Name: Metodologia para a Geração Eficiente de Proteínas do Vírus da Vaccinia marcadas fluorescentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprenda a gerar proteínas do vírus da vaccinia marcadas com fluorescência usando seleção dominante transiente. Este protocolo modular simplifica modificações genéticas e melhora a triagem de placas virais em pesquisas de virologia.

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Este trabalho foi financiado pela concessão do Projeto Discovery do Conselho de Pesquisa Australiano #1096623.

1. Criando o Vetor de Recombinação
<ol><li>Identificar regiões de ladeamento de 150 bp de longa mente (conhecidas como braços esquerdos e de direita) necessárias para rotular o gene de interesse viral (Ver Figura 1b).</li>
	<li>Projete uma sequência de oligonucleotídeos que compõe os braços esquerdo e direito de 150 bp separados por um par de locais de restrição de escolha. Toda essa sequência também deve ser flanqueada por um segundo par de sites de restrição (diferentes do primeiro par) para permitir a incorporação no vetor TDS uma vez sintetizado. Tome cuidado ao projetar o oligonucleotídeo com locais de restrição que as sequências estão em quadro com o local de inserção desejado.</li>
	<li>Incorpore os locais de restrição entre os braços esquerdo e direito ao projetar o oligonucleotídeo para síntese, que deve coincidir com aqueles que flanqueiam o quadro de leitura aberto da tag fluorescente de escolha (ver Figura 1b). É possível usar um local de restrição NotI como um linker de três aminoácidos entre o braço esquerdo e o início da tag fluorescente.</li>
	<li>Incorpore esses mesmos locais de restrição em ambos os lados da tag fluorescente por PCR (ver Figura 1c).</li>
	<li>Clone o fragmento sintetizado no vetor TDS.</li>
	<li>Clone a tag fluorescente no vetor de recombinação resultante usando os locais de restrição entre as regiões do braço esquerdo e direito da homologia (ver Figura 1d).</li>
</ol>2. Geração de vírus recombinantes
<ol><li>De acordo com a Figura 2,infecte uma monocamada de células BS-C-1 com vírus de vaccinia em mídia livre de soro em uma Multiplicidade de Infecção (MOI) > 1.</li>
	<li>1 hora pós-infecção, células de resgate com O Meio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco e transfecção com uma mistura de plasmídeo vetorial de recombinação e reagente transfecção em uma proporção de 3:1 em mídia livre de soro.</li>
	<li>Após 24 horas, raspe e recupere células no DMEM sem soro bovino fetal (FBS) e realize três ciclos de congelamento para quebrar células abertas e liberar partículas de vírus.</li>
	<li>Realize um ensaio de placa com uma sobreposição líquida de 10% FBS DMEM e reagentes de seleção GPT ácido micfenólico (25 μg/ml) e xanthine (250 μg/ml) da seguinte forma:<ol>
<li>Semente uma placa de 6 poços com uma monocamada de células BS-C-1.</li>
		<li>Infecte moncamas celulares 100% confluentes com diluições seriais das células congelantes contendo partículas de vírus para garantir a separação adequada de placas individuais.</li>
		<li>Sobreposição com FBS líquido 10% contendo DMEM contendo os reagentes de seleção GPT - ácido mycofenólico e xanthine nas concentrações finais de 25 μg/ml e 250 μg/ml, respectivamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Após uma incubação de 24 horas, remova a sobreposição líquida e use um microscópio fluorescente para procurar placas que expuseram fluorescência vermelha difusa correspondente à incorporação de mCherry do vetor TDS no vírus. Dependendo do gene alvo e da tag fluorescente escolhida, a fluorescência localizada do gene marcado também pode ser observada na mesma placa vermelha.</li>
	<li>Escolha várias placas para cada vírus recombinante por raspagem localizada com uma ponta de pipeta e 100 μl de 5% de FBS contendo DMEM para transferir células para um tubo Eppendorf, seguido por três rodadas de congelamento de células raspadas para liberar vírus recombinantes.</li>
	<li>Adicione o DMEM contendo vírus descongelado por congelamento a uma monocamada de células em uma placa de 12 poços para amplificar vírus recombinantes com reagentes de seleção de GPT na mídia de crescimento. Raspe amplificações bem sucedidas 24 horas após a infecção.</li>
	<li>Realize um ensaio de placas com sucesso amplificadas exibindo fluorescência vermelha, desta vez com uma sobreposição de ágarose e seleção gpt, da seguinte forma:<ol>
<li>Semente uma placa de 6 poços com uma monocamada de células BS-C-1.</li>
