Preparação do Tecido Cerebral primata não humano para Pré-incorporação de imuno-histoquímica e Microscopia Electrónica

O objetivo geral deste experimento é obter imunocoloração pré-incorporada confiável de tecido cerebral não primata para microscopia eletrônica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuroanatomia, como a incidência sináptica de uma determinada inervação em uma estrutura cerebral precisa. A principal vantagem dessa técnica é que é um método fácil e de baixo custo para rotular inervações específicas adequadas para microscopia eletrônica.

Comece transferindo seções de 50 mícrons de espessura do cérebro de primata não humano fixado por acroleína contendo a região de interesse para uma placa de 12 poços contendo PBS. Lave as seções flutuantes três vezes em PBS por cinco minutos à temperatura ambiente e, em seguida, incube as seções em solução de borohidreto de sódio recém-preparada por 30 minutos em temperatura ambiente. Balance suavemente sem tampa.

Decorridos os 30 minutos, aspirar o borohidreto de sódio e adicionar PBS a cada poço. Coloque o prato em uma cadeira de balanço e agite vigorosamente por 10 minutos. Repita a lavagem mais duas vezes ou até que não reste nenhum gás de reação.

Bloqueie as seções incubando em uma solução de soro normal a 2% e gelatina de peixe fria a 0,5% diluída em PBS por uma hora em temperatura ambiente com balanço suave. Decorrido o tempo de incubação, incubar as secções em solução de anticorpos primários com um balanço suave durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, depois de lavar as seções como antes, incubar as seções em solução de anticorpos secundários por uma hora e meia em temperatura ambiente com um balanço suave.

Depois de lavar as seções como antes, incubar em solução de avidina-biotina-peroxidase ou ABC por uma hora com balanço. Em seguida, prepare uma nova solução de 0,05%3,3'Diaminobenzidina com peróxido de hidrogênio a 0,005% diluído em TBS. Após a lavagem, incube as seções na solução DAB por três a sete minutos com um balanço suave.

Assim que o precipitado marrom atingir a cor desejada, pare a reação lavando rapidamente duas vezes em TBS frio e, em seguida, por meio de uma série de lavagens cronometradas de TBS e PB. Transfira a placa que contém as seções manchadas com DAB para a coifa. Transfira as seções para uma placa de seis poços preenchida com PB e alise completamente as seções pipetando cuidadosamente o PB para fora da placa e, em seguida, adicione a solução de tetróxido de ósmio gota a gota para evitar perturbar as seções achatadas.

Cubra a placa com papel alumínio para proteger as seções da luz e incube por 30 minutos em temperatura ambiente sem agitação. Durante a osmificação, prepare a resina epóxi repelente de água adicionando quantidades apropriadas de cada componente da mistura de resina epóxi a um copo plástico grande. Mexa com um palito de madeira ou pipeta de plástico até obter uma cor marrom homogênea, depois transfira quantidades iguais de resina para copos de alumínio de tamanho apropriado para o número de seções a serem processadas e deixe descansar.

Decorrido o período de osmificação, lavar as secções três vezes em PB durante 10 minutos com balanço a baixa velocidade. Após a lavagem, desidratar as secções da série seguinte de etanol graduado durante dois minutos cada. Em seguida, transfira as seções para frascos de vidro cheios de óxido de propileno e incube em óxido de propileno três vezes por dois minutos cada para completar o processo de desidratação.

Em seguida, transfira as seções com cuidado, uma a uma, para os copos de alumínio, evitando ao máximo o contato com o ar. Incorpore as seções em resina epóxi repelente de água previamente misturada e incuba-as durante a noite sob a coifa de ventilação em temperatura ambiente. No dia seguinte, cubra as lâminas de vidro e as lamínulas de plástico com óleo mineral e, em seguida, amoleça a resina incubando os copos de alumínio a 60 graus Celsius por 12 a 15 minutos no máximo.

Alise cuidadosamente as seções no lado untado da lâmina de vidro. Coloque a lamínula lubrificada e empurre cuidadosamente o ar restante. Incube as lâminas a 60 graus Celsius por 48 horas.

