e sinalização em células vivas.

Um método simples para o isolamento de aplicativo para análises de expressão de Gene transiente e protoplastas de soja

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

O objetivo geral deste método é obter células de protoplastos de alta qualidade da soja para examinar mecanismos regulatórios e de sinalização em células vivas de soja. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em redes reguladoras, como qual é seu gene alvo imediato, fator de transfusão aberto, e qual é seu parceiro de interação, abrir uma proteína. A principal vantagem dessa técnica é a arte.Produz grandes quantidades de células uniformes de protoplastos de soja e é simples e fácil. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é muito difícil obter bons protoplastos das folhas de soja, a menos que você se unifolie em um estágio específico. A seleção de folhas em um estágio de desenvolvimento adequado é a chave para uma preparação bem-sucedida do protoplasto da soja.Corte as folhas unifoliadas recém-expandidas de mudas de soja com 10 dias de idade. Para garantir que, quando uma amostra der um alto rendimento de protoplastos, colete pelo menos três amostras de folhas unifoliadas em estágios de desenvolvimento ligeiramente diferentes. Com uma lâmina de barbear nova, remova a nervura central de cada folha unifoliada e, em seguida, corte os restos em tiras de 0,5 a um milímetro.Usando uma pinça, transfira suavemente as tiras de folhas imediatamente para 10 mililitros de solução enzimática recém-preparada em um tubo de 15 mililitros. Infiltre as tiras de folhas por 15 minutos em temperatura ambiente. Incubar as tiras de folhas na solução enzimática com agitação suave sob pouca luz durante quatro a seis horas à temperatura ambiente.À medida que os protoplastos são liberados, a solução enzimática fica verde-amarelada. Verifique a solução de protoplasto enzimático ao microscópio com ampliação de 10x para selecionar a amostra com a melhor digestão de protoplasto. Os protoplastos liberados são de forma esférica, enquanto as células não digeridas têm formas irregulares ou ovais.Para interromper a digestão, despeje suavemente os 10 mililitros de solução enzimática de protoplastos com a melhor digestão de protoplastos em um tubo de 50 mililitros e adicione 10 mililitros de solução W5 em temperatura ambiente. Inverta suavemente o tubo algumas vezes. Em seguida, despeje suavemente a solução de protoplasto enzimático em uma malha de náilon limpa de 75 mícrons colocada em cima de um tubo de 50 mililitros para remover os tecidos foliares não digeridos.Em seguida, centrifugue o fluxo através da solução enzimática de protoplastos a 100 vezes G por um a dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para remover suavemente o sobrenadante sem perturbar o pellet de protoplasto. Ressuspender o protoplasto em solução W5 gelada e manter o tubo de 50 mililitros no gelo.Depois de contar o número de protoplastos em um hemocitômetro ao microscópio, diluir até uma concentração de duas vezes 10 elevado ao quinto protoplastos por mililitro em solução W5 resfriada. Mantenha o protoplasto no gelo por 30 minutos. Centrifugar a suspensão a 100 vezes G durante um a dois minutos à temperatura ambiente.Em seguida, use uma pipeta de um mililitro para remover suavemente a solução W5 sem perturbar o pellet de protoplasto. Ressuspender o protoplasto em solução de MMG à temperatura ambiente a uma concentração de duas vezes 10 elevado ao quinto protoplasto por mililitro. Para preparar o protoplasto para transformação, use pontas de pipeta de 200 microlitros não cortadas para fazer alíquotas de 100 microlitros de protoplastos em tubos de microcentrífuga de baixa adesão de 1,5 mililitro.Separe uma alíquota para servir como controle negativo. À alíquota restante de protoplastos, adicione 10 microlitros de DNA de plasmídeo. Adicione lentamente 110 microlitros de solução de pino recém-preparada na parede interna do tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Em seguida, inverta e gire suavemente o tubo até que a solução fique homogênea. Incubar as misturas de transformação durante 15 minutos à temperatura ambiente. Para interromper a transformação, adicione lentamente 400 microlitros de solução W5 a cada tubo de 1,5 mililitro à temperatura ambiente e inverta suavemente o tubo até que a solução se torne homogênea.Centrifugue os tubos a 100 vezes G por um a dois minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante. Adicione um mililitro de solução WI a cada tubo.Cubra a superfície do poço de uma placa de cultura de tecidos de seis poços para evitar que os protoplastos grudem na placa. Adicione um mililitro de soro de bezerro estéril a cinco por cento em cada poço e, após alguns segundos, remova o soro de bezerro usando uma pipeta. Transfira os protoplastos ressuspensos para os poços da placa de cultura e cubra a placa com uma tampa.Antes da colheita, incubar os protoplastos à temperatura ambiente durante dois dias no escuro. Após dois dias, transfira a solução de protoplasto para um tubo de microcentrífuga de baixa adesão de 1,5 mililitro. Centrifugue os tubos a 100 vezes G por um a dois minutos à temperatura ambiente.Remova o sobrenadante usando uma pipeta. Transfira 10 microlitros de protoplasto para uma lâmina de vidro. Observe os sinais fluorescentes sob fluorescência ou microscopia confocal usando protoplastos não transformados como controle negativo.As células de protoplastos foram preparadas a partir de diferentes órgãos de soja com 10 dias de idade e observadas ao microscópio. As paredes celulares hipocaudal e epicaudal foram dificilmente digeridas. E algumas células permaneceram ligadas umas às outras.No chumbo caudal e na raiz, as paredes celulares foram removidas apenas em uma pequena porção das células. Em contraste, um grande número de protoplastos foi observado quando o unifoliado foi usado. As mudas nesta foto da esquerda para a direita ilustram folhas unifoliadas que não estão expandidas, apenas expandidas ou totalmente expandidas.Enquanto as folhas unifoliadas não expandidas e apenas expandidas resultaram em altos rendimentos de protoplastos, o tamanho dos protoplastos do unifoliado recém-expandido foi mais uniforme do que o unifoliado não expandido. Para o unifoliado totalmente expandido, as paredes celulares ainda estavam intactas na maioria das células. O teste de uma variedade de quantidades diferentes de DNA plasmidial sugeriu que quantidades maiores de DNA resultaram em maior eficiência de transformação.Imagens confocais de protoplastos de soja transformados com a construção que expressa GFP fundida ao gene E1 específico da leguminosa, mostraram localização nuclear da proteína de fusão E1 GFP, consistente com o estudo anterior usando o sistema de protoplastos Arabidopsis. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de otimizar cada condição experimental empiricamente, como a seleção do estágio correto do material foliar, a duração do tempo de digestão da parede celular, a idade da concentração e a quantidade de DNA plasmidial para transformação. Após este procedimento, outros métodos, como replicação de RNA e proteínas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais genes ou quais proteínas são reguladas ou não regulamentadas?Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter células de protoplasto de soja de alta qualidade.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo mostra um procedimento para isolar protoplastos intactos a partir de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis. Dado que o protoplastos isolados permanecem intactos por pelo menos 96h e são isoladas de mudas, em vez de um mês de idade plantas maduras, esse procedimento agiliza ensaios exigindo protoplastos intactos.

Isolamento de Protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis thaliana</em

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Aprenda a preparar protoplastos de soja em grandes quantidades para estudar mecanismos regulatórios e de sinalização em células vivas. Este método simples utiliza digestão enzimática de folhas unifoliadas em estágio específico.

Um método simples para o isolamento de aplicativo para análises de expressão de Gene transiente e protoplastas de soja

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