Detecção de alterações direcionáveis no câncer de pulmão de células não pequenas usando sequenciamento de última geração
10 de outubro de 2025
Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de sequenciamento de próxima geração automatizado e credenciado pela ISO15189 para detectar alterações genômicas direcionáveis em tecidos embebidos em parafina fixados em formalina de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).
Minha pesquisa descobre mutações genéticas no câncer para melhorar o diagnóstico e o tratamento. Para começar, registre as informações da amostra no Sistema de Gerenciamento de Informações do Laboratório e preencha o formulário de consentimento informado para testes de mutação gênica. Utilizando lâminas descartáveis de micrótomo, cortei seções do câncer de pulmão não de células pequenas, amostra formal e parafina fixa embutida.
Em seguida, realize coloração rotineira de hematoxilina e eosina para avaliar o conteúdo celular tumoral. Para extração de ácidos nucleicos, usando um micrônomo, separe o bloco formal e fixo embutido de parafina para obter uma fita, e coloque a fita em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Transfira o tubo para o local designado de entrada da amostra no instrumento de extração automatizado.
Em seguida, use um instrumento de extração automática com um kit de extração automática. Substitua as etapas manuais de pipetagem por um sistema automático de extração de ácidos nucleicos com esferas magnéticas. Depois, selecione o programa C1102 no instrumento.
Escolha o tempo de incubação da deceração da amostra como 16 horas e ajuste o volume eluciano para 100 microlitros. Use espectrofotometria para verificar a pureza do DNA. Depois, use um kit de detecção com corantes fluorescentes específicos de sequência para realizar um ensaio fluorométrico para medição precisa da concentração de DNA.
Para preparar DNA genômico fragmentado usando ultrasonicação, misture 200 nanogramas de DNA genômico em 50 microlitros de tampão baixo tris-EDTA. Coloque o tubo da amostra em um suporte pré-resfriado, mantido a oito graus Celsius. Defina os parâmetros do instrumento de acordo com o protocolo e inicie a fragmentação do DNA.
Para iniciar a preparação automatizada da biblioteca, pressione o botão de energia para ativar o sistema e aguarde a inicialização ser concluída. Navegue até a configuração do programa, selecione o protocolo run e escolha o protocolo BurningRock HS. Ajuste o tipo de amostra para DNA de alta qualidade, quantidade de nanogramas de entrada para 50, ciclos pré-PCR para 12 e ciclos pós-PCR para 12. Depois, clique em Executar para prosseguir.
Em seguida, insira o cartucho pré-embalado no slot designado do instrumento, o que automaticamente valida a posição e o status do reagente. Após carregar as amostras, pressione start para iniciar a execução autônoma. Observe os indicadores de LED no sistema para monitorar o progresso.
Após o término do programa, clique em OK para confirmar e o sistema transferirá automaticamente a biblioteca final para o tubo da biblioteca, completando a preparação da biblioteca. Meça a concentração tanto da pré-biblioteca quanto da biblioteca total usando fluorometria. Dilua a biblioteca de sequenciamento para 1,6 picomolar e 1300 microlitros para operações de sequenciamento.
Controle o ambiente de sequenciamento mantendo uma temperatura interna e umidade interna. Controle completo de qualidade dos dados de saída do instrumento verificando a qualidade base acima de Q 30 e filtro de passagem de densidade de cluster. O fluxo de trabalho otimizado de detecção identificou de forma confiável várias alterações genômicas clinicamente acionáveis em amostras representativas de tumores.
Os resultados do sequenciamento demonstraram um EGFR p de alta frequência. Mutação missense L858R, acompanhada por uma amplificação significativa do número de cópias do gene EGFR. Foi observada amplificação moderada do gene MET e amplificação de baixo nível do gene BRAF.
A amostra apresentou uma carga intermediária de mutação tumoral e status estável de microssatélites. Todos os loci gênicos alvo, incluindo ALK, BRAF, KRAS e ROS1, alcançaram uma taxa de detecção de 100% em quatro experimentos de replicação. Cada mutação foi consistentemente detectada em todos os quatro experimentos repetidos, com os valores esperados de abundância permanecendo dentro da faixa normal de flutuação. O NJS fornece um perfil genético compressivo para câncer de pulmão não de pequenas células ao detectar genes comuns, raros e novos ao mesmo tempo.