		<li>Realize uma diluição serial dos vírus recombinantes e infecte poços com uma diluição crescente de vírus no DMEM livre de FBS.</li>
		<li>1 hora pós-infecção, remova a mídia líquida e sobreponha cada poço com 0,5% de agarose em meio essencial mínimo (MEM) contendo 2,5% FBS, 292 μg/ml L-glutamina, 100 penicilina U/ml e 100 μg/ml estreptomicina, juntamente com os reagentes de seleção GPT.</li>
	</ol></li>
	<li>2-3 dias após a infecção, escolha placas exibindo fluorescência que é tanto vermelha quanto a cor da tag fluorescente escolhida para amplificar novamente, desta vez sem seleção gpt.</li>
	<li>Realize o próximo ensaio da placa com uma sobreposição de agarose sem seleção.</li>
	<li>Escolha placas que perderam sua fluorescência vermelha difusa, mas mantenham a fluorescência localizada correspondente à tag de escolha.</li>
	<li>Continue a purificar a placa sem seleção para obter um estoque puro de vírus recombinantes que perderam os genes de seleção mCherry e gpt, mas mantêm a fluorescência localizada correspondente à tag escolhida. Os estoques de verificação são puros por ensaio de placa, todas as placas devem ter um fenótipo de placa semelhante.</li>
	<li>Use a triagem PCR de DNA genômico para garantir que os estoques virais sejam puros.<ol>
<li>Projete primers que flanqueiam o local de inserção de genes fluorescentes e primers que amplificam o próprio gene fluorescente inserido. Diferentes combinações desses primers produzirão amplicons PCR que detectarão a inserção genética e indicarão pureza.</li>
		<li>Amplie as ações virais para serem rastreadas em um poço de uma monocamada de placa de 12 poços de células BS-C-1.</li>
		<li>24 horas após a infecção, raspe as células infectadas em 250 μl de DMEM.</li>
		<li>Centrífugas infectadas (18.000 x g por 10 min, 4 °C), removem pelotas de células supernascidas e resusgaspendas em 500 μl TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA, pH 8) com 0,1% (v/v) SDS. Vórtice para células de lise.</li>
		<li>Adicione 500 μl de fenol-clorofórmio-isoamil acohol, inverter para misturar. Centrífuga (18.000 x g para 4 min, 4 °C). Pegue o supernatante e repita.</li>
		<li>Realize uma precipitação de etanol no supernasal adicionando 1 ml 100% etanol (refrigerado) e acetato de sódio de 50 μl, inverter para misturar.</li>
		<li>Deixe a -20 °C durante a noite ou -80 °C por 1 hora. Centrífuga (18.000 x g por 30 min, 4 °C), remova todo o líquido e permita que o DNA precipitado seque. Resuspend em 50 μl TE.</li>
		<li>Use isso como um modelo para a triagem genômica de DNA PCR.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Geração de vírus recombinantes carregando mais de uma tag
<ol><li>Coinfecte a mesma monocamada celular com vírus recombinantes fluorescentes para criar vírus duplos ou triplos ou repetir o procedimento do Protocolo 1) com uma tag diferente.</li>
	<li>Purificar vírus com base no fenótipo de placa ou na triagem pcr do DNA genômico do vírus isolado.</li>
</ol>

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</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

Esta técnica descreve um protocolo eficiente e modular para a criação de vírus recombinantes que expressam proteínas virais marcadas fluorescentemente. O método garante que a única mudança no genoma viral é a adição de uma tag ou marcador, deixando para trás nenhum marcador de seleção. O curto comprimento do braço necessário para a recombinação homólogoa permite sua síntese direta, eliminando várias rodadas demoradas de PCR e clonagem, enquanto a fluorescência de mCherry e seleção de GPT metabólico são usadas para isolar intermediários de recombinação viral. Esses intermediários podem ser resolvidos, após a remoção da seleção, para um vírus com um gene marcado ou de volta ao tipo parental. Método semelhante envolvendo o uso de seleção fluorescente e metabólica foi descrito anteriormente27, embora o método utilizado neste estudo utilize regiões mais curtas e sintetizadas da homologia, permitindo a identificação do vírus recombinante desejado por meio da imagem da fluorescência do gene de interesse marcado. Esta seleção secundária só é aplicável para marcar genes virais altamente expressos que produzem fluorescência suficiente em um ensaio de placa. Alternativamente, pode-se imaginar a inserção de um de expressão completa, por exemplo, uma proteína fluorescente sob um forte promotor viral. Neste caso, os braços esquerdo e direito definiriam o ponto de inserção em vez do gene viral a ser marcado.
