Metodologia para a Geração Eficiente de Proteínas do Vírus da Vaccinia marcadas fluorescentes

Este experimento gera vírus vaccínia recombinantes marcados com fluorescência por meio de um método modular e rápido baseado na seleção dominante transitória. Primeiro, crie um vetor recombinante contendo uma marca fluorescente cercada por regiões mínimas sintetizadas de homologia, bem como marcadores para seleção metabólica e fluorescente. Transfete este vetor de recombinação em células infectadas e amplifique os vírus recombinantes utilizando seleção metabólica e fluorescência. Em seguida, remova a seleção metabólica para excisar o cassete de marcador e isole as células contendo vírus recombinantes pela seleção com marcador fluorescente. Os resultados de placas virais em monocamadas celulares permitem a visualização de partículas virais individuais que são características do gene marcado com fluorescência.

Desenvolvemos este método porque desejávamos gerar vírus recombinantes com múltiplas modificações genéticas utilizando um método de seleção que pudesse ser usado repetidamente e de forma universal, independentemente da marcação. Embora o princípio da seleção dominante transitória já tenha sido descrito anteriormente, queríamos aplicá-lo em maior escala e de maneira modular, a fim de obter mais flexibilidade na realização de modificações genômicas. Uma demonstração visual deste método é essencial, pois o rastreamento e o isolamento de placas virais recombinantes podem ser difíceis. Sua frequência pode ser baixa, e, portanto, são necessários métodos específicos para a recuperação eficiente do vírus.

Portanto, marque o gene viral de interesse na extremidade N ou C do proteína. Identifique, conforme apropriado, regiões flanqueadoras de 150 pares de bases com homologia. Em seguida, projete uma sequência de oligonucleotídeo composta pelos braços esquerdo e direito de 150 pares de bases, separados por um par de sítios de restrição de escolha. Flanqueie também esta região por um segundo par de sítios de restrição diferentes do primeiro par, para permitir a incorporação no vetor TDS após a síntese. Verifique agora se o oligonucleotídeo com os sítios de restrição foi projetado para estar no mesmo quadro de leitura do sítio de inserção desejado. Para a síntese do oligonucleotídeo, assegure-se de que os sítios de restrição incorporados entre os braços esquerdo e direito correspondam aos que flanqueiam a região codificante do marcador fluorescente de escolha. Incorpore esses mesmos sítios de restrição em ambos os lados do marcador fluorescente por PCR. Clone o fragmento sintetizado no vetor TDS. Clone também o marcador fluorescente no vetor de recombinação resultante, utilizando os sítios de restrição localizados entre as regiões de homologia dos braços esquerdo e direito. Infete uma monocamada de células BS-C-1 com vírus vaccinia em meio livre de soro.

Uma hora após a infecção, recupere as células com meio Eagle modificado de Dulbecco. Transfete com uma mistura do plasmídeo do vetor de recombinação e reagentes de transfeção em uma proporção de três para um em meio sem soro. Após 24 horas, raspe e recupere as células em DMEM contendo nenhum soro bovino fetal. Submeta as células a três ciclos de congelamento e descongelamento para romper as células e liberar as partículas virais. Em seguida, para obter uma separação adequada de placas individuais, infecte monocamadas de células BS-C-1 confluentes a 100% com diluições seriadas da preparação de partículas virais. Cubra com meio líquido contendo 10% de FBS e DMEM acrescido dos reagentes de seleção GPT e incube por 24 horas.

Aspire a sobrenadante e utilize um microscópio fluorescente para procurar placas que exibam fluorescência vermelha difusa, correspondente à incorporação de M-cherry do vetor TDS no vírus. Dependendo do gene alvo e da marca fluorescente escolhida, pode-se também observar fluorescência localizada do gene marcador na mesma placa vermelha.

Agora, para coletar múltiplas placas para cada vírus recombinante, raspe com a ponteira da pipeta e, com 100 microlitros de DMEM contendo 5% de FBS, transfira as células para um tubo Eppendorf. Realize três ciclos de congelamento e descongelamento das células raspadas, para liberar os vírus recombinantes.

