Name: Geração rápida e perfeita de vírus de varíola recombinante usando faixa de host e seleção visual (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a gerar vírus de varíola recombinantes sem cicatrizes usando seleção de faixa de hospedeiro e marcadores fluorescentes. Este método combina recombinação homóloga com seleção dominante transitória para modificação viral eficiente.

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Este projeto foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (AI114851) à RS.

1. Gerar o vetor de recombinação
<ol><li>Projete primers para gerar o de seleção. Projete cada amplicon individual com seqüências sobrepostas com amplicons vizinhos e o vetor para facilitar a montagem enzimática isotérmica de moléculas de DNA, também chamada de montagem gibson, usando qualquer uma das várias ferramentas de design de primer on-line. NOTA: Este protocolo também pode ser concluído usando métodos tradicionais de clonagem baseadaem endonuclease. Nesse caso, os primers de design com os locais de restrição apropriados em vez de com seqüências sobrepostas.</li>
	<li>Utilizando os primers projetados na etapa 1.1, o PCR amplifica os seguintes elementos em ordem de 5' a 3'(Figura 1): ~500 nucleotídeos da região genômica VACV 5' do braço E3L (5'), EGFP ou o gene de interesse, ~150 nucleotídeos da região genômica VACV imediatamente 3' de E3L (braço curto de 3'),um promotor de poxvirus precoce/tardio sintético25, o gene de fusão mCherry-E3L, e ~500 nucleotídeos da região genômica VACV 3' de E3L, incluindo o braço curto de 3' (braço longo de 3').<ol>
<li>Em um tubo PCR, adicione os reagentes na seguinte ordem para cada amplicon: 17 μL de água livre de DNase, 1,2 μL de cada primer (concentração inicial = 10 μM, concentração final = 0,5 μM), 5 μL de tampão de reação PCR de 5x, DNA do modelo (10 ng para amplicons amplificados a partir de plasmídeos: EGFP e E/L promotor-mCherry-E3L cassete; 100 ng para amplicons amplificados a partir de DNA genômico viral: 5' e 3' braços), e 0,5 μL de DNA polimerase. Ajuste o volume de água adicionado para um volume de reação final de 50 μL. NOTA: A concentração do DNA do modelo deve ser empiricamente determinada, mas geralmente começamos com 10 ng/reação.</li>
		<li>Coloque o tubo em um termociclador e derreta o DNA a 98 °C por 30 s e use 25 rodadas de um protocolo PCR de três etapas: 98 °C para 5 s, 55 °C para 10 s e 72 °C para 1 min. NOTA: Determine a temperatura de fusão com base no Tm sugerido pelo fabricante para cada conjunto de primer. Determine o tempo de extensão apropriado com base no comprimento de cada amplicon (1 minuto/kb).</li>
	</ol></li>
	<li>Visualize os produtos de amplificação em um gel de agarose de 1%. Adicione 10 μL de cada produto de DNA e 2 μL de tampão de carga para cada poço, e execute a 8 V/cm por 1 h.</li>
	<li>O gel purifica cada amplicon usando um kit de extração de gel de DNA e o protocolo do fabricante. Eluie os amplicons da coluna adicionando 50 μL de água livre de DNase e imediatamente centrifugando.</li>
	<li>Linearize o vetor de clonagem pUC19 utilizando digestão de endonuclease EcoRI. A um tubo, adicione 1 μg de pUC19, água a um volume de 17 μL, 2 L de tampão de reação e 1 μL (20 unidades) de EcoRI. Incubar a 37 °C por 1h.<ol>
<li>Visualize os produtos de amplificação em um gel de agarose de 1% executado a 8 V/cm por 1 h. Excise a banda do gel e purifique o produto usando o kit de extração de gel de DNA conforme descrito na etapa 1.4.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligatodos os amplicons individuais, purificados em gel e o vetor linearizado usando um kit de mistura mestre.<ol>
<li>Em um tubo PCR, adicione 0,2 pmol de pUC19 linearizado e cada amplicon (braço de 5', EGFP, braço curto de 3'', E/L promoter-mCherry-E3L, 3'arm). Adicione água livre de DNase a um volume final de 10 μL e, em seguida, adicione 10 μL de mistura mestre de montagem de DNA. Incubar amostras a 50 °C por 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Transforme e. coli quimicamente competente com 2 μL do produto montado a partir da etapa 1.6 como descrito anteriormente26,27. Placa de 100 μL das células transformadas em placas de agarose LB contendo ampicillina de 100 μg/mL. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.</li>
	<li>Escolha colônias bem isoladas e transfira colônias individuais para tubos contendo caldo luria com ampicillina de 100 μg/mL. Incubar os tubos durante a noite a 37 °C enquanto agita a 225 rpm.</li>
	<li>Isole os plasmídeos da cultura durante a noite usando um miniprep plasmídeo. Verifique a concentração e pureza do DNA usando um espectrofotômetro. Uma razão A260/A280 entre 1,8 e 2,0 é aceitável.</li>
	<li>Envie os plasmídeos para sequenciamento de Sanger para determinar se o produto de clonagem desejado está correto. Armazene o DNA a -20 °C.</li>
