Metodologia para a Geração Eficiente de Proteínas do Vírus da Vaccinia marcadas fluorescentes

Este experimento gera vírus EO recombinantes marcados com fluorescência por meio de um método modular e rápido baseado na seleção dominante transitória. Primeiro, crie um vetor recombinante contendo uma etiqueta fluorescente cercada por regiões mínimas sintetizadas de homologia, bem como marcadores para seleção metabólica e fluorescente. Transfecte esse vetor de recombinação em células infectadas e amplie para vírus recombinantes usando seleção metabólica e fluorescência.

Em seguida, remova a seleção metabólica para extirpar o do marcador e isolar as células contendo vírus recombinantes por marcador fluorescente. Escolha. Os resultados das placas virais nas monocamadas celulares permitem a visualização de partículas virais individuais que são características do gene marcado com fluorescência. Desenvolvemos esse método porque queríamos gerar vírus recombinantes com múltiplas modificações genéticas usando um método de seleção que pudesse ser usado repetidamente e universalmente, independentemente da marca.

Embora o princípio da seleção dominante transitória tenha sido descrito anteriormente, queríamos aplicá-lo em uma escala maior e de maneira modular para nos dar mais flexibilidade na realização de modificações genômicas. Uma demonstração visual desse método é crítica, pois a triagem e o isolamento da placa viral recombinante podem ser complicados. Sua frequência pode ser baixa e, portanto, alguns métodos exclusivos são necessários para a recuperação eficiente do vírus.

Assim rotulado um gene viral de interesse no terminal N ou C da proteína. Assim, identifique 150 regiões de homologia flanqueadoras de pares de bases longas. Em seguida, projete uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo os 150 pares de bases esquerdo e direito

Também flanqueie esta região por um segundo par de locais de restrição que são diferentes do primeiro par para permitir a incorporação no vetor TDS. Uma vez sintetizado, agora verifique se o oligonucleotídeo com os locais de restrição foi projetado para estar no quadro com o local de inserção desejado. Para a síntese de oligonucleotídeos, garantir os locais de restrição incorporados entre os braços esquerdo e direito.

Combine aqueles que flanqueiam o quadro de leitura aberto da etiqueta de fluorescência de sua escolha. Incorpore esses mesmos locais de restrição em ambos os lados da etiqueta de fluorescência por PCR. Clone o fragmento sintetizado no vetor TDS.

Clone também a etiqueta de fluorescência no vetor de recombinação resultante usando os locais de restrição entre o braço esquerdo e direito. Regiões de homologia. Infectar uma monocamada de células BSC one com o vírus vaccinia e meios livres de soro.

Uma hora após a infecção. Resgate as células com ECCOs modificados com transfecto de meio de águia com uma mistura de recombinação, plasmídeo vetorial e reagentes de transfecção em uma proporção de três para um em meio livre de soro. Após 24 horas, raspar e recuperar células em DMEM sem soro fetal bovino.

Submeta as células a três ciclos de descongelamento livre para quebrar as células abertas e liberar as partículas do vírus em seguida para obter a separação adequada de placas individuais. Infectar monocamadas celulares 100% confluentes de células BSC um com diluições seriadas da preparação de partículas virais. Sobreponha com líquido 10% FBS e DMEM mais a seleção GPT, reagentes e incube por 24 horas.

Aspire a camada líquida e use um microscópio fluorescente para procurar placas. Exibindo fluorescência vermelha difusa correspondente à incorporação de M cereja do vetor TDS no vírus. Dependendo do gene alvo e da marca de fluorescência escolhida, a fluorescência localizada do gene da marca também pode ser observada na mesma placa vermelha.

Agora, para pegar várias placas para cada vírus recombinante, raspe com a ponta da pipeta e com 100 microlitros de 5% de FBS contendo DMEM transferiu as células para um tubo einor. Execute três rodadas de congelamento e descongelamento das células raspadas. Para liberar os vírus recombinantes.

