Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em Drosophila Larvas

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a nocicepção térmica em larvas de drosófila. Isso é realizado coletando larvas de drosófila para, posteriormente, expô-las a estímulos térmicos nocivos como um segundo passo opcional. As larvas podem ser irradiadas com UV, o que causa dano tecidual e sensibilização nociceptiva térmica. Em seguida, a larva pode ser testada localmente com uma sonda de calor ou globalmente utilizando uma placa aquecida, a fim de provocar respostas nociceptivas que podem ser quantitativamente medidas.

O teste com a sonda térmica mostra que as larvas têm um limite máximo na resposta nociceptiva ao calor, bem como uma relação surpreendente entre a temperatura de entrada e a amplitude da resposta provocada. O ensaio com a placa aquecida mostra que as larvas exibem uma sequência estereotipada de comportamentos nociceptivos que dependem da temperatura da água ao redor e da atividade dos neurônios sensoriais nociceptivos. Os métodos descritos aqui podem ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da nocicepção térmica, como se os animais respondem de maneira diferente a estímulos térmicos nocivos apresentados de forma local ou global.

Em geral, indivíduos novos no ensaio com sonda térmica terão dificuldades, pois dominar o ensaio exige prática para minimizar variações na pressão, na localização e no ângulo de aplicação da sonda. A demonstração visual do ensaio na placa aquecida é fundamental, já que os comportamentos provocados pelo aumento de temperatura precisam ser observados para serem plenamente compreendidos. Para obter larvas prole suficientes de um genótipo definido de interesse, cultive o estoque desejado diretamente ou monte cruzamentos em frascos contendo alimento para moscas, utilizando 20 a 30 fêmeas virgens e 15 a 20 machos. Cinco dias após a postura dos ovos, colha e limpe larvas no início do terceiro estádio larval removendo o alimento mole com uma espátula e filtrando com água corrente suave através de uma peneira com poros de 630 mícrons. Transfira as larvas no início do terceiro estádio para um pequeno suporte úmido de alimento para prevenir a desnutrição e a dessecação.

Após construir uma câmara de anestesia, use pinça ou pincel para colocar suavemente 10 larvas no início do terceiro estágio ao longo da parte interna da tampa e feche. Trabalhando em uma capela de exaustão, coloque a câmara de anestesia dentro de um frasco de acoplamento contendo um béquer de 10 mililitros com uma bola de algodão embebida em 1,5 mililitro de éter dático. Parafuse a tampa do frasco de acoplamento para expor as larvas aos vapores de éter por dois a 2,5 minutos.

Após a e autorização, remova a câmara de e autorização do frasco Coplan e deixe-a por alguns segundos na capela para que quaisquer resíduos de vapores de éter possam dissipar. Use uma garrafa com água para enxaguar suavemente as larvas da câmara de autorização para uma pequena placa de Petri. Seque as larvas anestesiadas com papel absorvente e, em seguida, fixe-as suavemente com o lado dorsal voltado para cima em uma tira de fita adesiva dupla face presa a uma lâmina de microscópio de vidro com três polegadas por uma polegada.

Coloque a lâmina na superfície inferior de uma câmara de irradiação UV e exponha as larvas à luz UV por seis segundos com intensidade de 20 milijoules por centímetro quadrado. Após a irradiação, mergulhe a lâmina em água para flutuar suavemente as larvas para longe da fita adesiva dupla face. Use pinça ou pincel para colocar delicadamente as larvas irradiadas em um recipiente de 15 por 45 milímetros.

Um frasco de cultura de vidro de um dram contendo um mililitro de alimento para moscas para recuperação por oito a 24 horas a 25 graus Celsius ou à temperatura de cultura desejada antes de realojá-los. Para ensaios de nocicepção térmica, primeiro ajuste a temperatura da sonda térmica ao ponto desejado. Use um pincel ou pinça para transferir suavemente uma larva individual para uma plataforma plana, garantindo que a larva esteja coberta por uma fina película de água.