</ol>2. Gerar o vírus recombinante
<ol><li>Infectar uma monocamada confluente de células adequadas com o vírus a ser recombinada em uma multiplicidade de infecção de 1,0 (MOI = 1,0) em uma placa de 6 poços. Incubar as células infectadas a 37 °C e 5% de CO2 por 1 h. Em seguida, aspirar o meio e substituí-lo por DMEM fresco. Incubar as células infectadas a 37 °C e 5% de CO2. NOTA: Para a replicação, é apropriado para a replicação de vírus competentes, como um vírus de vacinação que não tenha K3L22, uma linha celular como a linha europeia de células renais de coelho RK13 (ATCC #CCL-37) ou BSC-40. No entanto, para a replicação de vírus deficientes, como o vírus descrito neste artigo, sem ambos os antagonistas PKR E3L e K3L, uma linha celular complementar expressando esses dois genes em células trans ou PKR knock-down ou knock-out são necessárias.</li>
	<li>Transfect as células infectadas com 500 ng do vetor gerado e validado na etapa 1.10 utilizando um reagente de transfecção comercialmente disponível seguindo o protocolo do fabricante. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 por 48 h. NOTA: Se o uso de um vírus de vaccinia sem E3L e K3L, a pressão seletiva mediada por PKR conduzirá a seleção de vírus recombinados e manterá a expressão da proteína de fusão mCherry-E3L nessas células. Se desejar, também deve ser possível amplificar apenas a inserção para uso para transfecção em vez de todo o plasmídeo.</li>
	<li>48 horas após a infecção, colher a monocamada infectada. Em alguns casos, as células podem ser colhidas por pipetting, mas se ainda estiverem firmemente aderidas, colhe-as com um raspador de células. Congele as células três vezes e, em seguida, sônica os lisatos por 15 s a 50% de amplitude. Guarde este lysate a -80 °C até estar pronto para usar.</li>
	<li>Diluir em série 10 vezes o lysato colhido na etapa 2.3 de 10-1 a 10-6 adicionando 120 μL do lysate a 1080 μL de DMEM (10-1), e depois adicionando 120 μL desta diluição a 1080 μL de DMEM (10-2), e repetindo este processo mais quatro vezes. Adicione 1 mL de cada diluição a um indivíduo, confluente bem de uma linha celular competente PKR, neste caso células RK13.<ol>
<li>Incubar as células infectadas a 37 °C e 5% de CO2 por 1 h. Em seguida, aspirar o meio e substituí-lo por dmem fresco Incubar as células infectadas a 37 °C e 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>24 a 48 horas após a infecção, identificar vírus recombinantes por microscopia de fluorescência. Placas de vírus recombinantes expressam fluorescência vermelha devido à integração do gene de fusão mCherry-E3L(Figura 2). Se um vírus desprovido de inibidores de PKR foi usado inicialmente, todas as placas conterão vírus recombinante.</li>
	<li>Placa purifica vírus recombinantes três vezes em células RK13. Após a rodada final de purificação da placa, todas as placas devem expressar fluorescência vermelha.</li>
	<li>Infectar uma placa de 6 poços confluente de células RK13 expressando os inibidores DE PKR VACV E3L e K3L (células RK13+E3L+K3L28) com o vírus fluorescing vermelho purificado da placa do passo 2.6. Aponte para aproximadamente 50-100 placas por poço. NOTA: Essas células fornecem os antagonistas do VACV PKR em trans e aliviam a pressão seletiva mediada pelo PKR para manter o gene de fusão mCherry-E3L, promovendo assim a geração "sem carro" do vírus recombinante.</li>
	<li>Identificar vírus colapsados por microscopia de fluorescência usando um microscópio EVOS2, e um cubo de filtro GFP (Excitação: 470/22, Emissão: 525/50) e um cubo de filtro RFP (Excitação: 531/40, Emissão: 593/40). NOTA: A frequência em que o gene de fusão mCherry-E3L é perdido é de aproximadamente 2,5%(Tabela 2). Se o EGFP não for incluído como um gene marcador, placas de vírus mutantes que perderam o gene de fusão mCherry-E3L serão incolores.</li>
	<li>Placa purificar placas verdes (VC-R4) ou incolores (E3L) três vezes em células RK13+E3L+K3L. Certifique-se de que nenhuma placa fluoresce vermelho.</li>
	<li>Confirme a perda de mCherry-E3L e a presença da mutação esperada pelo sequenciamento PCR e Sanger. NOTA: Se o gene ou mutação de interesse não tiver atividade inibitória de PKR, os vírus recombinantes devem ser cultivados em células RK13+E3L+K3L ou em uma linha celular deficiente de PKR equivalente(Figura 3).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Aqui apresentamos uma variação de uma estratégia transitória de seleção de marcadores 32 para gerar vírus de vaccinia recombinantes sem reter DNA estranho no vírus recombinante final. Nossa estratégia usa pressão seletiva mediada pelo PKR de proteína antiviral hospedeira em vez de outras formas de pressão seletiva, como antibióticos. O uso de genes antivirais hospedeiros elimina a possibilidade de alterações pheotípicas quimicamente induzidas nas células, ou aumento do risco de mutação devido a dr...