Adicione o DMEM contendo o vírus descongelado por congelamento a uma monocamada de células. Em uma placa de 12 poços para amplificar os vírus recombinantes com reagentes de seleção GPT no meio de crescimento. Em seguida, raspe as amplificações bem-sucedidas 24 horas após a infecção para um ensaio de placa de placas amplificadas com sucesso, exibindo fluorescência vermelha C dois seis, bem reproduzida com uma monocamada de células BSC um.

Realize uma diluição em série dos vírus recombinantes e infecte os poços com uma diluição crescente de vírus em DME livre de FBS M1 hora após a infecção. Remova o meio líquido e cubra cada poço com 0,5% de agros em meio essencial mínimo completo três dias após a infecção. Escolha as placas que exibem fluorescência vermelha e a cor da etiqueta de fluorescência escolhida.

Amplifique-os novamente sem seleção GPT. Escolha placas que perderam sua fluorescência vermelha difusa, mas mantêm a fluorescência localizada correspondente à etiqueta de escolha. Continue a purificação da placa sem seleção para obter um estoque puro de vírus recombinantes que perderam os genes de seleção M cherry e GPT, mas mantêm a fluorescência localizada correspondente à etiqueta escolhida.

Avalie a pureza dos estoques com um ensaio de placa visando todas as placas de um fenótipo de placa semelhante. Amplificar os estoques virais de teste em uma monocamada de células BSC um. Após 24 horas após a infecção, raspe as células infectadas em 250 microlitros de DMEM centrifugue as células infectadas.

Remova o supernat e ressuspenda o pellet celular em 500 microlitros de 0,1% SDS no vórtice tampão TE para lyce as células. Em seguida, adicione 500 microlitros de fenol, clorofórmio, álcool isoamílico e inverta para misturar a centrífuga. Colha a fase superior e repita a extração.

Em seguida, para precipitar o DNA da camada aquosa, adicione um mililitro de etanol 100% resfriado e 50 microlitros de acetato de sódio. Misture por inversão e coloque a amostra a 20 graus Celsius negativos durante a noite. Depois de peletizar o DNA por centrifugação, remova todo o líquido e seque ao ar o pellet de DNA e resus.

Suspenda-o em 50 microlitros de tampão TE. Use este modelo de DNA genômico para triagem de PCR para inserção viral. Gere vírus recombinantes com várias tags, conforme detalhado no protocolo de texto.

Esses vírus vaccinia recombinantes expressam proteínas marcadas com marcadores fluorescentes direcionados a proteínas estruturais virais, A três e F 13, que fazem parte do núcleo interno do vírus e do envelope externo, respectivamente. Genes correspondentes a proteínas localizadas de vírion foram selecionados para visualizar partículas virais. A três é uma proteína central do vírion vaccinia e F 13 é uma proteína do envelope viral.

Um vírus duplamente marcado com A três e F 13 marcados com fluorescência também é mostrado que a microscopia de fluorescência em tempo real pode ser realizada com um vírus duplamente marcado. Neste caso, a proteína do núcleo interno do vírus vaccinia. Um três é rotulado em vermelho e a proteína F 13 do envelope externo é rotulada em verde.

As partículas de vírus desembrulhadas da fábrica de vírus são visualizadas em vermelho e o vírion embrulhado é representado pela colocalização dos canais vermelho e verde. A análise quantitativa foi usada para determinar as eficiências de recombinação entre vetores recombinantes e o genoma do vírus vaccinia. A eficiência da recombinação homóloga de vetores com o genoma do vírus vaccinia pode ser detectada com apenas 70 regiões de homologia de pares de bases.

Este método tem sido usado para criar vírus com várias marcas fluorescentes e/ou múltiplas deleções de genes. Estes têm sido empregados no estudo do ciclo de vida infeccioso do vírus, o papel das proteínas virais na subversão dos sistemas de defesa do hospedeiro, bem como as interações com os processos de sinalização do hospedeiro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar vírus vaccinia recombinantes usando um método modular nas tags usadas, meticuloso na resolução de recombinantes desejados e aplicável em uma variedade de contextos de pesquisa.