Name: Extração de amostra e quantificação cromatográfica simultânea de doxorrubicina e mitomicina C após entrega de combinação de drogas em nanopartículas para ratos de Tumor-rolamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a extrair e quantificar simultaneamente Doxorrubicina, Mitomicina C e Doxorrubicinol em amostras biológicas usando cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa. Este método robusto facilita pesquisas em nanomedicina e farmacocinética.

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Os autores reconhecem com gratidão a concessão de equipamentos da ciência Natural e pesquisa de engenharia (NSERC) Conselho de Canadá para HPLC, a subvenção de funcionamento do Instituto canadense de pesquisa de saúde (CIHR) e pesquisa de câncer de mama canadense (CBCR) Aliança para X.Y. Wu e a bolsa da Universidade de Toronto para R.X. Zhang e T. Zhang.

todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal conta Comissão de University Health Network no Ontario Cancer Institute e conduzidos de acordo com o Conselho canadense sobre as orientações de cuidado Animal.
 1. preparação da amostra biológica <ol><li>coletar o sangue total, os principais órgãos e tumor de mama nos pontos de tempo predeterminados após administração intravenosa (IV) de contendo fármaco formulações (por exemplo, DMPLN, DOX lipossomal) <ol><li>injetar um peito tumor-rolamento do mouse IV com uma formulação contendo fármaco preparada.</li>
		<li>Anestesiar o mouse nos pontos tempo designados (por exemplo, 15 min), dando inalável isoflurano de 2% em uma câmara selada.</li>
		<li>Colocar o mouse anestesiado em suas costas e colocar seu nariz através de um inalador nasal que constantemente fornece 2% isoflurano. 
		Nota: Para garantir que o mouse passa por anestesia profunda, suavemente belisca os membros dianteiros do mouse e procure qualquer movimento contrair.</li>
		<li>Limpe muito bem os peito e abdome regiões usando etanol a 70% e, em seguida, executar um procedimento terminal da punção cardíaca os ratos anestesiados profundos, usando uma seringa heparinizada 1 mL e uma agulha 23G.</li>
		Heparina <li>coletar o sangue total em um rotulado de sódio pulverizado tubo plástico e agite suavemente o tubo para garantir coletado sangue entra em contato com a heparina revestida da parede do tubo. Recolha um mínimo de 50 µ l de sangue total. Mantenha sempre as amostras no gelo</li>
		<li>Fita todos os quatro membros do rato para fixá-lo e abrir a cavidade abdominal e torácica do mouse usando um par de tesouras e pinças. Deslocar o intestino para o lado e empurre o fígado para cima para expor suficientemente a veia porta. Cortar a veia porta para a drenagem de sangue.</li>
		<li>Perfundir o corpo todo rato com 50 mL de soro fisiológico 0,9% gelado através do coração utilizando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 25 G. 
		Nota: Dobrar a agulha a 90° para guiar a seringa na veia portal.</li>
		<li>Órgãos de impostos especiais de consumo no seguinte ordem: coração, pulmão, fígado, baço, rins. Em seguida, separe o tumor de mama os tecidos conectivos circundantes, usando um par de tesouras de incisão para a almofada de gordura mamária direita do mouse. Coletar todos os órgãos individualmente em tubos de polipropileno de 1,5 mL e rapidamente congelá-los em azoto líquido. 
		&#8203; Nota: separar a vesícula do fígado.</li>
		<li>Armazenar o sangue de toda a 4 ° C e tecidos extirpados em congelador a-80 ° C até posterior análise HPLC.</li>
	</ol></li> <li>Extrair DOX, MMC e DOXol de matrizes biológicas.
	<ol><li>Pesar todos os tecidos dissecados congelados rapidamente e transferi-los para um tubo cônico de fundo arredondado de 13 mL. Para evitar o metabolismo das drogas possível ou degradação, manter as amostras no gelo</li>
		<li>Adicionar 15 mL de tampão de lise celular gelada no tubo. 
		Nota: O volume de reserva para usar depende do peso de tecido com base na relação tecido-tampão de 1 g: 5 mL (p/v); para pequenos órgãos, tais como o coração e o baço, a proporção é de 1 g: 2 mL.</li>
		<li>Usar um movimento cima-baixo curso para homogeneizar as amostras no gelo à velocidade de 18.000 rpm usando um homogeneizador de mão elétrico. 