O vírus da vaccinia (VACV) foi fundamental para a primeira erradicação bem sucedida de um patógeno humano, o vírus variola (VARV), da natureza. Desde o extermínio do vírus variola, os vírus da varíola, incluindo o VACV, continuam a ser vírus terapêuticos úteis para a medicina humana e animal. Por exemplo, uma vacina contra o vírus da raiva baseada em VACV tem sido muito eficaz na prevenção da transmissão da raiva silvestre na Europa1 e nos Estados Unidos2. Mais recentemente, os vírus da varíola recombinantes que expressam uma variedade de moléculas antitumorais (por exemplo, anticorpos de cadeia única ou eritropoietina humana) têm visto sucesso encorajador como agentes oncolíticos3,4,5. O VACV é particularmente atraente como vetor porque é facilmente passível de manipulação genética, possui uma ampla gama de hospedeiros, e é estável sob uma variedade de condições, permitindo fácil transporte e viabilidade vacinal no campo6,7. Embora várias técnicas tenham sido desenvolvidas para gerar VACV recombinante para experimentos laboratoriais e geração de vacinas, as estratégias atuais para gerar esses vírus têm limitações notáveis.
Devido à utilidade do VACV, várias estratégias para gerar vírus recombinantes foram desenvolvidas. A primeira estratégia emprega recombinação homóloga para introduzir um incluindo o transgene e um gene marcador selecionável, como um gene de resistência a antibióticos. O é ladeado por dois ~500 nucleotídeos (nt) ou braços maiores direcionando o gene para um local específico no genoma viral, que é então integrado por eventos de crossover duplo8,9,10. Essa estratégia é rápida e eficiente; no entanto, resulta em material genético extra na forma do gene marcador que pode produzir efeitos inesperados. Além disso, há um limite superior prático para o número de transgenes que pode ser introduzido limitado pelo número de marcadores selecionáveis únicos disponíveis. As estratégias transitórias de seleção dominante (TDS) abordaram essa questão facilitando a geração de vírus recombinantes "sem carro"11. Usando essa estratégia, um plasmídeo contendo um gene VACV mutante e um gene marcador selecionável são integrados ao genoma viral, mas sem dna vacv adicional. Esta abordagem resulta na integração transitória de todo o plasmídeo e duplicação do gene VACV como resultado da integração por um único evento de crossover. Este intermediário é estável desde que seja mantido sob pressão de seleção, permitindo o enriquecimento deste construto. Quando a seleção é removida, a duplicação vacv permite um segundo evento de crossover que resulta na remoção do plasmídeo e posterior formação do tipo selvagem (wt) ou do vírus recombinante em uma razão aproximada de 50:50. Enquanto o TDS gera vírus recombinantes sem exigir a introdução estável de DNA estranho, vários clones de vírus devem ser rastreados para a mutação esperada por meio da análise de sequenciamento, um passo potencialmente demorado e caro.
Aqui, apresentamos uma abordagem para a geração de porcavírus recombinantes combinando os melhores aspectos de cada uma dessas abordagens, semelhante a uma abordagem que foi descrita para a replicação incompetente da vaccinia modificada Ancara12,,13,14. Essa estratégia combina a seleção visual e de alcance do host para gerar rapidamente vírus recombinantes por eventos de crossover duplo e, posteriormente, eliminar o gene marcador selecionável por recombinação homóloga. Esta abordagem permite a rápida geração de mutantes mediados pela recombinação homóloga, com a natureza "sem brilho" das abordagens TDS, ao mesmo tempo em que não requer um passo de triagem subsequente para distinguir vírus selvagens e mutantes. Nosso método também utiliza a seleção da faixa do hospedeiro no lugar da seleção de antibióticos, eliminando o risco de alterações pheotípicas quimicamente induzidas