Testando terapias-alvo em câncer usando análise estrutural de alteração de DNA e xenoenxertos derivados do paciente
25 de julho de 2020
Aqui apresentamos um protocolo para testar a eficácia de terapias-alvo selecionadas com base na composição genômica de um tumor. O protocolo descreve a identificação e validação de rearranjos estruturais de DNA, o enxerto dos tumores dos pacientes em camundongos e as respostas de teste a medicamentos correspondentes.
O protocolo descrito aqui visa demonstrar um algoritmo para testar a eficácia do tratamento usando modelos de câncer in vivo. O protocolo consiste em uma combinação de várias técnicas. O bio-sequenciamento do genoma inteiro de amostras de tumores humanos é usado para identificar alterações genômicas.
Estes incluem rearranjos genéticos e alterações no número de cópias genéticas. Assim, a análise das alterações identificadas é realizada para selecionar alterações potencialmente drogadas. Os fármacos selecionados com base na análise genômica são então utilizados para o tratamento in vivo de tumores correspondentes cultivados em camundongos imunocomprometidos.
O algoritmo desenvolvido representa uma abordagem promissora para auxiliar as decisões de tratamento para o cuidado de pacientes com câncer. Use a ferramenta Panda ou um software análogo para identificar alterações direcionadas. Podemos listar os genes que foram identificados por microsequenciamento resultou como um simples arquivo delineado de guia usando símbolos genéticos aceitos padrão.
Adicione o sinal de libra à linha de cabeçalho da lista para garantir que o cabeçalho da tabela seja transferido para o nível de caminho U do software. Carregue o arquivo clicando na guia de navegação correspondente. Atribua um único ícone para representar os dados subjacentes clicando no ícone de escolha e, em seguida, clicando na guia finalizar.
Uma vez que os arquivos de um paciente são carregados, visualize a página para identificar uma coluna que exibe o número de genes anotados por caminho. Esta é a última coluna à direita. Use um filtro de via no canto superior esquerdo da janela principal para restringir o número de vias exibidas às que contêm os genes de interesse.
Para identificar caminhos que tenham mais genes anotados do que seria esperado por acaso, use uma função localizada sob a guia de enriquecimento. Em seguida, uma coluna é adicionada à tabela principal que mostra o valor p correspondente do teste exato de um Fisher. Selecione o banco de dados para exibir genes potencialmente drogados a partir da anotação predefinida, verificando um ícone apropriado à esquerda da janela principal.
Para selecionar um caminho para visualização, clique em seu nome exibido na página do visualizador de caminhos. Os ícones que representam cada conjunto de anotações são exibidos ao lado do gene associado. Clicar em qualquer gene na caminho abrirá a página de cartões genéticos correspondentes.
Selecione os caminhos que mostraram genes de interesse anotados e hits para possíveis medicamentos para análise suplementar. Realize o trabalho de tecido em uma coifa de fluxo laminar para manter as condições estéreis. Coloque o tecido tumoral em um prato contendo PBS frio ou mídia de cultura tecidual, como RPMI, DMEM, contendo antibióticos.
Identificar e isolar material tumoral viável do tecido normal e necrosado adjacente com a ajuda de um patologista. Use fórceps e bisturi estéreis para remover material necrosado apontado por um patologista. Para realizar o enxerto subcutâneo, corte o tecido tumoral com fórceps estéreis, bisturi ou tesoura cirúrgica em pequenos fragmentos, aproximadamente 2 x 2 x 2 milímetros de tamanho.
Transfira o tecido fragmentado para uma placa de petri pré-refrigerada no gelo. Deixe matrigel frio no prato com o tecido fragmentado, aproximadamente 200 microliters por 10 pedaços de tecido. Misture bem e deixe os fragmentos de tecido de molho no matrigel por 10 minutos.
Use tesoura cirúrgica estéril e fórceps para fazer uma incisão vertical de pele de 5-10 milímetros em ambos os flancos de um rato. Insira fórceps retos suavemente no espaço subcutâneo para criar um bolso grande o suficiente para que um fragmento de tumor seja colocado sob a almofada de gordura. Use fórceps retas estéreis para inserir fragmentos de tumor no bolso previamente preparado em cada um dos cinco camundongos.
