Uso de Imunoensaios de Eletroforese Capilar para Procurar Potenciais Biomarcadores de Esclerose Lateral Amiotrófica em Plaquetas Humanas

Este protocolo pode ser usado para otimizar as concentrações de proteínas e anticorpos primários em uma única placa de ensaio, e para realizar dois ensaios usando uma única preparação amostral. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que 2 dias e meio de trabalho de laboratório, incluindo análise de dados, sejam concluídos em 3 horas e meia. Esta técnica fornece um alto formato de ensaio de rendimento para o desenvolvimento de um biomarcador baseado em sangue para ELA e é um método ideal para a realização de grandes ensaios clínicos.

Este método pode fornecer insights sobre perfis de proteínas-alvo durante o prognóstico da doença e pode facilitar o monitoramento dos efeitos de drogas de ensaios clínicos interessantes. Após a coleta de 100 microliters de plaquetas humanas de pacientes com ELA e indivíduos saudáveis, preencha os modelos gerados internamente para o layout capilar e preparação da amostra. A tabela de preparação da mistura de amostras é dinâmica e calculará automaticamente quanto volume deve ser removido da fonte.

Coloque todos os reagentes de ensaio no gelo. Exceto o pacote padrão, que deve permanecer em temperatura ambiente. Para preparar a mistura mestre fluorescente, adicione 40 microliters de água deionizada a um tubo claro de DTT e adicione 20 microliters de tampão de amostra de 10X.

E 20 microliters da solução de 400 mililitros de DTT preparada para o tubo rosa do kit de ensaio. Para preparar a escada biotinilada, adicione 16 microliters de água deionizada, dois microliters de tampão de amostra de 10X e dois microliters da solução de 400 mililitros de DTT preparadas para o tubo branco fornecido no kit. Após uma mistura suave, transfira a solução de escada para um tubo PCR de 200 microliter antes de desnaturar.

Adicione 1,5 microliters de tampão de amostra de 10X e 148,5 microliters de água deionizada a um tubo de microcentrífuga de 600 microlitres e vórtice para misturar, antes de colocar o tubo no gelo. Adicione os anticorpos de interesse diretamente ao diluído como indicado na tabela e lave a ponta da pipeta várias vezes em uma solução homogênea de anticorpos. Para preparar a mistura de amostras capilares, abra todos os tubos PCR e adicione 1,6 alíquotas de microliter de tampão de amostra fluorescente 5X a cada tubo, conforme indicado na tabela usando uma técnica de pipetação reversa.

Fechando imediatamente cada tubo à medida que o buffer é adicionado. Quando todo o buffer tiver sido adicionado, abra todos os tubos e adicione um buffer de amostra de 0,1X em volumes conforme indicado na tabela, fechando imediatamente cada tubo à medida que o buffer é adicionado. Em seguida, abra todos os tubos e adicione as amostras de proteínas conforme indicado na tabela e feche imediatamente cada tampa do tubo.

Quando todas as amostras tiverem sido adicionadas, centrifufique brevemente todos os tubos em uma centrífuga de bancada. Vórtice para misturar e centrifugar as amostras novamente. No final da segunda centrifugação, coloque todos os tubos em um termociclador com uma tampa aquecida.

E desnaturar as amostras sob as condições indicadas. No final da desnaturação, centrífuga, misture e centrifugar as amostras novamente e coloque todos os tubos em um rack de tubos no gelo. Usando a figura como guia, adicione 10 microliters de peroxidase de rabanete streptavidin ao poço D1, 10 microlitres do anticorpo secundário apropriado para poços D2 a D5, 10 microliters de anticorpos diluidores para cada poço na linha B e para bem C1, 10 microliters do anticorpo primário apropriado para poços C2 a C25, cinco microliters de escada biotinilada do tubo PCR número um para bem A1 , três microliters de amostra para linhas A2 a A25 e 15 microliters de peróxido de luminol recém-preparado para cada poço de linha E.Pipetting a mistura de amostra e o reagente no poço minúsculo nas ordens corretas é fundamental para o sucesso do experimento, por isso deve ser feito com muito cuidado.

Em seguida, adicione 500 microliters de tampão de lavagem a cada bem-tampão de lavagem designado. E girar o conteúdo da placa por centrifugação. Para realizar a análise capilar na placa de ensaio, conecte o analisador capilar ao sistema on-line e clique em Instrumento e Conecte-se no software analisador.

Selecione o número de série do instrumento no menu pop-up e clique em Conectar. Selecione a guia Ensaio e selecione Novo ensaio, digite os parâmetros do ensaio e salve o nome e o local do arquivo. Em seguida, confirme que o indicador azul piscando no analisador é um azul sólido e remova o cartucho capilar de sua embalagem.

Remova o selo protetor da placa de ensaio e observe visualmente os poços pré-preenchidos para bolhas de ar. Coloque a placa de ensaio no porta-aduto e segurando o cartucho capilar em um ângulo, insira o cartucho na ranhura capilar e feche a porta do analisador. Em seguida, clique em Iniciar no software analisador.

O uso de uma mistura inteira de plaquetas no ensaio pode reduzir a intensidade do sinal das proteínas alvo e contribuir para um sinal de fundo elevado. Portanto, neste ensaio, o supernanato claro foi usado após a ruptura das plaquetas. Uma faixa dinâmica linear para a concentração de proteína citosol plaqueta foi estabelecida em 0,2 a 0,8 miligramas por mililitro, e um modelo de ensaio foi adotado para que tanto a concentração de proteína quanto a titulação do anticorpo primário pudessem ser realizadas em um único ensaio.

O perfil de detecção de faixa dinâmica de alta dinâmica oferece um alcance dinâmico significativamente mais amplo devido à maior sensibilidade do ensaio capilar, resultando em uma melhor detecção e quantificação sobre uma faixa de concentração amostral maior. Os tempos de exposição individual também podem ser definidos. Utilizando as condições de ensaio otimizadas, esta análise das frações citossócidas plaquetárias obtidas de pacientes com ELA utilizando dois conjuntos de anticorpos permite a identificação de TDP-43 específico da doença e sua derivada fosfoilada dentro das amostras.

O TDP-43 total poderia então ser quantificado usando a curva de calibração. E as variabilidades do ensaio intra e inter-executado foram testadas em frações citosócidas de plaquetas humanas. Este método permite o uso de anticorpos primários, facilitando a identificação de até cinco proteínas alvo diferentes dentro da mesma amostra em um único ensaio.

Essa técnica não só reduz substancialmente o tempo de análise da proteína, como requer volumes amostrais de microliter e gera resultados com alto grau de reprodutibilidade. Alguns dos produtos químicos utilizados neste ensaio e todas as amostras humanas são considerados biohazardous, por isso os equipamentos de proteção individual apropriados devem ser sempre usados na realização desses experimentos.