		Nota: Homogeneização completa requer cerca de 3 a 5 iterações de um processo de homogeneização curta de menos de 15 s, seguido de resfriamento com gelo entre cada curta homogeneização de tecidos.</li>
		<li>Lavar a sonda de gerador dente de serra 10 mm do homogenizador com água destilada deionizada (DDI) H 2 O etanol a 70% e em seguida DDI H 2 O entre cada amostra de tecido para evitar a contaminação cruzada.</li>
		<li>Transferir 50 µ l de homogeneizado de tecido ou sangue total em um tubo de centrífuga micro polipropileno 1,5 mL e spike com 5 µ l de uma interna padrão (I.S.) 4-methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) no tubo. 
		Nota: solução de 4-MU foi preparada em metanol aqui.</li>
		<li>Adicionar 250 µ l de um solvente de extração gelada no tubo contendo sangue ou tecido homogeneizado. 
		Nota: O solvente de extração consiste em 60% acetonitrila (ACN) e acetato de amônio 40% (5 mM) com pH ajustado para pH = 3.5 usando 0,05% de ácido fórmico. Use uma amostra de (v/v) de 1:5: solvente de extração para relação volume.</li>
		<li>Vigorosamente a mistura por 2 min, centrifugar 3.000 x g força no 4 o C por 10 min e pipetar 200 µ l sobrenadante para outro tubo de microcentrífuga fresco pre-refrigerado de vórtice.</li>
		<li>Sobrenadante de evaporar a 60 ° C, sob uma corrente lenta de gás nitrogênio com proteção contra luz.</li>
		<li>Reconstituir o resíduo seco com 100 µ l de metanol gelado, vórtice vigorosamente por 30 s e centrifugar a 3000 x g a 4 ° C, mais 5 min.</li>
		<li>Transferir o sobrenadante para uma inserção do frasco HPLC e colocar os frascos de amostra em uma bandeja de mostruário para injeção.</li>
	</ol></li></ol> 2. HPLC Instrumentação e parâmetros de operação <ol><li>preparar HPLC fase móvel com reprodutibilidade consistente <ol><li>medir de HPLC-classe H 2 O usando um cilindro graduado de 500 mL.</li>
		<li>Medir 500 mL de acetonitrila grau CLAE (ACN) usando um cilindro graduado separado.</li>
		<li>, Cuidadosamente, adicionar 0,5 mL de ácido trifluoroacético (TFA) (cuidado) em cada um dos 500 mL de H 2 O e ACN para obter a fase móvel de H 2 O e ACN contendo 0,1% TFA, respectivamente. 
		Nota: O TFA é corrosivo e tóxico e deve ser tratado sob uma coifa de laboratório. Todas as misturas de solventes são preparadas à temperatura ambiente.</li>
		<li>Filtro fases móveis através de um filtro de membrana de nylon com um 0,45 µm reduz o tamanho dos poros e transferi-lo para limpas garrafas de reservatório HPLC.</li>
	</ol></li> <li>Instrumentação de HPLC de set-up para a deteção simultânea de DOX, MMC e DOXol e I.S. 4-MU.
	<ol><li>Ligue a bomba de gradiente, de gasser, auto-sampler, detetor de fotodiodo matriz e multi detector de fluorescência λ.</li>
		<li>Entrada as condições iniciais da composição da fase móvel para 16,5% H 2 O (0,1% TFA) e 83,5% ACN (0,1% TFA) (v/v).</li>
		<li>Definir o detector UV em dois canais, um em 310 nm para 4-MU (I.S.) e o outro a 360 nm para MMC.</li>
		<li>Definir o detector de fluorescência em dois canais, um de cada λ ex / λ em = 365/445 nm para 4-MU e o outro no λ ex / λ em = 480 nm/560 nm para DOX e DOXol, respectivamente.</li>
		<li>Definir uma taxa de fluxo de isocrática de 1,0 mL/min.</li>
		<li>Equilibrar uma coluna de 18 fase reversa pré-instalado C (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) em temperatura ambiente por 10 min. para o estabelecimento da linha de base.</li>
	</ol></li> <li>Separar drogas (DOX, MMC, DOXol e 4-MU) usando condição gradiente de fase móvel.
	<ol><li>Injetar 15 µ l de amostras re-concentradas e extraídas usando o auto-sampler.</li>
		<li>Gradualmente mudar a condição inicial da fase móvel (consulte a etapa protocolo 2.2.2) para 100% ACN (0,1% TFA) mais 18 min usando a bomba gradiente automatizada. 
		Nota: Durante o processo de separação, quatro canais (dois absorventes UV e duas fluorescentes) aparecem simultaneamente com cada canal exibindo um medicamento composto (consulte a etapa de protocolo 2.2.3 e 2.2.4).</li>
		<li>Manter 100% de ACN (0,1% TFA) por 1 min e em seguida, retornar à condição inicial fase móvel dentro de 1 min.</li>