na linha celular. Para esta abordagem, optamos por usar o host antiviral protein kinase R (PKR) como agente seletivo para gerar VACV recombinante. PKR é expresso como um monômero inativo na maioria dos tipos de células15. Ao vincular o RNA de dupla revasão (dsRNA) nos domínios n-terminal de ligação de dsRNA, o PKR dimeriza e é autofosforilado16. Esta forma ativa de PKR fosforila a subunidade alfa do fator de iniciação eucariótica 2 (eIF2), inibindo, em última análise, a entrega do iniciador methionyl-tRNA ao ribossomos, impedindo assim a tradução intracelular e inibindo amplamente a replicação de muitas famílias de vírus17,18.
Em resposta à ampla e potente atividade antiviral do PKR, muitos vírus desenvolveram pelo menos uma estratégia para impedir a ativação do PKR. A maioria dos vírus da varíola expressa dois antagonistas PKR, codificados pelos genes E3L e K3L no VACV, que antagonizam o PKR através de dois mecanismos distintos19. O E3 previne a homodimerização do PKR vinculando o RNA de dupla recadenação20,21, enquanto o K3 atua como um inibidor pseudosubstrato, vinculando-se diretamente ao PKR ativado e, assim, inibindo a interação com o seu substrato eIF2α22. É importante ressaltar que esses dois antagonistas pkr não necessariamente inibem o PKR de todas as espécies. Por exemplo, o homolog K3 do vírus da ovelhapox inibiu fortemente o PKR das ovelhas, enquanto o homolog sheeppox E3 não mostrou uma inibição considerável de PKR23,24. Neste estudo, apresentamos um método para usar a pressão seletiva mediada por PKR combinada com a seleção de fluorescência para gerar um REcombinante VACV excluído para E3L e K3L (VC-R4), que não pode se replicar em células competentes pkr derivadas de espécies diversas. Este vírus recombinante fornece um excelente fundo para a geração rápida de vírus recombinantes que expressam genes sob controle do promotor Nativo E3L.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492L</td><td>Polimerase de alta fidelidade usada em PCR</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11593027</td><td>Agente seletivo bacteriano</td></tr><tr><td>Raspadores de células descartáveis</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-100-242</td><td>Raspador de células para colher células infectadas</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2 Sistema de imagem celular</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMAFD2000</td><td>Microscópio fluorescente</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube, GFP</td><td>ThermoFisher</td><td>AMEP4651</td><td>GFP Cube</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube, RFP</td><td>ThermoFisher</td><td>AMEP4652</td><td>RFP Cube</td></tr><tr><td>GenJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100489</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Caldo</td><td>Gibco</td><td>10855021</td><td>Meio de crescimento</td></tr><tr><td>bacteriano Kit de extração de</td> <td>gel de DNA monarcaNEB</td><td>T1020L</td><td>Kit de purificação de gel usado para purificar amplicons e vetores linearizados</td></tr><tr><td>Kit Miniprep de plasmídeo monarca</td><td>NEB</td><td>T1010L</td><td>Kit Miniprep usado para purificar plasmídeos</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>Espectrofotômetro usado para medir a concentração de RNA e DNA</td></tr><tr><td>NEBuilder Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td>Kit de montagem enzimática isotérmica utilizado para gerar o vetor de recombinação</td></tr><tr><td>Q500 Sonicator Qsonica</td><td></td><td>Q500-110</td><td>Sonicator para lisados de vírus</td></tr><tr><td>Células RK13</td><td>ATCC</td><td>CCL-37</td><td>Células renais de coelho</td></tr><tr><td>VWR Placas de cultura de células multipoços</td><td>VWR</td><td>10062-892 Placas de</td><td>cultura de células</td></tr></tbody></table>