Existem algumas etapas-chave que se mostraram úteis durante o procedimento experimental. A sobreposição líquida na etapa 2.3.3 descrita acima mostrou-se crucial para a detecção e isolamento de placas fluorescentes vermelhas/verdes. Acreditamos que a combinação dos reagentes de seleção de GPT e a sobreposição de agarose dissuadiu o crescimento de vírus recombinantes e, portanto, mudou para uma sobreposição líquida para o primeiro passo de amplificação de vírus após a transfecção. Também é importante escolher placas fluorescentes mostrando fluorescência de cores localizadas para enriquecimento e purificação, pois intermediários resultantes da recombinação do braço esquerdo podem resultar em fluorescência difusa observada em placas se o braço esquerdo também contiver uma sequência de promotores. O gene marcador mCherry no vetor TDS também pode ser substituído por gfp, por exemplo, para permitir a fácil incorporação e seleção de mCherry como uma tag fluorescente.
Algumas técnicas descritas acima variam ligeiramente de métodos estabelecidos de criação do vírus da vaccinia recombinante. Por exemplo, o MOI do vírus usado para criar recombinantes é normalmente inferior a128, no entanto, o uso de MOIs mais elevados tem sido suficiente para a criação de vírus recombinantes de vaccinia por este método. O uso de reagentes de seleção de GPT normalmente requer a pré-insubtação das células com reagentes de seleção18,porém adicioná-los durante a fase de resgate pós-infecção ainda forneceu seleção suficiente de recombinantes desejados, particularmente devido à presença de um marcador de seleção fluorescente também.
Como mencionado anteriormente, uma das limitações dessa técnica é que a etapa de seleção de fluorescência secundária depende da proteína marcada de interesse ser altamente expressa, em um nível que permite sua detecção de olho em um ensaio de placa. Sem isso, seria possível purificar vírus que apenas exibiam fluorescência mCherry, dos quais pelo menos 50% conteriam os vírus recombinantes desejados, que poderiam ser identificados por estratégias moleculares como a PCR descrita na etapa 2.12 acima. Outra limitação pode ser a inativação de certas proteínas como resultado de sua marcação. A tag fluorescente pode sofrer mutações ou ser excisada pelo vírus recombinante com a passagem ao longo do tempo. Portanto, recomenda-se a amostragem regular de estoques de vírus recombinantes por microscopia e PCR. Finalmente, pode haver um limite para o número de proteínas fluorescentes marcadas que podem ser incorporadas em um único vírus. Um aspecto disso é a capacidade de visualizá-los simultaneamente; dada a natureza sobreposta dos espectros de emissões das etiquetas fluorescentes disponíveis, é importante selecioná-las cuidadosamente para garantir o sangramento espectral mínimo. Além disso, o uso de tags intimamente relacionadas, como GFP e Cerulean, abre a possibilidade de recombinação entre os dois, dependendo de suas localizações no genoma recombinante.
A natureza modular desta técnica permite a simples substituição de tags fluorescentes com base na compatibilidade com outras opções de coloração e/ou tag. Ao extirer marcadores selecionáveis, o método TDS permite a adição serial de várias proteínas fluorescentes ou a combinação de marcação baseada em TDS com exclusões genéticas baseadas em TDS para análises fenotípicas29. Como exemplo para a utilidade dessa abordagem, foi gerado um vírus fluorescente de marca dupla que rotula núcleos de vírus e a membrana WV. Estudos de imagem com esse vírus podem ser usados para estudar movimento, morfogênese e embrulho de vírus durante a replicação do vírus. Ainda não caracterizadas, as proteínas virais de vacina também podem ser marcadas e estudadas por essa técnica.
