Name: Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprenda a isolar núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq e ATAC-seq de núcleo único. Este método eficiente reduz o tempo de processamento e preserva a qualidade das amostras para estudos de heterogeneidade tumoral.

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Agradecemos ao Laboratório Aberto de Células Únicas (scOpenLab) do Centro Alemão de Câncer (DKFZ) por discussões úteis. Esta pesquisa foi apoiada pelo German Cancer Aid, Max-Eder Program grant number 70111964 (S.T.).

Amostras de glioma congelado fresco foram obtidas do Banco Nacional de Doenças tumorais (NCT) em Heidelberg, Alemanha. O uso do material do paciente foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina de Heidelberg, e o consentimento informado foi obtido de todos os pacientes incluídos no estudo.
1. Preparação experimental
<ol><li>Realize todos os passos no gelo ou a 4 °C.</li>
	<li>Tubos pré-frio, pratos, lâminas de barbear, douncers e pilões a 4 °C.</li>
	<li>Prepare todos os buffers com antecedência. Estes tampões estão estáveis à temperatura ambiente. Recomenda-se filtragem estéril, especialmente para sacarose. Os preparos das ações são modificados a partir de Corces et al.19. Ver Tabelas 1-7.</li>
	<li>Remova amostras de nitrogênio líquido ou -80 °C de armazenamento congelador e mantenha em gelo seco até o passo 2.1.</li>
</ol>2. Dissecção e dissociação de tecidos
<ol><li>Transfira a amostra de tecido congelado fresco (10-60 mgs) para uma placa de Petri pré-refrigerada. Mince/chop tecido congelado fresco com uma lâmina de barbear em pequenos pedaços no gelo.</li>
	<li>Adicione 500 μL de tampão de lise de núcleos refrigerados a um tubo pré-refrigerado de 1,5 mL. Coloque os pedaços de tecido no tubo de 1,5 mL contendo o tampão de lise dos núcleos e transfira para um Douncer(Tabela de Materiais). NOTA: Existem dois pilões homogeneizadores do Dounce: pilão "solto" ou "A" para redução inicial da amostra e pilão "apertado" ou "B" para homogeneização completa da amostra.</li>
	<li>Dounce as peças teciduais com o pilão "solto" por cerca de 20 golpes, até que o atrito seja reduzido. Se os detritos estiver presente, a amostra pode ser pré-limpa por filtragem com um coador de 100 mm.</li>
	<li>Dounce com o pilão "apertado" para 20 golpes para alcançar a homogeneização completa do tecido.</li>
	<li>Transfira o homogeneato (cerca de 500 μL) para um tubo pré-refrigerado de 2 mL. Adicione 1 mL de tampão de lise resfriado. Misture delicadamente e incubar no gelo por 5 minutos. Misture delicadamente com uma ponta de pipeta larga e repita 1-2 vezes durante a incubação.</li>
	<li>Filtre toda a homogeneidade usando uma malha de coador de 30 μm, colecione em um tubo Falcon de 15 mL e transfira de volta para um novo tubo pré-refrigerado de 2 mL. Um único coador é tipicamente suficiente para todo o homogeneizar.</li>
	<li>Verifique sob um microscópio de luz para verificar a remoção de grandes detritos e a intactidade da membrana nuclear. Os núcleos precisam ser redondos e a membrana nuclear não deve ser distorcida. Se os detritos estiverem presentes, os núcleos podem ser refilfilfil filtrados.</li>
	<li>Centrifugar os núcleos a 500 x g por 5 min a 4 °C em uma centrífuga superior de banco. Remova o supernatante, deixando para trás ~50 μL com pelota contendo os núcleos. Levemente resuspenque a pelota em mais 1 mL de tampão de lise nuclei e incubar por 5 minutos no gelo.</li>
	<li>Centrifugar os núcleos a 500 x g por 5 min a 4°C. Retire o supernasce sem perturbar a pelota, adicione 500 mL de tampão de homogeneização de 1x (HB)(Tabela 4) e incubar por 5 minutos sem resususcupação. Em seguida, resuspense os núcleos em outros 1,0 mL de HB 1x.</li>
	<li>Centrifugar os núcleos a 500 x g por 5 min a 4 °C. Remova o supernasal e retire suavemente os núcleos em 200 μL de 1x HB em um novo tubo de 2,0 mL.</li>
</ol>3. Centrifugação gradiente
<ol><li>Adicione 200 μL de solução iodixanol de 50%(Tabela 5) para dar uma concentração final de 25% de iodixanol. Misture bem 10 vezes com pipeta em 300 mL.</li>
	<li>Adicione 300 μL de solução iodixanol de 29%(Tabela 6) sob a mistura de 25%. Use uma ponta fina P1000 para evitar a mistura das camadas.</li>
	<li>Adicione 300 μl de solução de Iodixanol de 35%(Tabela 7) sob a mistura de 29%. Use uma ponta fina P1000 para evitar a mistura das camadas. Atenção: Esta etapa requer a remoção gradual da ponta da pipeta durante a pipetação para evitar o deslocamento excessivo do volume.</li>
	<li>Coloque as amostras em uma centrífuga de balde balançando, gire por 20 min a 3.500 x g a 4°C com o freio desligado.</li>
	<li>Remova suavemente as amostras sem tremer e observe sob a luz. Uma faixa branca clara de 95% de núcleos puros deve ser visível entre a segunda e a terceira camada(Figura 1).</li>
</ol>4. Isolamento dos núcleos
<ol><li>Aspire as camadas superiores até a faixa de núcleos brancos na interfase de 29%-35%.</li>
	<li>Colete a banda de núcleos em um volume de 200 mL, transfira para um tubo fresco e filtro com um filtro de 20 μm(Tabela de Materiais). NOTA: Os núcleos não precisam ser resuspendidos antes da filtragem.</li>
	<li>Verifique sob um microscópio de luz para verificar a remoção de grandes detritos e a intactidade da membrana nuclear. Os núcleos precisam ser redondos e a membrana nuclear não deve ser distorcida.</li>
	<li>Conte núcleos usando manchas azuis trypan em um hemócitometro e núcleos de alíquota para snRNA-seq/snATAC-seq.</li>
</ol>5. Núcleos únicos RNA e ATAC seq
<ol><li>Processe imediatamente os núcleos utilizando a expressão genética de célula única e os kits de reagente ATAC de célula única(Tabela de Materiais). NOTA: As concentrações de amostra de núcleos para o sistema de genômica 10x são 1500-3000 núcleos por μL para snRNA-seq, e 3500-7000 núcleos por m μL para snATAC-seq. Os núcleos podem ser diluídos usando 1x PBS.</li>
	<li>Sequencie as bibliotecas resultantes no Centro de Genômica.</li>
	<li>Realize a análise de controle de qualidade dos dados. Os núcleos são incluídos para análise suplementar se eles contêm Identificador Molecular Único (UMI) >1000, número de genes >500 e por cento dos genes mitocondriais <5%, e estão dentro da média + três desvios padrão dos UMIs e genes.</li>
</ol>