geração rápida e perfeita de vírus de varíola recombinante usando faixa de host e seleção visual

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

O vírus da vaccinia (VACV) foi fundamental na erradicação do vírus variola (VARV), o agente causador da varíola, da natureza. Desde sua primeira utilização como vacina, o VACV tem sido desenvolvido como vetor para vacinas terapêuticas e como um vírus oncolítico. Essas aplicações aproveitam o genoma facilmente manipulado do VACV e a ampla gama de hospedeiros como uma excelente plataforma para gerar vírus recombinantes com uma variedade de aplicações terapêuticas. Vários métodos foram desenvolvidos para gerar VACV recombinante, incluindo métodos de seleção de marcadores e seleção dominante transitória. Aqui, apresentamos um refinamento de um método de seleção de alcance de host, juntamente com a identificação visual de vírus recombinantes. Nosso método aproveita a pressão seletiva gerada pelo hospedeiro da proteína antiviral kinase R (PKR) juntamente com um gene de fusão fluorescente expressando mCherry-tagged E3L, um dos dois antagonistas VACV PKR. O, incluindo o gene de interesse e a fusão mCherry-E3L é ladeado por seqüências derivadas do genoma VACV. Entre o gene de interesse e mCherry-E3L é uma região menor que é idêntica aos primeiros ~150 nucleotídeos do braço de 3', para promover a recombinação homóloga e a perda do gene mCherry-E3L após a seleção. Demonstramos que este método permite uma geração eficiente e perfeita de rVACV em uma variedade de tipos de células sem exigir seleção de medicamentos ou triagem extensiva para vírus mutantes.