O vírus da vaccinia tem sido amplamente utilizado em estudos de imagem devido a muitas características do vírus que são favoráveis à microscopia de células vivas. As etiquetas fluorescentes são expressas a partir do genoma viral, eliminando a necessidade de transfecção, permitindo que células primárias derivadas de animais infectados ou células não transmissíveis sejam facilmente analisadas. Inicialmente, foram utilizados VACVs fluorescentes para rastreamento subcelular simples do movimento do vírus30, mas abordagens mais recentes expandiram sua utilidade para incluir estudos FRET31, FRAP em partículas de vírus únicos32,repórterespromotores 33,imagens intravitais34e estudos estruturais35-37. Todas essas técnicas poderiam estar cada vez mais próximas, juntamente com este método de criação de vírus fluorescentes recombinantes.

O vírus da vaccinia (VACV) é o varívido prototípico e altamente relacionado ao vírus variola, o agente causador da varíola. Ambos os vírus são membros do gênero ortopéxi que inclui outros patógenos notáveis, como o macacopox e o vírus ectromélia (mousepox)1. Ortooxivírus têm grandes genomas de DNA de dupla vertente (180-220 kb) que codificam acima de 200 quadros de leitura aberto previstos2,3. A replicação desses vírus envolve a formação de uma fábrica de vírus perinucleares, onde são feitos vírus maduros (MV), e a rede trans-Golgi, onde um subconjunto de MV adquire duas membranas adicionais para gerar vírus embrulhados (WV) (revisados por Roberts e Smith4). Os genomas ortoxixos são altamente favoráveis à manipulação genética devido ao alto grau de recombinação genética que é uma característica da replicação do genoma VACV e é mediado pela polimerase de DNA viral5. A geração de vírus recombinantes baseia-se na recombinação homóloga e moléculas de DNA lineares com homólogos de até 12 bps sendo suficientes para mediar a recombinação em células infectadas pelo vírus da vaccinia6. A rotulagem fluorescente do vírus da vaccinia pode produzir partículas de vírus extremamente brilhantes devido ao grande tamanho das partículas de ortopócio, o que permite a incorporação de muitas proteínas fluorescentes por virion7. A vaccinia tem a capacidade de transportar grandes fragmentos de DNA estrangeiro8 e, além disso, a falta de simetria rígida de capsídeos pode permitir um grau de flexibilidade ao expressar fusões genéticas de proteínas virais de seu loci endógeno9. A marcação fluorescente das proteínas VACV tem se mostrado inestimável para o estudo das interações hospedeiro-patógeno no nível subcelular, particularmente no campo da entrada do vírus10, transporte11-13, e morfogênese, particularmente de virions embrulhados7.