Feche a incisão da pele usando cola tecidual. Após a implantação, para inibir a proliferação de linfócitos, injete cada rato com 100 microliters de rituximabe. Prepare o rato para gavage oral beliscando a pele das costas e dobrando-o para trás para que a cabeça e os lábios do rato sejam imobilizados.
Insira a sonda gavage na parte de trás da garganta do mouse até que a sonda atinja o esôfago. Certifique-se de que a sonda não está inserida muito longe, pois os pulmões do camundongo podem perfurar causando a morte. O flutuador representativo do genoma ilustra a paisagem de mudanças genômicas em um tumor.
Típicos de tumores sorostipos de alto grau, múltiplos ganhos de linhas azuis e perdas linhas vermelhas, indicando altos níveis de instabilidade genômica. A principal alteração de tendência para intervenção terapêutica no tumor OC101 foi uma amplificação no cromossomo 17, envolvendo ERBB2, um gene que codifica para receptor HER2. Para validar os resultados no nível de DNA, vários conjuntos de primers específicos foram projetados para as bordas da região amplificada.
E pcr foi realizado. Nenhum produto de amplificação foi absorvido quando o DNA humano de controle foi usado. Bandas específicas foram identificadas para DNA tumoral OC101.
Em outra variante tumor, T14, foram observados inúmeros ganhos de DNA. Estes incluíam AKT2 em genes RICTOR. A validação realizada no nível proteico, utilizando imunoblotting, mostrou altos níveis de AKT no RICTOR.
Observou-se redução significativa da carga tumoral no grupo tratado de quimioterapia até o final da sexta semana. Houve um benefício extra apenas com a quimioterapia nos grupos que receberam um tratamento combinado. O tecido tumoral foi coletado para análise molecular da resposta ao tratamento no final do ensaio de tratamento.
Os níveis totais e fosforilados de S6, AKT e mTOR foram determinados por meio de imunoblotação. A comparação dos níveis dessas proteínas em tratamentos não tratados, tratados com quimioterapia e tratados com inibidor AKT ou mTOR mostrou uma diminuição acentuada para os dois últimos. A abordagem apresentada é muito útil para a realização do ensaio clínico em modelos PDX.
Ele se aproveita das características moleculares do tumor obtidas pelo perfil genômico para determinar a melhor escolha de medicamentos para testes.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra um algoritmo para testar a eficácia de terapias direcionadas com base na composição genômica de tumores. Ele inclui a identificação de rearranjos estruturais no DNA e o enxerto de tumores de pacientes em camundongos para testes de resposta a medicamentos.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Oncologia
- Genômica
- Farmacologia
Antecedentes
- As terapias direcionadas são selecionadas com base em alterações genômicas.
- A compreensão das reorganizações do DNA pode orientar as opções de tratamento.
- Modelos in vivo são essenciais para testar a eficácia de medicamentos.
- Camundongos imunocomprometidos são utilizados para enxerto de tumores.
Objetivo do Estudo
- Validar a eficácia de fármacos selecionados por meio de análise genômica.
- Estabelecer um protocolo para testes in vivo de terapias direcionadas.
- Aprimorar a compreensão das respostas tumorais a tratamentos específicos.
Métodos Utilizados
- Sequenciamento genômico completo de espécimes tumorais humanos.
- Identificação de alterações genômicas, incluindo rearranjos gênicos.
- Seleção de alterações potencialmente passíveis de tratamento farmacológico com base na análise.
- Tratamento in vivo de tumores em camundongos imunocomprometidos.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de rearranjos estruturais do DNA.
- Validação de fármacos selecionados em modelos murinos.
- Demonstração da eficácia do tratamento com base na análise genômica.
- Informações sobre o comportamento tumoral em resposta a terapias direcionadas.
Conclusões
- O protocolo fornece uma estrutura para testar terapias direcionadas.
- A análise genômica é crucial para selecionar tratamentos eficazes.