Adicione o DMEM contendo o vírus submetido a ciclos de congelamento-descongelamento a uma monocamada de células, em uma placa de 12 poços, para amplificar os vírus recombinantes com reagentes de seleção GPT no meio de crescimento. Em seguida, raspe as amplificações bem-sucedidas após 24 horas da infecção. Para um ensaio de placa de placas amplificadas com sucesso, que exibem fluorescência vermelha, semeie uma placa de seis poços com uma monocamada de células BS-C-1.

Realize uma diluição seriada dos vírus recombinantes e infecte as cavidades com uma diluição crescente de vírus em DMEM sem FBS. Uma hora após a infecção, remova o meio líquido e cubra cada cavidade com ágarose a 0,5% em meio mínimo essencial completo. Três dias após a infecção, selecione as placas que exibem fluorescência vermelha e a cor da marcação fluorescente escolhida.

Amplifique-os novamente sem seleção por GPT. Escolha placas que tenham perdido a fluorescência vermelha difusa, mas que mantenham a fluorescência localizada correspondente à marcação de escolha. Continue a purificação por placas sem seleção para obter um estoque puro de vírus recombinantes que tenham perdido os genes de seleção M-cherry e GPT, mas que mantenham a fluorescência localizada correspondente à marcação escolhida.

Avalie a pureza dos estoques com um ensaio de placa, visando obter todas as placas com fenótipo de placa semelhante. Amplifique os estoques virais de teste em uma monocamada de células BS-C-1. Após 24 horas pós-infecção, raspe as células infectadas para dentro de 250 microlitros de DMEM. Centrifugue as células infectadas, remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em 500 microlitros de SDS 0,1% em tampão TE. Agite em vórtex para lisar as células. Em seguida, adicione 500 microlitros de fenol, clorofórmio, álcool isoamílico e inverta para misturar. Centrifugue. Recolha a fase superior e repita a extração.

Em seguida, para precipitar o DNA da camada aquosa, adicione um mililitro de etanol gelado a 100% e 50 microlitros de acetato de sódio. Misture por inversão e coloque a amostra a 20 graus Celsius negativos durante a noite. Após a centrifugação para formar o pellet de DNA, remova todo o líquido, seque o pellet de DNA ao ar e reconstitua-o em 50 microlitros de tampão TE. Utilize este molde de DNA genômico para triagem por PCR de inserção viral. Gere vírus recombinantes com múltiplas marcas conforme detalhado no protocolo textual.

Esses vírus vaccínia recombinantes expressam proteínas marcadas com indicadores fluorescentes direcionados a proteínas estruturais virais, A3 e F13, que fazem parte, respectivamente, do núcleo interno e do envelope externo do vírus. Genes correspondentes a proteínas localizadas no virion foram selecionados para visualizar partículas virais. A3 é uma proteína do núcleo do virion vaccínia, e F13 é uma proteína do envelope viral.

Um vírus duplamente marcado, com A3 e F13 fluorescentemente rotulados, também é mostrado. Pode-se realizar microscopia de fluorescência em tempo real com um vírus duplamente marcado. Nesse caso, a proteína do núcleo interno do vírus vaccinia, A3, é marcada em vermelho e a proteína do envelope externo F13 é marcada em verde.

Partículas virais desenvelopadas provenientes da fábrica viral são visualizadas em vermelho e os viriões envelopados são representados pela colocalização dos canais vermelho e verde. A análise quantitativa foi utilizada para determinar as eficiências de recombinação entre vetores recombinantes e o genoma do vírus vaccínia. A eficiência de recombinação homóloga de vetores com o genoma do vírus vaccínia pode ser detectada com regiões de homologia tão pequenas quanto 70 pares de bases.

Este método tem sido usado para criar vírus com múltiplas marcas fluorescentes e/ou múltiplas deleções gênicas. Esses vírus têm sido empregados no estudo do ciclo infeccioso do vírus, do papel das proteínas virais na subversão dos sistemas de defesa do hospedeiro, bem como das interações com os processos de sinalização do hospedeiro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar vírus vaccínia recombinantes utilizando um método que é modular nas marcas utilizadas, meticuloso na identificação dos recombinantes desejados e aplicável em diversas contextos de pesquisa.