		<li>Re-condicionar a coluna com a fase móvel inicial com caudal de 1,5 mL/min durante 4 min para a próxima injeção de amostra.</li>
	</ol></li></ol> 3. Validação de HPLC <ol><li>preparar normas de trabalho de DOX, MMC e DOXol e 4-MU (I.S.).
	<ol><li>Pesar separadamente 1 mg de pó de drogas DOX e MMC (cuidado) e 4-MU em uma nova pesagem pequeno papel (3 x 3 polegadas 2). 
		Observe que todas as drogas anticâncer são consideradas um perigo para a saúde que pode causar mutagenicidade de toxicidade e células germinativas aguda na inalação ou ingestão. Devem ser manuseadas com cuidado com luvas e máscaras.</li>
		<li>Transferir o pesado DOX, MMC e 4-MU em Nova individual 1,5 mL polipropileno microtubo de centrífuga.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de metanfetaminaadilia e vórtice brevemente para obter a concentração de 1 mg/mL de DOX e MMC.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de metanol em um frasco contendo pré-pesados 1 mg de DOXol (cuidado) e vórtice brevemente para obter a concentração de 1 mg/mL de DOXol. 
		Nota: DOXol é um metabólito tóxico cardio e deve ser manuseado com cuidado.</li>
		<li>Pipeta 20 µ l de soluções estoque preparadas de DOX, MMC, DOXol e 4-MU em um novo separar o tubo de microcentrífuga polipropileno de 1,5 mL e adicionar 980 µ l de metanol para obter um padrão de trabalho de 20 µ g/mL de cada medicamento.</li>
		<li>Diluir 20 µ g/mL de DOX, MMC e DOXol usando metanol para obter as normas de trabalho de 50 ng - 20 µ g /mL para DOX, MMC e DOXol e 2000 ng/mL para I.S. 4-MU.</li>
		<li>Fechar a tampa do tubo de soluções de trabalho com um estreito pedaço de película coberta de parafina para evitar a evaporação do metanol, enrole o tubo inteiro com papel de alumínio para evitar a exposição à luz direta e loja em -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Determinar a linearidade, precisão e exatidão de DOX, MMC e DOXol em matrizes biológicas (ou seja, o sangue total e tumor homogenate).
	<ol><li>Simultaneamente espigão 5 µ l de normas de trabalho de DOX e DOXol (50 ng/mL - 20 µ g/mL), MMC (1.000 ng/mL - 16 µ g/mL) e 4-MU (2 µ g/mL) em 50 µ l de sangue em branco ou tecido homogeneizado em polipropileno tubos de centrífuga de micro obter a curva padrão de concentração que variam de 5-2000 ng/mL para compostos de drogas e 200 ng/mL para o 4-MU (I.S.).</li>
		<li>Realizar o ensaio de extração de drogas descrito no protocolo 1.2.</li>
		<li>Usar concentrações baixas, média e altas de DOX e DOXol (50, 500 e 2.000 ng/mL) e MMC (100, 1000, 2.000 ng/mL) para precisão intra e inter dia. 
		Nota: Preparar concentrações padrão frescas no dia da análise.</li>
	</ol></li> <li>Análise de amostras <ol><li>injetar 15 µ l de amostra usando o auto-sampler.</li>
		<li>Gradualmente mudar a fase móvel mais de 0 a 18 min, aumentando a composição do Grupo ACN no intervalo.</li>
		<li>Depois de 18 min, segure a condição de fase móvel de 1 min.</li>
		<li>Retornar à condição inicial sobre a próxima 2 min e, em seguida, re-equilibrar para 4 min antes da próxima injeção.</li>
		<li>Após cada amostra executar, note que os picos de compostos de drogas com o seu tempo de retenção são mostrados como segue: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) e DOX.</li>
		<li>Integrar a área do pico sob a curva (AUC) de compostos de drogas usando HPLC software.</li>
		<li>Calcular a relação AUC entre compostos individuais sobre drogas e I.S. (equação 1) e use as curvas padrão elaboradas sob os mesmos procedimentos de extração para determinar as concentrações de droga de DOX, MMC e DOXol na formulação de DMPLN. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq1.jpg" /></li> <li>calcular a percentagem de recuperação de drogas (equação 2), comparando as concentrações de droga reconstituídas utilizando metanol de extractos de amostras biológicas cravados àquele da norma (&#34; pura &#34;) solução em metanol de drogas. 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq2.jpg" /></li></ol></li></ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes e conflitos de interesse.