<ol><li>Huse, J. T., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+brain+cancer%3A+advances+in+the+molecular+pathology+of+malignant+glioma+and+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).</li>
<li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li>
<li>Filbin, M. G., Suva, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliomas+Genomics+and+Epigenomics%3A+Arriving+at+the+Start+and+Knowing+It+for+the+First+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time.</a> Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).</li>
<li>Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+gliomas%3A+from+morphology+to+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archive%22%5BJournal%5D)">Characterization of gliomas: from morphology to molecules.</a> Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).</li>
<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System%3A+a+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li>
<li>Eckel-Passow, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+Groups+Based+on+1p%2F19q%2C+IDH%2C+and+TERT+Promoter+Mutations+in+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+landscape+and+clonal+architecture+in+grade+II+and+III+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas.</a> Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Research. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive%2C+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li>
<li>Noushmehr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+CpG+island+methylator+phenotype+that+defines+a+distinct+subgroup+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma.</a> Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).</li>
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<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li>
<li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).</li>
<li>Mathys, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease.</a> Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Al-Dalahmah, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-seq+identifies+Huntington+disease+astrocyte+states%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19(2020).</li>
<li>Jakel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+human+oligodendrocyte+heterogeneity+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis.</a> Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).</li>
<li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions%2C+technologies%2C+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. , (2018).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+single-cell+analysis+of+transcriptional+and+epigenetic+states+in+the+human+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain.</a> Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Bready, D., Placantonakis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Pathogenesis+of+Low-Grade+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma.</a> Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).</li>
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<li>Weng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptomics+Uncovers+Glial+Progenitor+Diversity+and+Cell+Fate+Determinants+during+Development+and+Gliomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis.</a> Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).</li>
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<li>Al-Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+chromatin+accessibility+reveals+intratumoral+epigenetic+heterogeneity+in+IDH1+mutant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201(2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O campo da heterogeneidade intra-tumoral está em uma fase emocionante, com novos ensaios e plataformas sendo desenvolvidos para desafiar e expandir o conhecimento existente. A heterogeneidade intra-tumoral é um fator crucial que contribui para a progressão da doença e resistência às modalidades atuais de tratamento em gliomas28. Estudos recentes sobre tumores cerebrais têm focado nesse importante aspecto usando ensaios transcriômicos e epigenômicos de células únicas para melhor caracterizar a hete...

