Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq

O objetivo do nosso método é isolar núcleos de tumores frescos congelados e a mesma preparação de núcleos pode ser usada para estudos transcricionais e epigenéticos. Portanto, podemos fazer várias perguntas-chave, como: como os tumores evoluem durante a progressão e como as terapias afetam a composição do tumor? A maior vantagem desse método é que ele é simples, reduz o tempo de processamento e, o mais importante, produz núcleos de alta qualidade.

A ausência de uma etapa de classificação reduz o estresse nos núcleos. E a outra vantagem é sua capacidade de ser usada em tumores congelados de arquivo. Demonstrando o procedimento estará Ashwin Narayanan, um pós-doutorado do meu laboratório.

Comece transferindo 10 a 60 miligramas de amostra de tecido fresco congelado para uma placa de Petri pré-resfriada. Pique ou pique o tecido fresco congelado com uma lâmina de barbear em pequenos pedaços no gelo. Adicione 500 microlitros de tampão de lise de núcleos resfriado no tecido da placa de Petri.

Em seguida, transfira a mistura para um douncer. Esfregue os pedaços de tecido com o pilão solto por cerca de 20 golpes até que o atrito seja reduzido. Em seguida, dounce-o com o pilão apertado por 20 golpes para obter a homogeneização completa do tecido.

Transferir o homogeneizado para um tubo pré-refrigerado de dois mililitros e adicionar um mililitro de tampão de lise refrigerado no aplicador, enxaguar e adicionar ao tubo. Misture delicadamente e incube no gelo por cinco minutos, misturando com uma ponta de pipeta de diâmetro largo uma a duas vezes durante a incubação. Filtrar todo o homogeneizado com uma malha de filtro de 30 microlitros e recolhê-lo num tubo Falcon de 15 mililitros.

Em seguida, transfira-o de volta para um novo tubo pré-resfriado de dois mililitros. Um único filtro é normalmente suficiente para todo o homogeneizado. Verifique a amostra sob um microscópio óptico para verificar a remoção de grandes detritos e a integridade da membrana nuclear.

Os núcleos não precisam ser redondos e a membrana nuclear não deve ser distorcida. Se houver detritos, repita a filtração. Em seguida, centrifugue os núcleos em uma centrífuga de bancada por cinco minutos.

Remova o sobrenadante, deixando para trás aproximadamente 50 microlitros do pellet contendo núcleos. Ressuspender suavemente o pellet noutro mililitro de tampão de lise de núcleos e incubá-lo durante cinco minutos no gelo. Repetir a centrifugação e, em seguida, remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento.

Adicione 500 mililitros de HB e incube a amostra por cinco minutos sem ressuspender. Em seguida, ressuspenda os núcleos em outro mililitro de HB. Centrifugue por mais cinco minutos e remova o sobrenadante. Ressuspenda os núcleos em 200 microlitros de HB e transfira a suspensão para um novo tubo de dois mililitros.

Adicione 200 microlitros de solução de 50% de iodixanol aos núcleos para uma concentração final de 25% de iodixanol e misture 10 vezes com a pipeta ajustada para 300 microlitros. Em seguida, adicione 300 microlitros de solução de iodixanol a 29% sob a mistura de 25% usando uma ponta fina P1000 para evitar misturar as camadas. Adicione 300 microlitros de solução de iodixanol a 35% sob a mistura de 29% com uma ponta fina P1000 e, em seguida, remova-a lentamente.

Coloque as amostras em uma centrífuga de balde oscilante e gire-as por 20 minutos a 3.500 G a quatro graus Celsius com a interrupção. Remova suavemente as amostras sem agitar e observe-as sob a luz. Uma faixa branca clara de 95% de núcleos puros deve ser visível entre a segunda e a terceira camada.

Para isolar os núcleos, aspire as camadas superiores para expor a banda branca dos núcleos na interface. Recolha a banda dos núcleos num volume de 200 mililitros e transfira-a para um novo tubo. Em seguida, filtre-o com um filtro de 20 micrômetros.

Verifique os núcleos sob um microscópio óptico para verificar a remoção de grandes detritos e a integridade da membrana nuclear. Eles devem ser redondos e a membrana nuclear não deve ser distorcida. Conte os núcleos usando a coloração com azul de tripano em um hemocitômetro e alicote

Várias etapas de filtração, juntamente com a centrifugação gradiente, permitem o isolamento de núcleos puros com a maioria dos detritos descartados. A mesma preparação de núcleos isolados pode ser usada tanto para RNA-seq de núcleos únicos quanto para ATAC-seq de núcleos únicos. Como os núcleos isolados são da mesma amostra, os dados gerados podem ser co-incorporados usando pacotes R, como o Seurat, para gerar clusters e fornecer uma perspectiva multiômica.

Para determinar se o protocolo é comparável aos conjuntos de dados publicados, os dados obtidos foram comparados com quatro estudos de RNA-seq de núcleo único disponíveis publicamente relacionados ao sistema nervoso central. Todos os conjuntos de dados foram mesclados e a distribuição do número de UMIs e genes foi visualizada usando um gráfico de violino. O resultado indicou que o método é comparável ao protocolo snRNA-seq mais recente.

Ao tentar este protocolo, é importante ter cuidado extra e não misturar as camadas, durante a centrifugação do gradiente e o isolamento dos núcleos.