Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Esses métodos permitem uma avaliação rápida sobre se uma manipulação experimental, proteína causadora de doenças ou RNA podem impactar processos sinápticos e se compostos terapêuticos podem restaurar a função. Essas técnicas fornecem uma leitura confiável da função sináptica de um grupo de neurônios em um período relativamente curto de tempo em comparação com a eletrofisiologia. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer doença de desenvolvimento neuronal ou degeneração.

Isso funciona bem para culturas neuronais de roedores primários, e para neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas. Para começar, otimize as configurações de aquisição de imagens usando o software de aquisição de imagens confocal. Mantenha o tempo de exposição de energia de excitação, o ganho do detector e a taxa de quadros constantes em todas as amostras.

Para imagens de lapso de tempo, selecione uma proporção de 512 por 512 e uma taxa de quadros de duas imagens por segundo para minimizar o branqueamento de corantes. Em seguida, selecione as combinações de excitação de fluorescência, dicroica e filtro de emissão para GCaMP seis M/GCaMP três com Fitzy e corante estearoyl com Trixi. Para evitar o drift Z durante a imagem de lapso de tempo, use o recurso de foco perfeito do software de aquisição de imagens confocal.

Em seguida, selecione a guia de tempo no painel de aquisição de imagens. Para a fase um, defina o intervalo de 500 milissegundos e a duração de três a cinco minutos. E para a fase dois, definir intervalo de 500 milissegundos e duração, cinco minutos.

Em seguida, para montar o aparelho de perfusão de gravidade para fluido cerebrospinal artificial ou ACSF, carregue o alto tampão de cloreto de potássio ACSF em uma seringa de 50 mililitros na parte superior do aparelho e defina a taxa de fluxo para um mililitro por minuto. Em seguida, carregue um prato de vidro de 35 mililitros contendo neurônios no estágio de imagem confocal com a extremidade da tubulação de perfusão colocada na borda do prato e escolha o campo para a imagem. 48 horas após a transfecção, incubar os neurônios cortical ou motor primários no tampão ACSF de cloreto de potássio baixo por 10 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, remova o tampão por aspiração e usando uma pipeta, carregue os neurônios no escuro em uma placa de Petri de fundo de vidro preenchida com ACSF contendo 50 milimolars de cloreto de potássio e 10 Micro corante de estiling molal. Após cinco minutos, remova a solução de carregamento e banhe os neurônios em baixo tampão de cloreto de potássio ACSF a 37 graus Celsius por 10 minutos para eliminar o carregamento de corante não específico. Em seguida, coloque o prato sobre o estágio de imagem do microscópio confocal invertido e observe as células sob um objetivo de 20 vezes o ar ou 40 vezes objetivo de imersão em óleo.

Excite o corante de aço usando um laser de 546 nanômetros e colete emissões usando um filtro de bandpass de 570 a 620 nanômetros. Depois de selecionar o campo de imagem e engajar o foco perfeito, pegue uma única imagem parada com canais de marcadores de trixi e fluorescência para marcar limites neuronais. Em seguida, inicie o Run Now no software de aquisição e realize a gravação basal por três a cinco minutos para excluir variações na intensidade do corante.

Logo na mudança para a fase dois, acione o botão on para o sistema de perfusão e perfusa constantemente 50 milimolars de cloreto de potássio para os neurônios para facilitar a descarga de corantes. Realize as gravações por cinco minutos e acione o interruptor de desligamento para o sistema de perfusão. Salve o experimento para análise de dados mais tarde usando o software confocal.

48 horas após a transfecção com GCaMP seis M, incubar os neurônios cortical do roedor primário com cloreto de potássio baixo ACSF por 15 minutos. Em seguida, monte o prato na plataforma de imagem e visualizou gCaMP seis M fluorescência usando um filtro Fitzy e um objetivo de 20 vezes ou 40 vezes. Depois de selecionar o campo de imagem e engajar o foco perfeito, pegue uma única imagem parada com canais marcadores de campo brilhante, Fitzy e fluorescência para marcar limites neuronais.

Em seguida, inicie o Run Now no software de aquisição e realize a gravação basal por três a cinco minutos. Em seguida, perfuse ACSF contendo 50 milimila cloreto de potássio para os neurônios como demonstrado anteriormente e gravar por cinco minutos. Quando a aquisição de imagem parar, salve o experimento e prossiga para a análise de dados usando o software confocal.

Para análise de imagem, abra as imagens de lapso de tempo no software confocal e alinhe as imagens clicando em Imagem, seguido de processamento, seguido de documento atual de alinhamento e selecione Alinhar ao primeiro quadro. Selecione regiões de interesse ao longo dos neuritos usando a ferramenta de seleção do ROI e também marque um ROI representando a intensidade da fluorescência de fundo. Em seguida, inicie a função de medida a partir do painel de medição de tempo para medir a fluorescência bruta ao longo do tempo para os ROIs selecionados.

Após a medição exportar as intensidades de fluorescência bruta para o software de planilha. Neurônios corticais primários de ratos cultivados carregados com corante de estilingues são mostrados aqui. A especificidade do carregamento de tingimento foi determinada pela co rotulagem com sinástia de marcador de vesícula sináptica e a maioria dos puncta positivos de corante estéril são co positivos para este marcador.

A análise dos valores de intensidade bruta durante todo o período de imagem revela que a sináplofia e a intensidade permanecem constantes enquanto a intensidade do corante estilado diminui após a estimulação. Para os neurônios de controle transfectados de proteínas fluorescentes verdes, a liberação bem sucedida de vesícula sináptica resultou na perda impressionante da fluorescência de corantes após a despolarização do cloreto de potássio. Este vídeo representativo mostra um neurônio descarregando seletivamente corante de estirpe em uma nova região direita após a estimulação.

Em contraste, em neurônios transfectados com um C nove ORF 72 ligado à construção de repetição de peptídeos de corante à GA 50, a transmissão sináptica prejudicada é representada por fluorescência de corante retido mesmo após alta despolarização do cloreto de potássio. Imagens representativas de fluorescência de neurônios corticais transfectadas com GCaMP seis M antes e depois da despolarização do cloreto de potássio são mostradas aqui. O aumento dos valores de fluorescência e os neurônios corticais transfeccionados com GCaMP seis M indicam entrada de cálcio em neurites após a despolarização do cloreto de potássio.

No final do período de gravação da linha de base, os neurônios expressaram GCaMP seis M com baixa fluorescência. Um aumento dramático da fluorescência é então observado no início da estimulação. Certifique-se de que as gravações da linha de base da fluorescência para corante de estilingues e GCaMP estejam estáveis.

Use sempre o foco perfeito para evitar a deriva da imagem, o que tornaria o processamento de dados de postagem desafiador. Não é recomendado a cultura adicional de neurônios, pois os pratos são expostos ao ar durante a profusão. No entanto, a coloração ou extração de proteínas ou RNA pode avaliar as causas potenciais de alterações sinápticas.