Os vírus recombinantes podem ser selecionados pelo resgate de um fenótipo de crescimento atenuado14,15, seleção metabólica16-18, ou pela expressão de um gene marcador (por exemplo, X-gal19 ou proteína fluorescente13,20). Aqui descrevemos a seleção de vírus fluorescentes usando uma poderosa combinação de seleção fluorescente e metabólica. Os vetores de seleção dominante transitória (TDS), desenvolvidos por Faulkner e Moss (1990)21,permitem que os marcadores sejam integrados juntamente com o gene de interesse fluorescente desejado. Quando a seleção metabólica é removida, pode ocorrer um evento secundário de recombinação que excise os genes de seleção, mas deixa a proteína do vírus fluorescente intacta. A Figura 2 abaixo fornece uma visão geral do procedimento experimental. Os genes de seleção utilizados neste estudo são o gene mCherry e o gene Escherichia coli guanine phosphoribosyltransferase(gpt),ambos expressos de um promotor viral sintético precoce/tardio e utilizado anteriormente por Cordeiro et al. 22 Além disso, há fluorescência da proteína de fusão marcada de interesse. Quando a seleção metabólica é removida, os marcadores selecionáveis(mCherry e gpt) são extirpados, restando apenas a fluorescência do gene marcado, que permite a identificação dos vírus recombinantes corretos. A excisão dos marcadores de seleção oferece a possibilidade de combinar múltiplas tags fluorescentes, permitindo-nos criar vírus com a capacidade de rotular fluorescentemente várias proteínas virais simultaneamente. Estudos anteriores determinaram os requisitos mínimos de homologia para a recombinação da vaccinia de moléculas de DNA lineares e circulares transfectadas em células infectadas pelo vírus da vaccinia6. Queríamos determinar a eficiência de recombinação de diferentes comprimentos de ritologia de braços flanqueados no vetor GPT-mCherry TDS através de sua incorporação ao genoma viral da vaccinia. Foi determinado que regiões homólogas de 100 bp no vetor TDS são suficientes para atingir e mediar a inserção de DNA recombinante no genoma vacv por recombinação hologous(Figura 4). Enquanto comprimentos de emologia menores também permitiriam a recombinação, os comprimentos de 100 bp de homologia forneceram vírus recombinantes suficientes que poderiam ser facilmente identificados com a seleção metabólica e fluorescente. Fragmentos de DNA deste tamanho podem ser sintetizados comercialmente a um custo relativamente baixo e facilita muito a produção de múltiplos vetores para a criação de vírus recombinantes. Optamos por aumentar o comprimento da homologia para 150 bp para proporcionar maior frequência de recombinação, mantendo os custos de síntese da sequência de oligonucleotídeos de regiões de flanqueamento.

<table><tbody><tr><td>Ácido micofenólico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3536-50MG</td><td>Dissolver em 0.1 N NaOH</td></tr><tr><td>Xantina</td><td></td><td>X0626-5G</td><td>Dissolver em 0.1 N NaoH</td></tr><tr><td>FuGENE HD reagente de transfecção</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência equipado com filtros Chroma 31001, 31002</td><td>Olympus, Chroma</td><td>BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

metodologia para a geração eficiente de proteínas do vírus da vaccinia marcadas fluorescentes

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

A marcação de proteínas virais com proteínas fluorescentes provou ser uma abordagem indispensável para promover nossa compreensão das interações vírus-hospedeiros. O vírus da vaccinia (VACV), a vacina viva usada na erradicação da varíola, é particularmente favorável à microscopia de células vivas fluorescentes devido ao seu grande tamanho de virion e à facilidade com que pode ser projetada no nível do genoma. Informamos aqui um protocolo otimizado para a geração de vírus recombinantes. Foram determinados os requisitos mínimos para recombinação homóloga direcionada durante a replicação da vaccinia, o que permite a simplificação da geração de construções. Isso permitiu que a aliança de seleção dominante transitória (TDS) com um repórter fluorescente e seleção metabólica fornecesse uma abordagem rápida e modular para rotular fluorescentemente proteínas virais. Ao simplificar a geração de vírus recombinantes fluorescentes, somos capazes de facilitar aplicações a jusante, como análise avançada de imagem de muitos aspectos da interação entre vírus-host que ocorre durante a replicação do vírus.