Em comparação com outros métodos cromatográficos que permitem a detecção de uma espécie única droga de cada vez, o presente protocolo HPLC é capaz de dosar simultaneamente três compostos de drogas (DOX, MMC e DOXol) na mesma matriz biológica sem a necessidade de mudar a fase móvel. Esse método de preparação e análise tem sido aplicado com sucesso para determinar a farmacocinética e bio-distribuição de dois sistemas de entrega de drogas baseados em nanopartículas (i.e., lipossomal DOX e DMPLN)22...

A quimioterapia é uma modalidade de tratamento primário para muitos tipos de câncer ainda é frequentemente associado com efeitos adversos graves e eficácia limitada devido a resistência às drogas e outros fatores1,2,3. Regimes de combinação de drogas para melhorar o resultado da quimioterapia, foram aplicados na clínica com base em considerações como toxicidades não-sobreposição, diferentes mecanismos de ação de drogas e drogas não-cruz resistência4,5 , 6. em ensaios clínicos, uma melhor taxa de resposta do tumor foi muitas vezes observada usando simultaneamente administrados combinações de drogas, em comparação com um regime de drogas sequencial entrega7,8. No entanto, devido à sub-ótimo bio-distribuição de formulários de droga livre, injeção simultânea de múltiplas drogas pode causar toxicidade proeminentes tecido normal que supera o efeito terapêutico9,10,11. Entrega de drogas baseadas em nanocarreador foi mostrada para alterar a farmacocinética e bio-distribuição de medicamentos encapsulados, aumentando a acumulação de tumor-alvo12,13,14. Como comentado em nossos artigos recentes, nanopartículas co carregadas com combinações sinérgicas de drogas têm demonstrado a capacidade de atenuar os problemas enfrentados por combinações de drogas livre, devido a sua controlada entrega co temporal e espacial de várias drogas ao tecido do tumor, permitir efeitos sinérgicos droga contra o câncer células4,15,16. Como resultado, superior eficácia terapêutica e baixa toxicidade foram demonstradas em ambos os estudos pré-clínicos e clínicos4,17,18.
Nossos anterior em vitro estudos encontraram que a combinação de duas drogas anticâncer, doxorrubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), produziu um efeito sinérgico contra várias linhas de células de câncer de mama e, além disso, co carregando DOX e MMC dentro nanopartículas de lipídios-polímero híbrido (DMPLN) superaram vários resistente a múltiplas drogas associado efluxo bombas (por exemplo, P-glicoproteína e proteína resistente ao cancro da mama)19,20,21. In vivo, DMPLN habilitado entrega co espaço-temporal de DOX e MMC para localizações tumorais e maior biodisponibilidade de drogas dentro de células de câncer, conforme indicado pela moderação da formação do metabólito DOX doxorubicinol (DOXol)22. Como resultado, o DMPLN reforçada a apoptose de células do tumor, inibição de crescimento do tumor e sobrevivência de acolhimento prolongado em comparação a livre combinação de DOX e MMC ou um lipossomal DOX formulação22,23,24, 25.
Analisando a quantidade real de drogas fornecido em parceria pela nanocarreador é fundamental para a concepção de formulações de nanopartículas eficaz. Muitos métodos foram desenvolvidos para analisar o nível plasmático de único doses DOX ou MMC usando alta cromatografia líquida (HPLC) sozinha ou em combinação com a espectrometria de massa (MS)26,,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. no entanto, estes métodos são muitas vezes demorado e impraticável para a terapia de combinação como um grande número de amostras biológicas precisa ser preparados separadamente para análise de múltiplas drogas (às vezes incluindo metabolitos de drogas). Além da ligação às proteínas plasmáticas forte de DOX e MMC, glóbulos vermelhos também têm uma grande capacidade de vincular e concentrar muitas drogas anticâncer35,36. Assim, a análise de plasma para DOX ou MMC pode ofuscar concentrações de droga de sangue real. O presente trabalho (Figura 1) descreve uma maneira simples e robusto método de análise de drogas múltiplas usando fase reversa HPLC para extrair simultaneamente e dosar DOX, MMC e o DOX metabólito doxorubicinol (DOXol) de sangue total e diversos tecidos ( por exemplo, tumores). Foi aplicado com sucesso para determinar a farmacocinética e bio-distribuição de DOX e MMC, bem como a formação de DOXol após a entrega da droga através de soluções livres ou formas de nanopartículas (i.e., DMPLN e DOX lipossomal) em um orthotopically implantou o modelo de rato da mama-tumor murino após a intravenosa (i.v.) injeção22.

