Testando terapias-alvo em câncer usando análise estrutural de alteração de DNA e xenoenxertos derivados do paciente

O protocolo descrito aqui visa demonstrar um algoritmo para testar a eficácia do tratamento usando modelos de câncer in vivo. O protocolo consiste em uma combinação de várias técnicas. O bio-sequenciamento do genoma inteiro de amostras de tumores humanos é usado para identificar alterações genômicas.

Estes incluem rearranjos genéticos e alterações no número de cópias genéticas. Assim, a análise das alterações identificadas é realizada para selecionar alterações potencialmente drogadas. Os fármacos selecionados com base na análise genômica são então utilizados para o tratamento in vivo de tumores correspondentes cultivados em camundongos imunocomprometidos.

O algoritmo desenvolvido representa uma abordagem promissora para auxiliar as decisões de tratamento para o cuidado de pacientes com câncer. Use a ferramenta Panda ou um software análogo para identificar alterações direcionadas. Podemos listar os genes que foram identificados por microsequenciamento resultou como um simples arquivo delineado de guia usando símbolos genéticos aceitos padrão.

Adicione o sinal de libra à linha de cabeçalho da lista para garantir que o cabeçalho da tabela seja transferido para o nível de caminho U do software. Carregue o arquivo clicando na guia de navegação correspondente. Atribua um único ícone para representar os dados subjacentes clicando no ícone de escolha e, em seguida, clicando na guia finalizar.

Uma vez que os arquivos de um paciente são carregados, visualize a página para identificar uma coluna que exibe o número de genes anotados por caminho. Esta é a última coluna à direita. Use um filtro de via no canto superior esquerdo da janela principal para restringir o número de vias exibidas às que contêm os genes de interesse.

Para identificar caminhos que tenham mais genes anotados do que seria esperado por acaso, use uma função localizada sob a guia de enriquecimento. Em seguida, uma coluna é adicionada à tabela principal que mostra o valor p correspondente do teste exato de um Fisher. Selecione o banco de dados para exibir genes potencialmente drogados a partir da anotação predefinida, verificando um ícone apropriado à esquerda da janela principal.

Para selecionar um caminho para visualização, clique em seu nome exibido na página do visualizador de caminhos. Os ícones que representam cada conjunto de anotações são exibidos ao lado do gene associado. Clicar em qualquer gene na caminho abrirá a página de cartões genéticos correspondentes.

Selecione os caminhos que mostraram genes de interesse anotados e hits para possíveis medicamentos para análise suplementar. Realize o trabalho de tecido em uma coifa de fluxo laminar para manter as condições estéreis. Coloque o tecido tumoral em um prato contendo PBS frio ou mídia de cultura tecidual, como RPMI, DMEM, contendo antibióticos.

Identificar e isolar material tumoral viável do tecido normal e necrosado adjacente com a ajuda de um patologista. Use fórceps e bisturi estéreis para remover material necrosado apontado por um patologista. Para realizar o enxerto subcutâneo, corte o tecido tumoral com fórceps estéreis, bisturi ou tesoura cirúrgica em pequenos fragmentos, aproximadamente 2 x 2 x 2 milímetros de tamanho.

Transfira o tecido fragmentado para uma placa de petri pré-refrigerada no gelo. Deixe matrigel frio no prato com o tecido fragmentado, aproximadamente 200 microliters por 10 pedaços de tecido. Misture bem e deixe os fragmentos de tecido de molho no matrigel por 10 minutos.

Use tesoura cirúrgica estéril e fórceps para fazer uma incisão vertical de pele de 5-10 milímetros em ambos os flancos de um rato. Insira fórceps retos suavemente no espaço subcutâneo para criar um bolso grande o suficiente para que um fragmento de tumor seja colocado sob a almofada de gordura. Use fórceps retas estéreis para inserir fragmentos de tumor no bolso previamente preparado em cada um dos cinco camundongos.

Feche a incisão da pele usando cola tecidual. Após a implantação, para inibir a proliferação de linfócitos, injete cada rato com 100 microliters de rituximabe. Prepare o rato para gavage oral beliscando a pele das costas e dobrando-o para trás para que a cabeça e os lábios do rato sejam imobilizados.

Insira a sonda gavage na parte de trás da garganta do mouse até que a sonda atinja o esôfago. Certifique-se de que a sonda não está inserida muito longe, pois os pulmões do camundongo podem perfurar causando a morte. O flutuador representativo do genoma ilustra a paisagem de mudanças genômicas em um tumor.

Típicos de tumores sorostipos de alto grau, múltiplos ganhos de linhas azuis e perdas linhas vermelhas, indicando altos níveis de instabilidade genômica. A principal alteração de tendência para intervenção terapêutica no tumor OC101 foi uma amplificação no cromossomo 17, envolvendo ERBB2, um gene que codifica para receptor HER2. Para validar os resultados no nível de DNA, vários conjuntos de primers específicos foram projetados para as bordas da região amplificada.

E pcr foi realizado. Nenhum produto de amplificação foi absorvido quando o DNA humano de controle foi usado. Bandas específicas foram identificadas para DNA tumoral OC101.

Em outra variante tumor, T14, foram observados inúmeros ganhos de DNA. Estes incluíam AKT2 em genes RICTOR. A validação realizada no nível proteico, utilizando imunoblotting, mostrou altos níveis de AKT no RICTOR.

Observou-se redução significativa da carga tumoral no grupo tratado de quimioterapia até o final da sexta semana. Houve um benefício extra apenas com a quimioterapia nos grupos que receberam um tratamento combinado. O tecido tumoral foi coletado para análise molecular da resposta ao tratamento no final do ensaio de tratamento.

Os níveis totais e fosforilados de S6, AKT e mTOR foram determinados por meio de imunoblotação. A comparação dos níveis dessas proteínas em tratamentos não tratados, tratados com quimioterapia e tratados com inibidor AKT ou mTOR mostrou uma diminuição acentuada para os dois últimos. A abordagem apresentada é muito útil para a realização do ensaio clínico em modelos PDX.

Ele se aproveita das características moleculares do tumor obtidas pelo perfil genômico para determinar a melhor escolha de medicamentos para testes.