Nossas pesquisas futuras se concentrarão em combinar patologia molecular com inteligência artificial para explorar novos biomarcadores para o câncer de pulmão.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de sequenciamento de próxima geração, automatizado e credenciado pela ISO15189, para detectar alterações genômicas direcionáveis em tecidos formalina-fixados e embebidos em parafina de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). O processo inclui registro da amostra, seçãoamento e extração de ácido nucleico.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Oncologia
- Genômica
- Patologia
Fundamentos
- O câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é um tipo comum de câncer de pulmão.
- Identificar alterações genômicas é crucial para terapias direcionadas.
- Tecidos formalina-fixados e embebidos em parafina são frequentemente usados em pesquisas sobre câncer.
- Fluxos de trabalho automatizados podem aumentar a eficiência e precisão nos testes genômicos.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um fluxo de trabalho de sequenciamento confiável para amostras de NSCLC.
- Melhorar a detecção de alterações genômicas direcionáveis.
- Garantir conformidade com os padrões ISO15189.
Métodos Utilizados
- Registrar informações da amostra no Sistema de Gestão de Informações Laboratoriais.
- Cortar seções de amostras formalina-fixadas e embebidas em parafina usando lâminas de microtomo.
- Realizar coloração de rotina com hematoxilina e eosina para avaliar o conteúdo de células tumorais.
- Extrair ácidos nucleicos usando um instrumento de extração automatizado.
Principais Resultados
- Extração bem-sucedida de ácidos nucleicos de amostras de NSCLC.
- Dados genômicos de alta qualidade obtidos para alterações direcionáveis.
- O fluxo de trabalho demonstrou conformidade com a acreditação ISO15189.
- Capacidades diagnósticas aprimoradas para o tratamento de NSCLC.
Conclusões
- O fluxo de trabalho de sequenciamento automatizado é eficaz para NSCLC.
- A conformidade com a ISO15189 aumenta a confiabilidade dos resultados.
- Este protocolo pode ser adaptado para outros tipos de câncer.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Comprehensive detection of actionable genomic alterations in non-small cell lung cancer (NSCLC) is critical for precision oncology and portfolio advancement. Automated, ISO15189-certified next-generation sequencing (NGS) workflows enable high-confidence identification of mutations, fusions, and amplifications, supporting robust target validation and risk-adjusted decision-making. Standardized, reproducible NGS processes reduce technical variability and accelerate translational research integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise identification of driver mutations and gene amplifications for functional target validation.
- Supports biological de-risking by detecting both common and rare genomic alterations in NSCLC samples.
- Facilitates predictive confidence in target selection through rigorous quality control and replicate concordance.
Screening & Assay Development
- Prepares validated genomic profiles for downstream compound screening and biomarker assay development.
- Standardizes sample processing and library preparation to ensure reproducibility and quantitative reliability.
- Automated workflows minimize human error, supporting scalable and high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant biomarkers for translational continuity in NSCLC research.
- Enables risk-adjusted advancement by providing comprehensive mutation and amplification data for preclinical models.
- Supports integration of molecular pathology and emerging biomarker discovery for future translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
This NGS workflow bridges early discovery, target validation, and translational research by delivering high-fidelity genomic data from clinical NSCLC samples.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing and pathway clarification through comprehensive mutation detection.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative genomic outputs suitable for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Generates high-quality, statistically validated readouts for cross-condition comparison and decision support.
- Translational Research: Ensures biomarker alignment and continuity from discovery through preclinical validation in NSCLC.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable platform for ongoing molecular profiling across oncology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation and rigorous QC.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing reliable genomic data for portfolio triage.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of NSCLC and other oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular pathology, NGS instrumentation, and bioinformatics analysis.
- Demands access to automated extraction and library preparation systems with validated protocols.
- Necessitates cross-team standardization for sample input, QC thresholds, and data interpretation.
- Must adapt protocols for varying tumor cellularity and FFPE sample quality.
- Turnaround time and technical complexity remain practical considerations for clinical and translational deployment.
