Mapeando as Relações Estrutura-Função de Fatores de Transcrição Oncogênica Desordenados usando análise transcriômica

Realizar a análise da função da estrutura em fatores de transcrição repetitivos e desordenados é difícil. Ao acoplar a transcriptômica com o contexto celular correto, essa abordagem revela melhor relações importantes entre a função da estrutura. O uso do sequenciamento de RNA como saída funcional permite a avaliação eficaz de todos os genes regulados por uma única proteína em um experimento, tornando a detecção de função parcial mais provável.

A detecção de função parcial é particularmente importante para fatores de transcrição de fusão oncogênica, pois não sabemos como essas proteínas funcionam e seu sequenciamento pode levar a melhores terapias em cânceres impulsionados por fusão. Embora nos concentremos no domínio EWS desordenado em EWS / FLI, EWS está envolvido em outras fusões que contêm domínios de desordem com funções mal definidas. Para uma transdução de construção de expressão de cDNA primeiro, descongele rapidamente o vírus congelado com construções de cDNA em um banho-maria de 37 graus Celsius e misture suavemente 2,5 microlitros de oito miligramas por mililitro de polibreno em cada vil.

Em seguida, remova o meio de uma placa de cultura de células de 50 a 70% confluente de 10 centímetros por construção de frasco e contorne suavemente todo o volume de dois mililitros da construção na lateral da placa. Balance a placa para espalhar o vírus uniformemente pelas células e coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius por duas horas, balançando a placa a cada 30 minutos para evitar que as áreas da placa sequem. No final da incubação, adicione cinco mililitros de meio suplementado com soro fetal bovino, antibióticos, piruvato de sódio e polibreno.

Após a incubação durante a noite na incubadora de cultura de células, substitua o sobrenadante por meio de seleção e retorne as células à incubadora de cultura de células por mais sete a 10 dias para permitir a seleção e a expressão da construção do cDNA. No final do período de seleção, recolher as células num tubo cónico de 15 mililitros para contagem e alocar cinco a 10 vezes 10 para as quintas células num novo tubo para sequenciação de ARN e duas vezes 10 para as seis células noutro novo tubo para extração de proteínas. Sedimentar as células por centrifugação e ressuspender os pellets em um mililitro de PBS frio ou em centrifugação de cinco minutos.

Em seguida, congele rapidamente os pellets e o nitrogênio líquido e armazene as células a menos 80 graus Celsius. Para validar o knockdown de proteínas de interesse e a expressão do painel de construtos, seque as amostras de lisado de proteína com os anticorpos primários e secundários apropriados de acordo com os protocolos padrão de análise de Western blot. Para avaliar a qualidade e a quantidade de RNA, use o tampão de lise de um kit de extração baseado em coluna de rotação de sílica para analisar as amostras de células de sequenciamento de RNA e aplicar os lisados a uma coluna de remoção de DNA genômico a mais de 13.000 rotações por minuto por 30 a 60 segundos.

Em seguida, prossiga com a purificação da coluna de rotação de sílica e lave o RNA na coluna de acordo com as instruções do kit. Em seguida, eluir o RNA em 30 microlitros de tampão de eluição e analisar pelo menos 2,5 microgramas de RNA em um espectrofotômetro em uma proporção de 260 a 280 nanômetros para avaliar a quantidade de RNA e a qualidade da amostra. Para análise de arquivos fastq, use o Putty para abrir o terminal para o ambiente de computação de alto desempenho e criar um diretório de análise chamado project.

Navegue até o caminho para o diretório do projeto e crie um diretório para os arquivos fastq. gz brutos compactados chamado fastq e um segundo diretório chamado trimmed. Um programa de transferência de arquivos seguro apropriado para transferir o fastq bruto compactado.

gz do armazenamento local para o caminho para o diretório fastq do projeto e verifique se há um arquivo R1 e um R2 para cada amostra. Navegue até o caminho para o projeto fastq e use o comando em trim galore conforme indicado para cortar as leituras de baixa qualidade do fastq. gz.

Navegue até o caminho para o diretório do projeto e crie um novo diretório chamado saída STAR. Navegue até o caminho para o diretório de corte do projeto e use o comando indicado para executar STAR para alinhar o fastq cortado. gz.