<table><tbody><tr><td>Doxorrubicina&nbsp;</td><td>Polymed Theraeutics</td><td>111023</td><td>medicamento anticâncer</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Polymed Theraeutics</td><td>060814</td><td>medicamento anticâncer</td></tr><tr><td>Doxorrubicinol (DOXol)</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>D558020</td><td>Metabólito do</td></tr><tr><td>sal de sódio DOX 4-metilumbeliferona&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1508</td><td>Padrão interno</td></tr><tr><td>Myristic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-63-8&nbsp; &nbsp;</td><td>Materiais para nanopartículas híbridas polilipídicas</td></tr><tr><td>Espectro de estearato de polioxietileno (100)</td><td></td><td>M1402</td><td>Materiais para nanopartículas híbridas polilipídicas</td></tr><tr><td>Polioxietileno (40) Estearato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3440</td><td>Materiais para nanopartículas híbridas polilipídicas</td></tr><tr><td>Pluronic F68 (PF68)</td><td>BASF Corp.</td><td>9003-11-6</td><td>Materiais para nanopartículas híbridas polilipídicas</td></tr><tr><td>Ultrassom (UP100H)</td><td>Hielscher, Tecnologia de Ultrassom</td><td>NA</td><td>Preparação de nanopartículas</td></tr><tr><td>Banho-maria (ISOTEMP 3016HS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NA</td><td>Preparação de nanopartículas</td></tr><tr><td>Doxorrubicina lipossomal&nbsp; (Caelyx)</td><td>Janssen</td><td>Comprado na farmácia Princess Margaret Hospital</td><td>Formulação de nanopartículas clinicamente aprovada</td></tr><tr><td>Metanol graduado por HPLC</td><td>Caledon Chemicals</td><td>6701-7-40</td><td>Composição de fase móvel HPLC</td></tr><tr><td>Classificação HPLC H2O</td><td>Caledon Chemicals</td><td>8801-7-40</td><td>HPLC composição de fase móvel</td></tr><tr><td>Acetonitrila graduada por HPLC&nbsp;</td><td>Caledon Chemicals</td><td>1401-7-40</td><td>Composição da fase móvel da HPLC</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td>Composição da fase móvel da HPLC</td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Papel de filtro de membrana de nylon</td><td>Whatman</td><td>WHA7404004</td><td>HPLC preparação de fase móvel</td></tr><tr><td>1cc Seringas de plástico</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>2606-309659</td><td>Injeção de tratamento</td></tr><tr><td>5cc Seringas de plástico</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>2608-309646</td><td>Coleções de tecidos</td></tr><tr><td>30G 1/2 agulhas</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305106</td><td>injeção de tratamento</td></tr><tr><td>Agulhas 25G 5/8</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305122</td><td>Coleções de tecidos</td></tr><tr><td>Estéril 0,9% Salino</td><td>Universidade de Toronto Marca da Casa</td><td>1011</td><td>Perfusão de tecidos</td></tr><tr><td>13 ml Tubo cônico de fundo arredondado&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>62.515.006</td><td>Proliproleno, homogeneização de