Após 48 horas, remova a lamínula de plástico, deixando a seção envolta em resina. Comece usando binóculos para localizar a região de interesse e, em seguida, use um bisturi para cortar um pequeno pedaço quadrangular de tecido de aproximadamente um mililitro quadrado. Em seguida, lixe a ponta de um bloco de resina e cole o pedaço de tecido quadrangular nele.

Após a secagem, coloque o bloco de resina no deck de ultramicrótomo na posição vertical e use uma lâmina de barbear afiada para cortar gradualmente cada lado do bloco de resina para formar um trapézio com lados lisos. Em seguida, coloque o deck em sua posição horizontal e gire o bloco até que o lado mais comprido do trapézio esteja voltado para baixo. Coloque uma ferramenta de corte de diamante ou uma faca de vidro em um espaço dedicado.

Defina o ultramicrótomo para cortar seções de 300 mícrons a um milímetro por segundo. Ajuste a faca para ficar verticalmente paralela à peça quadrangular e para exibir um ângulo horizontal muito pequeno de aproximadamente um grau e apare a superfície da peça quadrangular até que o tecido comece a aparecer. Agora, mude para uma faca de diamante ultra 45 graus equipada com um barco cheio de água destilada para cortar seções de 80 mícrons de espessura.

Alise as seções passando por cima delas com um pedaço de papel absorvente com ponta de xileno sem tocar a superfície da água e colete seções seriais em grades de cobre de 150 malhas. Coloque as grades em uma caixa de armazenamento de grade e prepare uma solução de estoque de citrato de chumbo e água destilada e filtre através de um filtro de seringa de 0,2 mícron. Cubra o frasco com papel alumínio para protegê-lo da luz.

Coloque cada grade em uma gota da solução diluída de citrato de chumbo, com a seção em contato com a solução Em seguida, use uma pinça pequena para segurar a grade e enxágue-a bem em dois copos contendo água destilada. Remova suavemente o excesso de água com papel absorvente e coloque as grades em uma caixa de grade. Após 30 minutos, os cortes podem ser examinados por microscopia eletrônica de transmissão.

Esta micrografia eletrônica do globo pálido interno do macaco-esquilo mostra material bem preservado após a perfusão transcardíaca com acroleína-PFA na técnica de imunoperoxidase diaminobenzidina. Como visto lá, o procedimento permite que a bainha de mielina de um grande axônio, indicada pela ponta da seta, seja vista. Esta micrografia eletrônica do globo pálido externo demonstra os perfis dendríticos, indicados pela letra d, pequenos axônios não mielinizados, indicados por a, e varicosidades de axônios, marcadas como av, podem ser facilmente identificados.

As setas mostram um exemplo de uma varicosidade axonal estabelecendo um contato sináptico simétrico com o perfil dendrítico. Os elementos imunomarcados podem ser facilmente identificados por seu citoplasma ou axoplasma preenchido com precipitado DAB denso em elétrons. Aqui, um dendrito imunomarcado para colina acetiltransferase no GPi recebe um contato sináptico de uma varicosidade axonal não marcada.

Esta micrografia eletrônica mostra um axônio mielinizado no GPe com uma bainha de mielina relativamente intacta cujo axoplasma é imunomarcado para tirosina hidroxilase. Este exemplo mostra uma varicosidade do axônio no GPi imunomarcado para o transportador de serotonina que estabelece um contato sináptico simétrico com um dendrito. Neste exemplo, o precipitado DAB reveste a membrana plasmática e a superfície externa das organelas.

A varicosidade axonal mostrada aqui foi observada no GPe e imunomarcada para tirosina hidroxilase. Isso representa um exemplo de precipitado DAB preenchendo inteiramente o axoplasma, com vesículas sinápticas sendo visíveis, mas mais difíceis de delinear. Após este procedimento, outros métodos, como imuno-histoquímica dupla pré-incorporada, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como colocalizações de proteínas ou receptores no nível sináptico.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar a imuno-histoquímica pré-incorporação de tecido cerebral não primata, proceder à incorporação em resina epóxi e ultracortar a região de interesse em seções de 80 micrômetros de espessura adequadas para microscopia eletrônica.