A Figura 1 lista os vários construtos necessários para este procedimento, que são sintetizados(Figuras 1b e 1c) ou criados por etapas de clonagem(Figura 1d). A Figura 2 fornece um esboço do procedimento experimental com imagens representativas de placa fluorescente de um VACV recombinante A3-GFP retratado para cada etapa do processo seletivo. Na Figura 3,vírus recombinantes da vaccinia expressando proteínas marcadas com marcadores fluorescentes direcionados às proteínas estruturais virais A3 e F13, que fazem parte do núcleo do vírus interno23 e envelope externo24, respectivamente,são mostrados. Observações de placas virais e células infectadas para cada um dos vírus recombinantes criados são retratadas. A eficiência da recombinação homóloga de vetores com o genoma VACV, contendo até 70 bp regiões de homologia, foi testada e os resultados são retratados na Figura 4. O relativo sucesso da identificação de placas virais feitas a partir da recombinação com vetores contendo 100 bp de homologia foi o raciocínio por trás da escolha de sintetizar 150 bp de comprimento braços esquerdo e direito da homologia ao gene alvo.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> Figura 1. Vetor de recombinação transitória (TDS). (a) Vetor TDS com marcadores de seleção gpt e mCherry. (b) Os braços esquerdo e direito da homologia são projetados com locais de restrição específicos entre e flanqueando os braços da homologia. Os locais de restrição entre os braços esquerdo e direito utilizados neste método foram NotI e BamHI, o site NotI também sendo usado como um linker entre o gene e a tag fluorescente. (c) As tags fluorescentes compatíveis com este método são flanqueadas por locais de restrição correspondentes. Algumas tags empregadas são GFP (proteína fluorescente verde), RFP (proteína fluorescente vermelha), Cerulean (uma melhoria no ECFP, uma proteína fluorescente ciano, por mutagênese25) e mini-SOG, uma proteína fluorescente projetada a partir de GFP que cria um produto solucionável pela EM na iluminação26. dEtapas de clonagem envolvidas na geração do vetor final de recombinação TDS. O oligonucleotídeo sintetizado contendo os braços de flanco esquerdo e direito é primeiro clonado no vetor TDS. Isso fornece um vetor de recombinação no qual qualquer tag de escolha pode ser transportada para dentro e para fora, clonando nos locais de restrição incorporados entre os braços esquerdo e direito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> Figura 2. Esboço do procedimento experimental para criar um vírus de vaccinia recombinante. Eventos ocorridos nos níveis genético e celular são retratados, juntamente com imagens representativas de placas delineando os passos após a criação de um vírus de vaccinia fluorescente rotulado a3-GFP. (A) As células infectadas com o vírus da vaccinia são transfeinadas com o vetor de recombinação TDS. (B) Nesta figura, apenas o resultado da recombinação da mão esquerda é retratado e o exemplo usa GFP como a tag fluorescente de escolha. A recombinação da mão direita resultaria em todo o plasmídeo TDS sendo incorporado ao genoma de forma semelhante, exceto que a tag seria fundida a todo o gene alvo na etapa intermediária, ou seja, passo C. Um ensaio de placa é realizado em uma monocamada celular com a mistura de recombinação e submetido à seleção gpt. (C) Placas que exibem fluorescência vermelha e verde, correspondentes à expressão mCherry e GFP, respectivamente, são colhidas e amplificadas. Uma vez removida a seleção, haverá perda de fluorescência vermelha correspondente à perda dos genes gpt e mCherry (D)e placas que exibem fluorescência exclusivamente verde são colhidas e amplificadas(E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> Figura 3. Resultados representativos do sistema de recombinação TDS. As imagens mostram placas inteiras de VACV recombinante infectando células após 48 horas (a, c, e; barra de escala 100 μm), acompanhadas por uma imagem de uma única célula infectada pelo vírus recombinante correspondente após 8 horas (b, d, f; barra de escala 10 μm). Genes correspondentes a proteínas localizadas em virion foram selecionados para visualizar partículas de vírus. A3 é uma proteína central da vaccinia virion (a, b) e F13 (c, d) é uma proteína envelope viral. Um vírus de marca dupla com ambos fluorescente rotulados A3 e F13 (e, f) também é mostrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> Figura 4. Análise quantitativa das eficiências de recombinação entre vetores recombinantes e o genoma VACV. As monocamadas BS-C-1 foram infectadas com VACV e transfeinadas de 1 hora pós-infecção com três vetores de recombinação contendo regiões de homologia de 500 bp, 100 bp ou 70 bp para o genoma do VACV. Cada vetor também continha o TDS composto por genes de seleção gpt e mCherry. As células foram recuperadas 24 horas após a infecção e liberadas para a liberação dos vírus recombinantes formados. Ensaios de placa foram realizados em lises celulares com mídia de seleção de GPT e placas mostrando fluorescência mCherry foram contados como recombinantes bem sucedidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> Figura 5. Mapa do vetor GPT-mCherry TDS mostrando o local de clonagem múltipla. O vetor foi descrito anteriormente22 e o mapa vetorial foi criado com a ajuda do EZ Plasmid Map v1.9 do Zhang Lab Group (SCU). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.

Um protocolo rápido e modular para a geração de vírus recombinantes de vaccinia expressando proteínas fluorescentes marcadas simultaneamente usando o método de seleção dominante transitória é descrito aqui.