tecidos</td></tr><tr><td>Meio Essencial Mínimo Alfa (MEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12571063</td><td>Cell medium</td></tr><tr><td>1 x Tampão de fosfato Salino</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Homogeneização de tecidos</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100 ML</td><td>Homogeneização de tecidos</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Caledon Chemicals</td><td>1/5/3840</td><td>Ajuste o pH para solvente de extração</td></tr><tr><td>Tubos de plástico pulverizados com heparina sódica</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>367878</td><td>Coleta de Sangue</td></tr><tr><td>Balança de Pesagem Analítica&nbsp;</td><td>Sartório&nbsp;</td><td>CPA225D</td><td>medidores de</td></tr><tr><td>pH NA&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-637-671</td><td>accumet BASIC</td></tr><tr><td>Vortex Mixter</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-365</td><td>Amostras de vórtice na velocidade desejada</td></tr><tr><td>1.5 ml&nbsp; Tubo de microcentrífuga</td><td>Fisherbrand</td><td>2043-05408129</td><td>Homogeneizador Prolyprolene</td></tr><tr><td>Modelo 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-672</td><td>Centrifugador de homogeneização de tecidos</td></tr><tr><td>5702R</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td>Preparação de extração</td></tr><tr><td>Sistema de evaporador aquecido</td><td>Glas-Col</td><td>NA</td><td>Reconstituição de amostras</td></tr><tr><td>Frascos de rosca de parafuso HPLC</td><td>DIKMA</td><td>5320</td><td>Injeção de amostra de HPLC</td></tr><tr><td>Tampas de rosca HPLC com septos de silicone branco PTFE</td><td>DIKMA</td><td>5325</td><td>Injeção de amostra de HPLC</td></tr><tr><td>Inserção de polipropileno HPLC&nbsp; &nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0549</td><td>Volume máximo 250 &mu; l, injeção de amostra de HPLC</td></tr><tr><td>Xbridge C18 Column</td><td>Waters Corporation</td><td>186003117</td><td>Análise de drogas</td></tr><tr><td>Bomba gradiente&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W600</td><td>Amostrador automático de análise de drogas</td></tr><tr><td></td><td>Waters Corporation</td><td>W2707</td><td></td></tr><tr><td>Detector de matriz de fotodiodos de análise de drogas&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W2998</td><td>Análise de medicamentos</td></tr><tr><td>Multi &lambda; detector de fluorescência&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W2475</td><td>Análise de drogas</td></tr><tr><td>EMPOWER 2</td><td>Waters Corporation</td><td>NA</td><td>Software de análise de dados</td></tr><tr><td>Scientist</td><td>Micromath</td><td>NA</td><td>Análise farmacocinética</td></tr><tr><td>Camundongos Balb/c fêmeas</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001026</td><td>In vivo</td></tr><tr><td>EMT6/WT Células de câncer de mama</td><td>fornecidas pelo Dr. Ian Tannock; Instituto do Câncer de Ontário</td><td>NA</td><td>In vivo</td></tr></tbody></table>