- Modelos in vivo são valiosos para compreender as respostas aos medicamentos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite que equipes de P&D da indústria biofarmacêutica avaliem terapias direcionadas utilizando modelos de enxertos heterotransplantados derivados de pacientes, orientados por perfilagem genômica, apoiando a seleção de fármacos baseada em hipóteses e a redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento pré-clínico. Ao associar alterações estruturais no DNA à resposta funcional aos fármacos, o método aumenta a confiabilidade preditiva na validação de alvos e orienta decisões de avançar ou interromper o desenvolvimento de terapias combinadas. A abordagem é particularmente relevante para tumores com alta instabilidade genômica, nos quais as terapias convencionais falham e o uso de medicamentos fora da indicação é considerado.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao associar alterações estruturais no DNA, como amplificações gênicas e rearranjos, a alvos passíveis de intervenção farmacológica, tais como ERBB2/HER2 e AKT2.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos in vivo utilizando modelos de xenoenxertos derivados de pacientes (PDX), reduzindo a ambiguidade mecanicista antes da otimização do composto líder.
- Valor Preditivo: Demonstra correlação entre previsões genômicas e respostas tumorais observadas, auxiliando no triagem de portfólios com base na confiança no alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados (modelos de xenoenxertos derivados de pacientes) com perfis genômicos caracterizados para avaliação confiável de compostos em ensaios subsequentes.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de enxertia tumoral e tratamento, melhorando a reprodutibilidade entre estudos e permitindo testes pré-clínicos em larga escala.
- Prontidão para Ensaios: Gera leituras moleculares quantitativas (por exemplo, S6 fosforilada, AKT, mTOR) por meio de immunoblotting para avaliar a inibição de vias e a resposta ao tratamento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Utiliza tumores derivados de pacientes para manter a relevância da doença, conectando descobertas genômicas de espécimes humanos a modelos in vivo.
- Validação Pré-clínica: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao demonstrar redução da carga tumoral e efeitos específicos da droga sobre vias metabólicas in vivo.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece se a eficácia observada é devida à monoterapia ou ao tratamento em combinação, orientando o desenho de ensaios clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra análise genômica com testes de eficácia in vivo, posicionando-se entre a identificação de alvos e a otimização de compostos iniciais na sequência de descoberta, permitindo um avanço baseado em dados para o desenvolvimento pré-clínico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao validar se genes estruturalmente alterados são farmacologicamente tratáveis in vivo.
- Triagem: Cria modelos de PDX prontos para ensaios com drivers genômicos conhecidos, permitindo triagem confiável de compostos e avaliação de terapias combinadas.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes (carga tumoral, fosforilação de proteínas) que permitem às equipes comparar os efeitos dos fármacos e avaliar o engajamento do alvo.
- Pesquisa Translacional: Mantém a continuidade desde o tumor do paciente até o modelo pré-clínico, apoiando o alinhamento de biomarcadores e a modelagem preditiva da resposta clínica.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável para testar terapias direcionadas em diferentes tipos de tumores, reduzindo o desenvolvimento redundante de modelos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao confirmar que alterações no nível de DNA se traduzem em sensibilidade funcional ao fármaco in vivo.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de processamento de tecidos, enxertia e administração de fármacos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao priorizar alvos com eficácia demonstrada in vivo, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos a fármacos com base na concordância entre a predição genômica e a resposta em modelos de xenoenxertos derivados de pacientes (PDX).
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em genômica do câncer, patologia e modelagem in vivo para isolar com precisão tecido tumoral viável e interpretar alterações genômicas.
- Depende de infraestrutura de sequenciamento de nova geração e ferramentas de bioinformática (por exemplo, ferramenta Panda) para análise de alterações estruturais e enriquecimento de vias.
- Necessita de procedimentos padronizados para fragmentação estéril do tumor, mistura com Matrigel e enxertia subcutânea, a fim de garantir o sucesso do implante.
- Requer capacidade de imunoblotagem para avaliar a modulação da via downstream (por exemplo, AKT/mTOR/S6) como leituras farmacodinâmicas.
- Limitado pelo tempo e intensidade de recursos necessários para a geração de modelos PDX, o que pode restringir a capacidade de processamento em campanhas de triagem em larga escala.