Gliomas de menor grau difuso (LGG), o tumor cerebral primário mais comum em adultos, são neoplasias infiltrativas que frequentemente surgem no hemisfério cerebral. Os LGGs apresentam heterogeneidade inter e intra-tumor, que não é apenas impulsionada pela população tumoral, mas também pelas células não malignas intrincadamente envolvidas no desenvolvimento e progressão do tumor1,2,3,4,5.
Na última década, houve uma avalanche de dados genômicos coletados no campo dos gliomas. Esses dados vêm principalmente de estudos de sequenciamento de tumores em massa e têm contribuído imensamente para a caracterização molecular, e a classificação atual dos tumores cerebrais5,6,7,8,9,10,11. No entanto, embora esses estudos tenham revelado a ampla paisagem molecular associada aos gliomas, ainda há uma decepcionante falta de progresso em relação à intervenção terapêutica. Um dos obstáculos à resistência ao tratamento em tumores cerebrais é a heterogeneidade intra-tumoral. Para abordar essa questão, vários estudos têm se concentrado na heterogenidade genômica, transcriômica, proteômica e epigenética presente dentro de um tumor em um único nível celular12,13,14,15,16,17.
Embora tenha havido notáveis avanços tecnológicos no campo de células únicas nos últimos dois anos, um dos principais fatores limitantes é a disponibilidade de espécimes frescos necessários para isolar as células e realizar esses experimentos. Para superar essa limitação, houve várias tentativas bem sucedidas de realizar ensaios, como snRNA-seq e snATAC-seq de tecidos congelados, utilizando núcleos em vez de células18,19. A maioria desses métodos depende tanto da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) quanto das estratégias de filtragem. Tanto as abordagens de células únicas quanto de núcleos únicos têm seus pontos fortes e desvantagens. Abordagens unicelulares mantêm transcrições mitocondriais, que embora possam ser informativas, também podem reduzir a cobertura do transcriptome devido à sua alta abundância. Abordagens de isolamento de núcleos únicos eliminam uma alta porcentagem da fração mitocondrial, permitindo assim uma cobertura mais aprofundada das transcrições nucleares20.
Existem várias plataformas comercialmente disponíveis que têm sido usadas ao longo dos últimos anos para avaliar dados de genômica de células únicas, incluindo RNA-seq e ATAC-seq. Uma das plataformas mais proeminentes é a plataforma 10x Genomics Chromium para expressão genética de células únicas e perfil de célula única ATAC. Como a plataforma trabalha com a ajuda de câmaras microfluídicas, quaisquer detritos ou agregados podem entupir o sistema levando à perda de dados, reagentes e amostras clínicas valiosas. Portanto, o sucesso de estudos unicelulares depende em grande parte do isolamento preciso de células/núcleos únicos.
O protocolo que demonstraremos aqui é uma combinação ligeiramente modificada dos protocolos DroNc-seq e Omni-ATAC-seq, e utiliza uma abordagem semelhante aos estudos recentes que utilizam o snRNA-seq para entender distúrbios neurológicos e tipos de células neuronais no cérebro humano18,19,21,22,23,24. O protocolo utiliza uma combinação de dissociação enzimática/mecânica de amostras congeladas seguida de filtração e centrifugação gradiente e permite o isolamento rápido e preciso de núcleos únicos de tecidos glioma congelados frescos. Usamos com sucesso este protocolo para gerar dados snRNA-seq e snATAC-seq a partir da mesma preparação de núcleos de amostras de tumores cerebrais.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Homogeneizador</td><td>Motivo ativo</td><td>40401</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol (também conhecido como Optiprep)</td><td>Stem cell technologies</td><td>07820</td><td></td></tr><tr><td>MACs Smart Strainers (30 &micro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (100 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Ac)2</td><td>Sigma</td><td>63052-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Abcam</td><td>ab142227</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Isolamento de Núcleos: Filtros</td> de Pré-Separação <td>Sigma</td><td>NUC101-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de Fenilmetanossulfonil (PMSF)</td> <td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>(20 &micro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-812</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de trava segura 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de trava segura 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Single Cell ATAC</td><td>10x Genômica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expressão Gênica de Célula Única</td><td>10x Genômica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de diâmetro largo (1000 &micro; L)</td><td>Themo Fisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de diâmetro largo (200 &micro; L)</td> <td>Themo Fisher Científico</td><td>2069GPK</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para rna-seq de núcleo único e atac-seq

Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

Gliomas difusos adultos apresentam heterogeneidade inter e intra-tumor. Até recentemente, a maioria dos esforços de perfil molecular em larga escala se concentraram em abordagens em massa que levaram à classificação molecular de tumores cerebrais. Nos últimos cinco anos, abordagens de sequenciamento de células únicas têm destacado várias características importantes dos gliomas. A maioria desses estudos tem utilizado amostras de tumores cerebrais frescos para isolar células únicas usando citometria de fluxo ou métodos de separação baseados em anticorpos. Seguindo em frente, o uso de amostras de tecido fresco congelados de biobancos fornecerá maior flexibilidade às aplicações de células únicas. Além disso, à medida que o campo unicelular avança, o próximo desafio será gerar dados multi-omics de uma única célula ou da mesma preparação amostral para desvendar melhor a complexidade tumoral. Portanto, protocolos simples e flexíveis que permitem a geração de dados para vários métodos, como sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) e ensaio de núcleo único para Chromatina Transposase-Acessível com sequenciamento de alto throughput (snATAC-seq) serão importantes para o campo.
Os recentes avanços no campo de células únicas, juntamente com instrumentos microfluidos acessíveis, como a plataforma de genômica 10x, facilitaram aplicações de células únicas em laboratórios de pesquisa. Para estudar a heterogeneidade do tumor cerebral, desenvolvemos um protocolo aprimorado para o isolamento de núcleos únicos de gliomas congelados frescos. Este protocolo mescla protocolos de célula única existentes e combina uma etapa de homogeneização seguida de filtração e centrifugação de gradiente mediada por buffer. As amostras resultantes são suspensões de núcleos únicos puros que podem ser usadas para gerar dados de expressão genética de núcleo único e de acessibilidade de cromatina a partir da mesma preparação de núcleos.

Genômica de núcleo único é um campo em evolução com dados e protocolos limitados. Um fator crítico que influencia o resultado de ensaios de núcleos únicos é o isolamento de núcleos puros e intactos. Combinamos dois protocolos publicados (protocolos DroNc-seq e Omni-ATAC-seq) para isolar núcleos de alta qualidade e puros de blocos de tecido glioma congelados frescos em um tempo relativamente curto, mantendo assim a estabilidade das transcrições(Figura 1).
O uso de ...

A heterogeneidade intra-tumoral é uma característica inerente aos tumores, incluindo gliomas. Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente que utiliza uma combinação de buffers e centrífugas gradientes para isolar núcleos únicos de tecidos glioma congelados frescos para estudos de sequenciamento de núcleo único RNA e ATAC.

Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

O objetivo do nosso método é isolar núcleos de tumores frescos congelados e a mesma preparação de núcleos pode ser usada para estudos transcricionais e epigenéticos. Portanto, podemos fazer várias perguntas-chave, como: como os tumores evoluem durante a progressão e como as terapias afetam a composição do tumor? A maior vantagem desse método é que ele é simples, reduz o tempo de processamento e, o mais importante, produz núcleos de alta qualidade.A ausência de uma etapa de classificação reduz o estresse nos núcleos. E a outra vantagem é sua capacidade de ser usada em tumores congelados de arquivo. Demonstrando o procedimento estará Ashwin Narayanan, um pós-doutorado do meu laboratório.Comece transferindo 10 a 60 miligramas de amostra de tecido fresco congelado para uma placa de Petri pré-resfriada. Pique ou pique o tecido fresco congelado com uma lâmina de barbear em pequenos pedaços no gelo. Adicione 500 microlitros de tampão de lise de núcleos resfriado no tecido da placa de Petri.Em seguida, transfira a mistura para um douncer. Esfregue os pedaços de tecido com o pilão solto por cerca de 20 golpes até que o atrito seja reduzido. Em seguida, dounce-o com o pilão apertado por 20 golpes para obter a homogeneização completa do tecido.Transferir o homogeneizado para um tubo pré-refrigerado de dois mililitros e adicionar um mililitro de tampão de lise refrigerado no aplicador, enxaguar e adicionar ao tubo. Misture delicadamente e incube no gelo por cinco minutos, misturando com uma ponta de pipeta de diâmetro largo uma a duas vezes durante a incubação. Filtrar todo o homogeneizado com uma malha de filtro de 30 microlitros e recolhê-lo num tubo Falcon de 15 mililitros.Em seguida, transfira-o de volta para um novo tubo pré-resfriado de dois mililitros. Um único filtro é normalmente suficiente para todo o homogeneizado. Verifique a amostra sob um microscópio óptico para verificar a remoção de grandes detritos e a integridade da membrana nuclear.Os núcleos não precisam ser redondos e a membrana nuclear não deve ser distorcida. Se houver detritos, repita a filtração. Em seguida, centrifugue os núcleos em uma centrífuga de bancada por cinco minutos.Remova o sobrenadante, deixando para trás aproximadamente 50 microlitros do pellet contendo núcleos. Ressuspender suavemente o pellet noutro mililitro de tampão de lise de núcleos e incubá-lo durante cinco minutos no gelo. Repetir a centrifugação e, em seguida, remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento.Adicione 500 mililitros de HB e incube a amostra por cinco minutos sem ressuspender. Em seguida, ressuspenda os núcleos em outro mililitro de HB. Centrifugue por mais cinco minutos e remova o sobrenadante. Ressuspenda os núcleos em 200 microlitros de HB e transfira a suspensão para um novo tubo de dois mililitros.Adicione 200 microlitros de solução de 50% de iodixanol aos núcleos para uma concentração final de 25% de iodixanol e misture 10 vezes com a pipeta ajustada para 300 microlitros. Em seguida, adicione 300 microlitros de solução de iodixanol a 29% sob a mistura de 25% usando uma ponta fina P1000 para evitar misturar as camadas. Adicione 300 microlitros de solução de iodixanol a 35% sob a mistura de 29% com uma ponta fina P1000 e, em seguida, remova-a lentamente.Coloque as amostras em uma centrífuga de balde oscilante e gire-as por 20 minutos a 3.500 G a quatro graus Celsius com a interrupção. Remova suavemente as amostras sem agitar e observe-as sob a luz. Uma faixa branca clara de 95% de núcleos puros deve ser visível entre a segunda e a terceira camada.Para isolar os núcleos, aspire as camadas superiores para expor a banda branca dos núcleos na interface. Recolha a banda dos núcleos num volume de 200 mililitros e transfira-a para um novo tubo. Em seguida, filtre-o com um filtro de 20 micrômetros.Verifique os núcleos sob um microscópio óptico para verificar a remoção de grandes detritos e a integridade da membrana nuclear. Eles devem ser redondos e a membrana nuclear não deve ser distorcida. Conte os núcleos usando a coloração com azul de tripano em um hemocitômetro e alicoteVárias etapas de filtração, juntamente com a centrifugação gradiente, permitem o isolamento de núcleos puros com a maioria dos detritos descartados. A mesma preparação de núcleos isolados pode ser usada tanto para RNA-seq de núcleos únicos quanto para ATAC-seq de núcleos únicos. Como os núcleos isolados são da mesma amostra, os dados gerados podem ser co-incorporados usando pacotes R, como o Seurat, para gerar clusters e fornecer uma perspectiva multiômica.Para determinar se o protocolo é comparável aos conjuntos de dados publicados, os dados obtidos foram comparados com quatro estudos de RNA-seq de núcleo único disponíveis publicamente relacionados ao sistema nervoso central. Todos os conjuntos de dados foram mesclados e a distribuição do número de UMIs e genes foi visualizada usando um gráfico de violino. O resultado indicou que o método é comparável ao protocolo snRNA-seq mais recente.Ao tentar este protocolo, é importante ter cuidado extra e não misturar as camadas, durante a centrifugação do gradiente e o isolamento dos núcleos.