extração de amostra e quantificação cromatográfica simultânea de doxorrubicina e mitomicina c após entrega de combinação de drogas em nanopartículas para ratos de tumor-rolamento

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Quimioterapia de combinação é frequentemente usada na clínica para tratamento de câncer; no entanto, os efeitos adversos associados ao tecido normal podem limitar seu benefício terapêutico. Combinação de drogas baseados em nanopartículas foi mostrada para atenuar os problemas encontrados pela terapia de combinação livre de drogas. Nossos estudos anteriores têm demonstrado que a combinação de duas drogas anticâncer, doxorrubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), produziu um efeito sinérgico contra ambos murino e células de câncer de mama humano em vitro. Nanopartículas de híbrido de polímero carregado co-lipídico DOX e MMC (DMPLN) através de várias bombas de transportador de efluxo que conferem multirresistência e demonstrada eficácia reforçada em modelos de tumor de mama. Em comparação com formas de solução convencional, tal eficácia superior de DMPLN foi atribuída à farmacocinética sincronizada de DOX e MMC e biodisponibilidade de aumento intracelular de drogas dentro de células de tumor habilitado pelo nanocarreador PLN.
Para avaliar a farmacocinética e bio-distribuição de co administrado DOX e MMC em solução livre e formas de nanopartículas, um método de análise de múltiplas drogas simples e eficiente usando reverso-fase de alto desempenho foi de cromatografia líquida (HPLC) desenvolvido. Em contraste com os métodos anteriormente relatados que analisaram DOX ou MMC individualmente no plasma, esse novo método HPLC é capaz de dosar simultaneamente DOX, MMC e um metabolito principal de DOX cardio-tóxico, doxorubicinol (DOXol), em diferentes matrizes biológicas ( por exemplo, sangue total, tumor de mama e coração). Uma dupla sonda fluorescente e ultravioleta de absorvente 4-methylumbelliferone (4-MU) foi usado como um padrão interno (I.S.) para a deteção de uma etapa de análise de drogas múltiplas com comprimentos de onda diferentes da deteção. Este método foi aplicado com sucesso para determinar as concentrações de DOX e MMC entregado por abordagens tanto nanopartículas e solução no sangue e vários tecidos em modelo murino de tumor de mama um ortotópico. O método analítico apresentado é uma ferramenta útil para a análise pré-clínico de entrega baseados em nanopartículas de combinações de drogas.

Duas drogas anticâncer, DOX e MMC, bem como o metabólito DOX, DOXol, foram detectado simultaneamente sem qualquer interferência biológica sob a condição HPLC aplicada mesma gradiente usando 4-MU como o I.S. para os detectores de UV e fluorescência. DOX, MMC, DOXol e 4-MU foram bem separados uns dos outros com tempos de retenção de 5,7 min para MMC, 10,4 min para DOXol, 10,9 min para 4-MU e 11,1 min para DOX (Figura 2). Cada fármaco no sangue e vários tecidos ...

Este protocolo descreve um processo analítico eficiente e conveniente de extração de amostra e determinação simultânea de múltiplas drogas, doxorrubicina (DOX), mitomicina C (MMC) e um metabólito tóxico cardio DOX, doxorubicinol (DOXol), no biológico amostras de um modelo de tumor de mama pré-clínico tratadocom com formulações de nanopartículas de combinação sinérgica de drogas.

Extração de amostra e quantificação cromatográfica simultânea de doxorrubicina e mitomicina C após entrega de combinação de drogas em nanopartículas para ratos de Tumor-rolamento

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

O objetivo geral deste protocolo analítico é extrair e quantificar simultaneamente os dois medicamentos anticâncer Doxorrubicina e Mitomicina C, co-entregues por nanopartículas híbridas poliméricas-lipídicas, e o metabólito da Doxorrubicina, Doxorrubicinol, em matrizes biológicas usando um método simples e robusto de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da nanomedicina, como projetar um sistema de nanotransporte eficaz baseado na nanofarmacocinética de combinações de medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a quantificação simultânea de três compostos de fármacos na mesma matriz biológica, sem a necessidade de alterar a fase móvel da HPLC.Portanto, esse método pode fornecer informações sobre os comportamentos biológicos da doxorrubicina, mitomicina C e doxorrubicinol em tumores primários de mama. Também pode ser aplicado a outros tipos de câncer tratados com medicamentos semelhantes. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas eficientes de preparação da amostra são difíceis de aprender.Para iniciar este procedimento, colete e congele todo o sangue, os princ

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Insonação de microbolhas é uma estratégia promissora para a ablação do tumor em reduzido tempo médio poderes acústica, bem como para a entrega prevista para terapêutica. O objetivo do presente estudo é desenvolver estratégias de ciclo de baixa dever de ultra-som pulsante e nanocarriers para maximizar a não-térmicos ablação microvascular e entrega de carga útil para subcutânea C6 gliomas.

O ultra-som contraste Targeted Tratamento de Gliomas em camundongos através de Drogas Levando-entrega de nanopartículas e Ablação Microvascular

Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento...