Localize a saída necessária para as próximas etapas, que contêm as contagens por transcrição no local indicado e use o comando para ler cada arquivo de guia de leituras por gene out. Para a primeira coluna, use apenas os caracteres antes do ponto na coluna ID do gene ENSEMBL para facilitar o processamento downstream. Em seguida, use o comando para compilar as contagens de todas as amostras no quadro de dados chamado totcts e salve essa nova tabela de dados brutos de contagem como um arquivo de texto delimitado por tabulação.

Para definir o perfil de expressão diferencial para cada construção usando DESeq2, insira o design experimental do DESeq2 e use o conjunto de dados DESeq da função de matriz para construir um conjunto de dados DESeq para estimar os fatores de tamanho e executar o DESeq2. Para avaliar a qualidade da análise, use o DESeq2 para extrair as contagens de normalização logarítmica regularizadas. Ao extrair os resultados de cada perfil transcricional dos resultados do DESeq2, execute comparações em pares em referência à condição de knockdown ou ao vetor vazio da linha de base.

Altere ainda mais esses resultados com os símbolos do gene HGNC e extraia os dados dos dados DESeq2 como um único arquivo com o ID do gene ENSEMBL, símbolo HGNC, expressão baseMean e dados de expressão diferencial para todas as construções com alteração logarítmica dupla e valores de P brutos e ajustados. Avalie a normalização bem-sucedida do lote e a similaridade da amostra de interesse e use o código para usar as contagens normalizadas de log regularizadas para verificar o agrupamento de amostras com análise de componentes principais e gráficos de distância de amostra para amostra. Use as contagens normalizadas de log regularizadas para extrair os 1.000 genes mais variáveis em uma matriz e use um mapa de calor para realizar um agrupamento hierárquico não supervisionado das amostras com base nesses genes.

Para extrair os agrupamentos de interesse do dendrograma, decida qual nível dos agrupamentos de interesses do dendrograma aparecem e defina K igual ao número de agrupamentos nesse nível. Para determinar quais clusters são de interesse, retrace o mapa de calor ordenado por cluster e exporte a lista de genes associados a cada cluster em uma tabela e, em seguida, use uma ferramenta de bioinformática apropriada para identificar os papéis biológicos dos diferentes clusters de genes identificados e comparados entre as classes. Nesta análise representativa pode-se observar um knockdown e resgate efetivos com os construtos positivos e negativos.

Observe que as células resgatadas pelo DAF não conseguiram formar colônias, sugerindo transformação oncogênica prejudicada. Após a conclusão da validação do replicante, ensaios fenotípicos e contagens iniciais de genes de processamento de dados de sequenciamento de RNA podem ser obtidos para todas as amostras para normalização e análise em lote. O DESeq2 sem normalização de lote pode resultar em defeitos de lote confusos, provavelmente devido à variabilidade biológica introduzida pela passagem de células em cultura e diferenças no processamento de cada lote.

Após a normalização em lote, o DESeq2 pode ser usado para gerar perfis transcricionais para os construtos de interesse, em relação à linha de base. A análise de componentes principais para esses dados sugere que o perfil transcricional do DAF é intermediário, entre EWS/FLI do tipo selvagem e Delta 22, confirmando a função parcial. Além disso, o agrupamento hierárquico dos 1.000 genes mais variáveis entre as amostras mostra que o DAF falha em reprimir os genes-alvo EWS / FLI e retém apenas parcialmente a atividade de ativação do gene.

A análise dos principais genes sugere que as classes de genes que o DAF ativa são funcionalmente distintas dos alvos ativados por EWS / FLI onde o DAF não é funcional. Curiosamente, o DAF é mais capaz de resgatar genes ativados por microssatélites GGAA, mas incapaz de resgatar genes ativados perto de um local de alta afinidade. O emparelhamento da saída transcriptômica com os ensaios fenotípicos relevantes completa a análise da função da estrutura.

Os pesquisadores também podem usar outras técnicas para estudar os impulsionadores mecanicistas de diferentes funções transcricionais.