nuclei-isolation-from-fresh-frozen-brain-tumors-for-single-nucleus

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo descreve o protocolo para isolar núcleos únicos de tecido de glioma fresco congelado. Os núcleos únicos isolados podem ser usados como espécimes para técnicas de sequenciamento, como sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA) e sequenciamento de ensaio de núcleo único para cromatina acessível por transposase (snATAC) para obter insights mais profundos sobre a heterogeneidade inter e intratumoral observada no glioma dos tecidos nervosos centrais.

Isolamento de Núcleos de Tecidos de Glioma Frescos Congelados: Um Método para Obter Núcleos Intactos de Amostras de Tumores de Glioma

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos de alta qualidade do tecido fresco ou congelado para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. Inclui opções de Lise rompimento e célula tecido detergente-mecânica e hipotônica-mecânico, ambos dos quais podem ser usados para isolamento dos núcleos.

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

O isolamento de núcleos únicos depende da dissociação e da permeabilização baseada em detergente da membrana celular, passos que precisam de otimização e são propensos a introduzir artefatos técnicos. Demonstramos um protocolo detergente e sem enzimas para o rápido isolamento de núcleos intactos diretamente de todo o tecido, produzindo núcleos adequados para RNA-seq de núcleo único (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.

Isolamento de núcleos de tecido inteiro usando um método detergente e sem enzimas

Desenvolvemos um método que enriquece e isola populações de astrócitos humanos de tecido fresco congelado para uso em análises moleculares a jusante.

Isolamento de populações de astúcitos humanos adultos do córtex congelado fresco usando a classificação de núcleos ativados por fluorescência

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de alta qualidade de rins de camundongos congelados que melhoram a representação de tipos de células renais medulares e evitam os artefatos de expressão gênica da dissociação do tecido enzimático.

Isolamento de Núcleos do Rim de Rato Adulto para Sequenciamento de RNA de Núcleo Único

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de tecidos hepáticos arquivados congelados por flash para RNA-seq, ATAC-seq de núcleo único e multiômica articular (RNA-seq e ATAC-seq).

Isolamento de núcleos de tecido hepático congelado por flash para multiômica unicelular

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.

Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

O estudo descreve um protocolo simples, rápido e parcialmente automatizado para isolar núcleos de alta qualidade de tecidos congelados de mamíferos para sequenciamento de RNA de núcleo único a jusante.

Um Protocolo Simples, Rápido e Parcialmente Automatizado para o Isolamento de Núcleos Únicos de Tecidos Congelados de Mamíferos para Sequenciamento de Núcleo Único

O sucesso da transcriptômica de célula única/núcleo único e multi-ômica depende em grande parte da qualidade das células/núcleos. Portanto, o isolamento de células/núcleos do tecido e sua purificação devem ser altamente padronizados. Este protocolo descreve a preparação de núcleos do cérebro e da medula óssea para o ensaio de multioma de núcleo único a jusante.

Preparação de Núcleos Cerebrais e de Medula Óssea de Alta Qualidade para Ensaios Multioma de Núcleos Únicos

O protocolo fornece uma abordagem confiável e otimizada para o isolamento de núcleos de espécimes tumorais sólidos para sequenciamento de multioma usando a plataforma 10x Genomics, incluindo recomendações para condições de dissociação tecidual, criopreservação de suspensões unicelulares e avaliação de núcleos isolados.

Isolamento Otimizado de Núcleos de Espécimes Sólidos Documentais e Congelados para Sequenciamento Multioma

Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para a geração e análise a jusante de organoides cerebrais humanos usando sequenciamento de RNA de célula única e núcleo único.

Geração e análise a jusante de transcriptomas de célula única e núcleo único em organoides cerebrais

Aprenda a isolar núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq e ATAC-seq de núcleo único. Este método eficiente reduz o tempo de processamento e preserva a qualidade das amostras para estudos de heterogeneidade tumoral.

Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq

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