Metodologia para a Geração Eficiente de Proteínas do Vírus da Vaccinia marcadas fluorescentes

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Este experimento gera vírus vaccínia recombinantes marcados com fluorescência por meio de um método modular e rápido baseado na seleção dominante transitória. Primeiro, crie um vetor recombinante contendo uma marca fluorescente cercada por regiões mínimas sintetizadas de homologia, bem como marcadores para seleção metabólica e fluorescente. Transfete este vetor de recombinação em células infectadas e amplifique os vírus recombinantes utilizando seleção metabólica e fluorescência. Em seguida, remova a seleção metabólica para excisar o cassete de marcador e isole as células contendo vírus recombinantes pela seleção com marcador fluorescente. Os resultados de placas virais em monocamadas celulares permitem a visualização de partículas virais individuais que são características do gene marcado com fluorescência.Desenvolvemos este método porque desejávamos gerar vírus recombinantes com múltiplas modificações genéticas utilizando um método de seleção que pudesse ser usado repetidamente e de forma universal, independentemente da marcação. Embora o princípio da seleção dominante transitória já tenha sido descrito anteriormente, queríamos aplicá-lo em maior escala e de maneira modular, a fim de obter mais flexibilidade na realização de modificações genômicas. Uma demonstração visual deste método é essencial, pois o rastreamento e o isolamento de placas virais recombinantes podem ser difíceis. Sua frequência pode ser baixa, e, portanto, são necessários métodos específicos para a recuperação eficiente do vírus.Portanto, marque o gene viral de interesse na extremidade N ou C do proteína. Identifique, conforme apropriado, regiões flanqueadoras de 150 pares de bases com homologia. Em seguida, projete uma sequência de oligonucleotídeo composta pelos braços esquerdo e direito de 150 pares de bases, separados por um par de sítios de restrição de escolha. Flanqueie também esta região por um segundo par de sítios de restrição diferentes do primeiro par, para permitir a incorporação no vetor TDS após a síntese. Verifique agora se o oligonucleotídeo com os sítios de restrição foi projetado para estar no mesmo quadro de leitura do sítio de inserção desejado. Para a síntese do oligonucleotídeo, assegure-se de que os sítios de restrição incorporados entre os braços esquerdo e direito correspondam aos que flanqueiam a região codificante do marcador fluorescente de escolha. Incorpore esses mesmos sítios de restrição em ambos os lados do marcador fluorescente por PCR. Clone o fragmento sintetizado no vetor TDS. Clone também o marcador fluorescente no vetor de recombinação resultante, utilizando os sítios de restrição localizados entre as regiões de homologia dos braços esquerdo e direito. Infete uma monocamada de células BS-C-1 com vírus vaccinia em meio livre de soro.Uma hora após a infecção, recupere as células com meio Eagle modificado de Dulbecco. Transfete com uma mistura do plasmídeo do vetor de recombinação e reagentes de transfeção em uma proporção de três para um em meio sem soro. Após 24 horas, raspe e recupere as células em DMEM contendo nenhum soro bovino fetal. Submeta as células a três ciclos de congelamento e descongelamento para romper as células e liberar as partículas virais. Em seguida, para obter uma separação adequada de placas individuais, infecte monocamadas de células BS-C-1 confluentes a 100% com diluições seriadas da preparação de partículas virais. Cubra com meio líquido contendo 10% de FBS e DMEM acrescido dos reagentes de seleção GPT e incube por 24 horas.Aspire a sobrenadante e utilize um microscópio fluorescente para procurar placas que exibam fluorescência vermelha difusa, correspondente à incorporação de M-cherry do vetor TDS no vírus. Dependendo do gene alvo e da marca fluorescente escolhida, pode-se também observar fluorescência localizada do gene marcador na mesma placa vermelha.Agora, para coletar múltiplas placas para cada vírus recombinante, raspe com a ponteira da pipeta e, com 100 microlitros de DMEM contendo 5% de FBS, transfira as células para um tubo Eppendorf. Realize três ciclos de congelamento e descongelamento das células raspadas, para liberar os vírus