Detecção de alterações direcionáveis no câncer de pulmão de células não pequenas usando sequenciamento de última geração

Minha pesquisa descobre mutações genéticas no câncer para melhorar o diagnóstico e o tratamento. Para começar, registre as informações da amostra no Sistema de Gerenciamento de Informações do Laboratório e preencha o formulário de consentimento informado para testes de mutação gênica. Utilizando lâminas descartáveis de micrótomo, cortei seções do câncer de pulmão não de células pequenas, amostra formal e parafina fixa embutida.

Em seguida, realize coloração rotineira de hematoxilina e eosina para avaliar o conteúdo celular tumoral. Para extração de ácidos nucleicos, usando um micrônomo, separe o bloco formal e fixo embutido de parafina para obter uma fita, e coloque a fita em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Transfira o tubo para o local designado de entrada da amostra no instrumento de extração automatizado.

Em seguida, use um instrumento de extração automática com um kit de extração automática. Substitua as etapas manuais de pipetagem por um sistema automático de extração de ácidos nucleicos com esferas magnéticas. Depois, selecione o programa C1102 no instrumento.

Escolha o tempo de incubação da deceração da amostra como 16 horas e ajuste o volume eluciano para 100 microlitros. Use espectrofotometria para verificar a pureza do DNA. Depois, use um kit de detecção com corantes fluorescentes específicos de sequência para realizar um ensaio fluorométrico para medição precisa da concentração de DNA.

Para preparar DNA genômico fragmentado usando ultrasonicação, misture 200 nanogramas de DNA genômico em 50 microlitros de tampão baixo tris-EDTA. Coloque o tubo da amostra em um suporte pré-resfriado, mantido a oito graus Celsius. Defina os parâmetros do instrumento de acordo com o protocolo e inicie a fragmentação do DNA.

Para iniciar a preparação automatizada da biblioteca, pressione o botão de energia para ativar o sistema e aguarde a inicialização ser concluída. Navegue até a configuração do programa, selecione o protocolo run e escolha o protocolo BurningRock HS. Ajuste o tipo de amostra para DNA de alta qualidade, quantidade de nanogramas de entrada para 50, ciclos pré-PCR para 12 e ciclos pós-PCR para 12. Depois, clique em Executar para prosseguir.

Em seguida, insira o cartucho pré-embalado no slot designado do instrumento, o que automaticamente valida a posição e o status do reagente. Após carregar as amostras, pressione start para iniciar a execução autônoma. Observe os indicadores de LED no sistema para monitorar o progresso.

Após o término do programa, clique em OK para confirmar e o sistema transferirá automaticamente a biblioteca final para o tubo da biblioteca, completando a preparação da biblioteca. Meça a concentração tanto da pré-biblioteca quanto da biblioteca total usando fluorometria. Dilua a biblioteca de sequenciamento para 1,6 picomolar e 1300 microlitros para operações de sequenciamento.

Controle o ambiente de sequenciamento mantendo uma temperatura interna e umidade interna. Controle completo de qualidade dos dados de saída do instrumento verificando a qualidade base acima de Q 30 e filtro de passagem de densidade de cluster. O fluxo de trabalho otimizado de detecção identificou de forma confiável várias alterações genômicas clinicamente acionáveis em amostras representativas de tumores.

Os resultados do sequenciamento demonstraram um EGFR p de alta frequência. Mutação missense L858R, acompanhada por uma amplificação significativa do número de cópias do gene EGFR. Foi observada amplificação moderada do gene MET e amplificação de baixo nível do gene BRAF.

A amostra apresentou uma carga intermediária de mutação tumoral e status estável de microssatélites. Todos os loci gênicos alvo, incluindo ALK, BRAF, KRAS e ROS1, alcançaram uma taxa de detecção de 100% em quatro experimentos de replicação. Cada mutação foi consistentemente detectada em todos os quatro experimentos repetidos, com os valores esperados de abundância permanecendo dentro da faixa normal de flutuação. O NJS fornece um perfil genético compressivo para câncer de pulmão não de pequenas células ao detectar genes comuns, raros e novos ao mesmo tempo.

Nossas pesquisas futuras se concentrarão em combinar patologia molecular com inteligência artificial para explorar novos biomarcadores para o câncer de pulmão.