Utilizou-se o procedimento diagramado na Figura 1 para gerar um VACV sem antagonistas PKR E3L e K3L, substituindo E3L por EGFP em um vírus já excluído para K3L (vP872). A Figura 2 apresenta placas fluorescentes vermelhas em células RK13 competentes do PKR indicativas de expressão viral de mCherry-E3L, bem como EGFP expressas em células RK13+E3L+K3L confirmando a perda de E3L e o colapso do marcador de seleção mCherry-E3L. A Figura 3...

Este é um método para gerar vírus de vaccinia recombinante "sem scarless" usando seleção de alcance de host e identificação visual de vírus recombinantes.

Geração rápida e perfeita de vírus de varíola recombinante usando faixa de host e seleção visual

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Nosso método usa seleção de intervalo de hospedeiro e marcadores fluorescentes para a geração eficiente e perfeita do vírus da vacina recombinante em uma variedade de tipos de células. Esta técnica combina a velocidade da recombinação homóloga com a natureza sem cicatrizes da seleção dominante transitória. Além disso, hospedamos a seleção de intervalo para eliminar a possibilidade de alterações quimicamente induzidas.Este método também pode ser usado para modificar o vírus da vaccinia ou outros vírus da varíola para expressar genes estrangeiros, por exemplo, para gerar vacinas. Se você está executando este protocolo apenas com seleção de fluorescência, você deve garantir que você está rastreando vírus suficientes para detectar um recombinante relativamente raro sem pressão seletiva PKR. Este método se baseia no ganho e perda de marcadores fluorescentes para selecionar com sucesso vírus que adquiriram as fitas de recombinação e para detectar vírus que têm recombinado sem cicatrizes.Para gerar um vetor de recombinação, adicione primeiro 17 microliters de água livre DNase, 1,2 microliters de cada primer, cinco microliters de 5x pcr tampão de reação, DNA de modelo e 0,5 microliters de polimerase de DNA a um tubo PCR por amplicon. Adicione água livre de DNase adicional para trazer o volume final em cada tubo para 50 microliters. E coloque os tubos em um termociclador.Derreta o DNA a 98 graus Celsius por 30 segundos antes de usar 25 cartuchos de um protocolo PCR de três etapas, conforme indicado. Para visualizar os produtos de amplificação em um gel de 1% de agarose, adicione 10 microlitros de cada produto de DNA e 2 microlitros de tampão de carga para cada poço. Execute o gel por uma hora a oito volts por centímetro.No final da corrida, use um kit de extração de gel de DNA de acordo com o protocolo do fabricante para purificar cada amplicon. Elute os amputados da coluna com 50 microliters de dNase água livre e centrifugação imediata. Para linearizar um vetor de clonagem, primeiro adicione um micrograma do vetor, 17 microliters de água livre de DNase, 2 microliters de tampão de reação e 1 microliter de EcoRI a um tubo para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius.Ao final da incubação, adicione 0,2 picomoles do vetor linearizado 10 microliters de água livre DNase, e 10 microliters de montagem de DNA misturam-se a cada amplicon isolado. Incubar amostras a 50 graus Celsius por uma hora. Ao final da incubação, transforme e.coli quimicamente competente com dois microliters do produto montado de acordo com os protocolos padrão.Placa 100 microliters de células transformadas em placas de agarose LB suplementadas com 100 microgramas por mililitro de ampicillina. Após a incubação durante a noite a 37 graus Celsius, selecione colônias bem isoladas para inoculação no caldo luria complementada com 100 microgramas por mililitro de ampicilina durante a noite a 37 graus Celsius e 225 revoluções por minuto. Na manhã seguinte, use um kit de miniprep plasmídeo para isolar os plasmídeos.E verifique a concentração e pureza do DNA em um espectotômetro. Para a geração de vírus recombinantes, infecte uma monocamada confluente de células adequadas com o vírus a ser recombinado em uma multiplicidade de infecção de um em uma placa de seis poços. E