recombinantes.Adicione o DMEM contendo o vírus submetido a ciclos de congelamento-descongelamento a uma monocamada de células, em uma placa de 12 poços, para amplificar os vírus recombinantes com reagentes de seleção GPT no meio de crescimento. Em seguida, raspe as amplificações bem-sucedidas após 24 horas da infecção. Para um ensaio de placa de placas amplificadas com sucesso, que exibem fluorescência vermelha, semeie uma placa de seis poços com uma monocamada de células BS-C-1.Realize uma diluição seriada dos vírus recombinantes e infecte as cavidades com uma diluição crescente de vírus em DMEM sem FBS. Uma hora após a infecção, remova o meio líquido e cubra cada cavidade com ágarose a 0,5% em meio mínimo essencial completo. Três dias após a infecção, selecione as placas que exibem fluorescência vermelha e a cor da marcação fluorescente escolhida.Amplifique-os novamente sem seleção por GPT. Escolha placas que tenham perdido a fluorescência vermelha difusa, mas que mantenham a fluorescência localizada correspondente à marcação de escolha. Continue a purificação por placas sem seleção para obter um estoque puro de vírus recombinantes que tenham perdido os genes de seleção M-cherry e GPT, mas que mantenham a fluorescência localizada correspondente à marcação escolhida.Avalie a pureza dos estoques com um ensaio de placa, visando obter todas as placas com fenótipo de placa semelhante. Amplifique os estoques virais de teste em uma monocamada de células BS-C-1. Após 24 horas pós-infecção, raspe as células infectadas para dentro de 250 microlitros de DMEM. Centrifugue as células infectadas, remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em 500 microlitros de SDS 0,1% em tampão TE. Agite em vórtex para lisar as células. Em seguida, adicione 500 microlitros de fenol, clorofórmio, álcool isoamílico e inverta para misturar. Centrifugue. Recolha a fase superior e repita a extração.Em seguida, para precipitar o DNA da camada aquosa, adicione um mililitro de etanol gelado a 100% e 50 microlitros de acetato de sódio. Misture por inversão e coloque a amostra a 20 graus Celsius negativos durante a noite. Após a centrifugação para formar o pellet de DNA, remova todo o líquido, seque o pellet de DNA ao ar e reconstitua-o em 50 microlitros de tampão TE. Utilize este molde de DNA genômico para triagem por PCR de inserção viral. Gere vírus recombinantes com múltiplas marcas conforme detalhado no protocolo textual.Esses vírus vaccínia recombinantes expressam proteínas marcadas com indicadores fluorescentes direcionados a proteínas estruturais virais, A3 e F13, que fazem parte, respectivamente, do núcleo interno e do envelope externo do vírus. Genes correspondentes a proteínas localizadas no virion foram selecionados para visualizar partículas virais. A3 é uma proteína do núcleo do virion vaccínia, e F13 é uma proteína do envelope viral.Um vírus duplamente marcado, com A3 e F13 fluorescentemente rotulados, também é mostrado. Pode-se realizar microscopia de fluorescência em tempo real com um vírus duplamente marcado. Nesse caso, a proteína do núcleo interno do vírus vaccinia, A3, é marcada em vermelho e a proteína do envelope externo F13 é marcada em verde.Partículas virais desenvelopadas provenientes da fábrica viral são visualizadas em vermelho e os viriões envelopados são representados pela colocalização dos canais vermelho e verde. A análise quantitativa foi utilizada para determinar as eficiências de recombinação entre vetores recombinantes e o genoma do vírus vaccínia. A eficiência de recombinação homóloga de vetores com o genoma do vírus vaccínia pode ser detectada com regiões de homologia tão pequenas quanto 70 pares de bases.Este método tem sido usado para criar vírus com múltiplas marcas fluorescentes e/ou múltiplas deleções gênicas. Esses vírus têm sido empregados no estudo do ciclo infeccioso do vírus, do papel das proteínas virais na subversão dos sistemas de defesa do hospedeiro, bem como das interações com os processos de sinalização do hospedeiro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar vírus vaccínia recombinantes utilizando um método que é modular nas marcas utilizadas, meticuloso na identificação dos recombinantes desejados e aplicável em diversas contextos de pesquisa.

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