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

Este artigo detalha os procedimentos para a análise das nanopartículas tumor-alvo, Herdox imageamento óptico. Em particular, o uso detalhado do aparelho de imagem para detecção do tumor multimodo alvo e avaliar a penetração do tumor é descrito aqui.

Análise de Proteína Viral alvejado Nanopartículas entregue para tumores HER2 +

Um exemplo de uma droga baseada em nano ácido polymalic é apresentado para o desenho racional de medicina personalizada que é aplicável para o cancro. Ela descreve a síntese de um fármaco nano para tratar o cancro da mama humano HER2-positivos em um ratinho nu.

À base de ácido Polymalic Nano Biopolímeros para Segmentação de múltiplos marcadores tumorais: uma oportunidade para a medicina personalizada?

Descrevemos aqui o método de imagem baseada em microscopia fluorescente confocal de fibra (FCFM), que fornece um modo inovador para entender fenômenos fisiológicos nos níveis celular e subcelular em animais.

Induzida pela quimioterapia Vascular Toxicidade - em tempo real<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de Impairment Vessel

O acúmulo intratumoral heterogêneo de lipossomas tem sido associado a um microambiente tumoral anormal. Aqui são apresentados métodos para medir a microcirculação tumoral por imagem de perfusão e pressão elevada do fluido intersticial (IFP) usando um sistema robótico guiado por imagem. As medições são comparadas ao acúmulo intratumoral de lipossomas, determinado por meio de microtomografia computadorizada volumétrica.

Medidas espaciais de Perfusão, intersticial pressão do produto e lipossomas Acumulação em tumores sólidos

Um protocolo para a preparação e caracterização de doxorrubicina lipofílico pró-fármaco carregado 1,2-distearoyl--sn-glicero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polietileno glicol) -2000] (DSPE-PEG) micelas é descrito.

Preparação e caracterização de Lipofílica Doxorrubicina micelas Pro-drogas

As nanopartículas são emergente sistemas de entrega de drogas como promissores para uma variedade de indicações. Aqui, descrevemos um método simples, mas poderosa para a fabricação de nanopartículas de seda usando engenharia reversa de seda Bombyx mori. Estas nanopartículas de seda pode ser facilmente carregado com uma carga útil terapêutica e subsequentemente exploradas para aplicações de entrega de drogas.

Fabricação e entrega da droga Aplicações de seda Nanopartículas

A má compreensão do desempenho in vivo dos nanomedicamentos impede sua tradução clínica. Procedimentos para avaliar o comportamento in vivo de nanomedicamentos contra o câncer em níveis sistêmicos, teciduais, unicelulares e subcelulares em camundongos imunocompetentes portadores de tumor são descritos aqui. Essa abordagem pode ajudar os pesquisadores a identificar nanomedicamentos promissores contra o câncer para tradução clínica.

Um método completo para avaliar o<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance of Cancer Nanomedicinas

Neste protocolo, as nanopartículas de ouro modificadas AS1411-g-PEI-g-PEG são sintetizadas através de reações de meio-médio de três etapas. Em seguida, a doxorubicina é carregada e entregue às células cancerígenas alvo para a terapia contra o câncer.

Síntese de Nanopartículas de ouro modificada Aptamer-PEI-g-PEG carregadas com doxorubicina para entrega de drogas direcionadas

Aqui, descrevemos o protocolo para entrega in vivo de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro carregando oligômeros de RNA para câncer de mama metastático em modelos animais, fornecendo uma abordagem clinicamente viável para o silenciamento terapêutico de ácidos nucléicos oncogênicos.

Monitoramento do acúmulo de nanodrogas em metástases de câncer de mama murino

Aprenda a extrair e quantificar simultaneamente Doxorrubicina, Mitomicina C e Doxorrubicinol em amostras biológicas usando cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa. Este método robusto facilita pesquisas em nanomedicina e farmacocinética.

Extração de amostra e quantificação cromatográfica simultânea de doxorrubicina e mitomicina C após entrega de combinação de drogas em nanopartículas para ratos de Tumor-rolamento (Vídeo) | JoVE Journal

Extração de amostra e quantificação cromatográfica simultânea de doxorrubicina e mitomicina C após entrega de combinação de drogas em nanopartículas para ratos de Tumor-rolamento

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