Extração de amostra e quantificação cromatográfica simultânea de doxorrubicina e mitomicina C após entrega de combinação de drogas em nanopartículas para ratos de Tumor-rolamento

O objetivo geral deste protocolo analítico é extrair e quantificar simultaneamente os dois medicamentos anticâncer Doxorrubicina e Mitomicina C, co-entregues por nanopartículas híbridas poliméricas-lipídicas, e o metabólito da Doxorrubicina, Doxorrubicinol, em matrizes biológicas usando um método simples e robusto de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da nanomedicina, como projetar um sistema de nanotransporte eficaz baseado na nanofarmacocinética de combinações de medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a quantificação simultânea de três compostos de fármacos na mesma matriz biológica, sem a necessidade de alterar a fase móvel da HPLC.

Portanto, esse método pode fornecer informações sobre os comportamentos biológicos da doxorrubicina, mitomicina C e doxorrubicinol em tumores primários de mama. Também pode ser aplicado a outros tipos de câncer tratados com medicamentos semelhantes. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas eficientes de preparação da amostra são difíceis de aprender.

Para iniciar este procedimento, colete e congele todo o sangue, os principais órgãos e o tumor de mama, conforme descrito no protocolo de texto. Pese rapidamente os tecidos congelados e registre o peso no caderno de laboratório. Em seguida, transfira-os para um tubo cônico de fundo redondo de 13 mililitros.

Em seguida, adicione entre um e cinco mililitros de tampão de lise celular gelado. Usando um homogeneizador manual elétrico, homogeneizar o tecido com um movimento de curso para cima e para baixo no gelo a 18.000 rpm. Depois disso, lave a sonda geradora de dente de serra de 10 milímetros do homogeneizador com água destilada deionizada.

Lave a sonda com etanol a 70% e depois novamente com água destilada deionizada. Transfira 50 microlitros de homogeneizado de tecido ou sangue total para um tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitro. Em seguida, crave com cinco microlitros de um padrão interno de 2.000 nanogramas por mililitro de 4-metilumbeliferona.

Adicione um solvente de extração gelado contendo 150 microlitros de acetonitrila e 100 microlitros de acetato de amônio cinco milimolares. Vortex vigorosamente a mistura por dois minutos. Centrifugar a 3 000 g e a quatro graus Celsius durante 10 minutos.

Depois disso, transfira 200 microlitros do sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco e pré-resfriado. Use um fluxo lento de gás nitrogênio para evaporar o sobrenadante a 60 graus Celsius com proteção contra a luz. Em seguida, reconstitua o resíduo seco com 100 microlitros de metanol gelado.

Vórtice vigorosamente por 30 segundos. Centrifugar a 3 000 g e a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para um frasco para injetáveis de HPLC.

Coloque os frascos para injetáveis de amostra em uma bandeja de amostrador automático para injeção. Para começar, prepare a fase móvel de HPLC conforme descrito no protocolo de texto. Defina as condições iniciais da composição da fase móvel para 16,5% H2O e 83,5% acetonitrila.

Defina a taxa de fluxo isocrática para 1.0 mililitros por minuto. Em seguida, separe os medicamentos usando a condição de fase móvel gradiente, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, defina o detector UV em dois canais: um em 310 nanômetros para o padrão interno 4-Metilumbeliferona e outro em 360 nanômetros para Mitomicina C. Depois disso, defina o primeiro canal do detector de florescência para um comprimento de onda de excitação de 365 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 445 nanômetros para 4-Metilumbeliferona.

Defina o segundo canal para um comprimento de onda de excitação de 480 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 560 nanômetros para doxorrubicina e doxorrubicinol. Para começar, use o amostrador automático para injetar 15 microlitros da amostra. A composição da fase móvel do gradiente programado muda automaticamente, aumentando a composição da acetonitrila de zero a 18 minutos.

Após 18 minutos, a condição da fase móvel é restabelecida para a condição inicial e reequilibrada para a próxima injeção. Após a execução de cada amostra, observe os picos dos compostos da droga e seus tempos de retenção. Em seguida, use o software HPLC para integrar a área de pico sob a curva para os compostos de medicamentos.

Calcule a porcentagem de recuperação do medicamento e a proporção da área sob a curva entre cada composto do medicamento e o padrão interno, conforme descrito no protocolo de texto. Neste procedimento, dois medicamentos anticancerígenos, Doxorrubicina e Mitomicina C, juntamente com o metabólito da Doxorrubicina, Doxorrubicinol, são detectados sem interferência biológica. A análise por HPLC mostra que cada medicamento está bem separado dos outros.

O método de HPLC desenvolvido apresenta menos de 15% de variação na precisão e exatidão intra e interdia para cada um dos fármacos estudados, tanto no sangue total quanto em várias matrizes biológicas, indicando excelente reprodutibilidade. A farmacocinética e a biodistribuição da co-entrega baseada em nanopartículas circulantes longas ou peguiladas de doxorrubicina e mitomicina C são então determinadas. No sangue, as concentrações de medicamentos entregues por nanopartículas híbridas poliméricas-lipídicas ao longo do tempo são pelo menos seis vezes maiores do que nas soluções de medicamentos livres equivalentes.

Em um tumor de mama ortotópico, as nanopartículas híbridas de polímero-lipídio podem co-fornecer doxorrubicina e mitomicina C em sua proporção sinérgica de drogas. Em comparação com a solução livre de drogas, as nanopartículas apresentam aumento do acúmulo de tumores. Isso se deve à circulação sistemática prolongada, que permite que as nanopartículas explorem os efeitos aprimorados de permeabilidade e retenção do tumor.

Além disso, a formação quantitativamente determinada de doxorrubicinol no tumor de mama ao longo de 24 horas, juntamente com a apoptose tumoral aprimorada, indica que a biodisponibilidade do medicamento é crítica no projeto de uma formulação eficaz de nanopartículas. Usando este método de HPLC, foi demonstrado com sucesso que as nanopartículas híbridas de polímero-lipídio podem fornecer com precisão uma combinação sinérgica de medicamentos em células cancerígenas in vivo, levando a uma quimioterapia aprimorada. Esta técnica pode ser feita em cerca de duas horas se for executada corretamente.

Para minimizar a potencial depredação do medicamento, é importante lembrar de evitar a luz solar direta e manter a amostra no gelo ao tentar este procedimento. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para o pesquisador no campo da nanomedicina explorar a nanofarmacocinética da combinação de drogas e projetar melhor a formulação eficaz de nanopartículas para a terapia do câncer. Depois de assistir a este vídeo, você deve entender como extrair simultaneamente e detectar a doxorrubicina, a mitomicina C e o metabólito da doxorrubicina, o doxorrubicinol, em uma ampla gama de amostras biológicas contendo nanopartículas carregadas na combinação de drogas.

Não se esqueça de que trabalhar com medicamentos anticancerígenos e ácidos pode ser extremamente perigoso, e precauções de segurança, como usar luvas, óculos de proteção e jalecos, devem sempre ser aplicadas durante a execução deste protocolo.