incubar as células infectadas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora.No final da incubação, substitua o supernaente em cada poço por DMEM fresco e use um reagente de transfecção comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante. Adicione três microgramas do vetor de recombinação de interesse a cada poço. Coloque a placa na incubadora por mais 48 horas.Antes de agrupar as células de cada condição de transfecção em tubos individuais de 1,5 mililitros. Em seguida, congele as células agrupadas três vezes antes de sonicar os lises resultantes por 15 segundos a uma amplitude de 50%. Em seguida, diluir em série 10 vezes o liseto sônico, colhido de um 10 para o primeiro ao 10 para o sexto concentração em DMEM fresco e adicionar um mililitro de cada diluição a poços confluentes individuais de uma linha celular competente proteína quinase R.Coloque as células na incubadora de cultura celular por uma hora antes de substituir os supernantes por meio fresco e devolver as células à incubadora de cultura celular. Após 24 a 48 horas, identifique os vírus recombinantes por microscopia de fluorescência. Placas de vírus recombinantes expressam fluorescência vermelha devido à integração do gene de fusão mCherry-E3L.A placa purifica os vírus recombinantes três vezes em células RK13 tipo selvagem. Após três rodadas de purificação da placa, infecte células RK13+E3L+K3L com diluições seriais do lysate da placa. Para identificar os vírus colapsados, por microscopia de fluorescência utilizando um sistema de imagem adequado equipado com cubos de filtro GFP e RFP.Em seguida, a placa purificar placas VC-R4 apenas verde ou incolor três vezes nas células RK13+E3L+K3L. Garantindo que não haja placas fluoresce vermelhas. Infecte as células com pelo menos 100 unidades formadoras de placas para aumentar suas chances de identificar uma placa incolor.Em casos raros, podem ser necessárias várias rodadas de infecção. Placas fluorescentes vermelhas em proteínas quinase R células RK13 competentes são indicativas de expressão viral de mCherry-E3L. E placas ou placas incolores expressando apenas eGFP em células RK13+E3L+K3L confirmam o colapso do marcador de seleção mCherry-E3L.O vírus recombinante VC-R4, que não possui ambos os antagonistas da proteína quinase R não podem se replicar em proteínas quinase R células RK13 competentes enquanto o vírus aparente VP872, que expressa E3L é competente para a replicação. Para confirmar que essa incapacidade de se replicar em células RK13 foi apenas devido à perda de E3L, o GFP aprimorado foi substituído por E3L no vírus VC-R4. Gerou um vírus relevante usando o mesmo protocolo de seleção.Curiosamente, ao fazer esse vírus, placas incolores consistentes com o colapso do marcador de seleção mCherry-E3L foram identificadas antes da seleção em células RK13+E3L+K3L que são geralmente necessárias para selecionar recombinantes sem cicatrizes. Provavelmente devido à sequência estendida entre o de recombinação mCherry-E3L e o gene E3L sendo inserido no VC-R4. Em média, 12,6% dos virions progêneres foram submetidos à recombinação com o plasmídeo transfectado, semelhante às frequências relatadas anteriormente.Aqui, mostra-se a frequência de placas incolores em relação às placas totais RK13+E3L+K3L, demonstrando que a taxa de colapso e a perda do marcador de seleção mCherry-E3L ocorreram em aproximadamente 1,8%. No primeiro estágio, o uso de células competentes PKR garante que todas as placas com vírus recombinante contido. No segundo estágio, o uso de células deficientes PKR permite a detecção de vírus recombinantes com um lócus de colapso mCherry-E3L.Essa abordagem nos permite gerar rapidamente vírus contendo genes exógenos, por exemplo, para a produção de vacinas oferecer a expressão de diferentes antagonistas virais do PKR. para facilitar a análise de interações específicas de espécies com PKR de vários hospedeiros.

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Research

JoVE Journal

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