Para minimizar a variação na pressão, bem como garantir a localização e o ângulo corretos do sensor térmico, a prática leva à perfeição. Pressione suavemente a ponta do sensor contra as larvas no segmento A4, aplicando uma leve pressão com a ponta em um ângulo de aproximadamente 45 graus entre o sensor e a superfície das larvas. A pressão deve causar uma leve indentação na superfície das larvas e geralmente será suficiente para impedir a locomoção.

Continue estimulando as larvas até que seja exibida uma resposta de retirada ou até que o corte de 22º seja atingido. As larvas que respondem geralmente mostram primeiro um comportamento preliminar de levantar a cabeça e a cauda, seguido pelo comportamento de retirada de rolar pelo menos 360 graus. Assim que o comportamento de retirada for iniciado, solte o contato com a sonda e registre a latência ou o tempo necessário para a retirada.

Se nenhum comportamento de retirada for observado dentro de 20 segundos, então a larva é uma não respondedora. Posicione as guias de luz de fibra óptica para garantir uma iluminação com alto contraste adequado. Para visualizar as larvas, coloque o bloco aquecedor sobre a placa aquecedora com a superfície plana voltada para cima e, em seguida, coloque a placa aquecedora na base do microscópio.

Ligue a placa aquecedora na configuração alta e aguarde aproximadamente 15 minutos para que a temperatura se estabilize em 95 graus Celsius. Meça 80 microlitros de água destilada e coloque a gota de água no centro de uma placa de Petri de poliestireno de 60 por 15 milímetros com uma micropipeta. Use pinças para colocar suavemente uma larva limpa do terceiro estágio larval no centro da gota de água, introduzindo o mínimo de água adicional possível.

Coloque suavemente a placa de Petri sobre o bloco de aquecimento sólido da placa aquecedora. Ajuste rapidamente a posição da placa para que as larvas inteiras e a gota de água fiquem visíveis. Inicie o cronômetro.

No momento, a placa de Petri é colocada sobre o bloco aquecedor sólido da placa térmica e registra-se o tempo de início de cada comportamento. Cinco. Comportamentos locomotores estereotipados são observados ao transferir a larva imersa em água para a placa aquecedora. O comportamento normal na ausência de calor envolve locomoção em formato de guarda-chuva, acompanhada de movimentos de cabeça de busca.

O comportamento de agitação da cabeça pode ocorrer quando a larva move rapidamente a cabeça em movimentos para frente ou laterais. Esse movimento é semelhante à locomoção normal delas na água, mas ocorre de forma mais abrupta e com rolamentos persistentes. O comportamento ocorre quando a larva realiza um rolamento lateral de pelo menos 360 graus completos.

Isso pode ocorrer um número variável de vezes e, às vezes, envolve rolagens incompletas. Para fins de pontuação do comportamento, conte apenas rolagens completas de 360 graus. Este comportamento é o mais semelhante à cena com aplicação local da sonda térmica durante o comportamento de chicotada.

A larva exibe movimentos rápidos de contração e relaxamento ao longo do eixo anteroposterior, aproximando brevemente a cabeça da cauda. Agitações são frequentemente observadas em rápida sucessão, duas ou simultaneamente com rolamentos. Por fim, a larva apresentará comportamento convulsivo, muitas vezes seguido por paralisia. Durante o comportamento convulsivo, a larva se estende ao longo do eixo interoposterior e exibe uma frequência elevada de movimentos do corpo inteiro.

O comportamento de tremor sem paralisia por encurvamento ocorre quando as larvas cessam o movimento. Em algumas larvas, isso é permanente, enquanto outras exibem posteriormente um movimento pulsátil de baixa frequência. Neste gráfico do percentual de respondentes pertencentes a cada categoria, há um limite máximo para a resposta larval à nocicepção térmica. No ensaio com sonda térmica, 100% das larvas são respondedoras rápidas até uma temperatura da sonda de 52 graus Celsius.

No entanto, a 54 graus Celsius e temperaturas superiores, 90% ou mais das larvas deixam de responder mesmo após 20 segundos de contato. Embora essas larvas continuem se movendo após o corte na 22ª vez, o número de rolamentos ou o tempo gasto no comportamento de retirada de aversão também pode ser medido e representado graficamente. Surpreendentemente, parece haver uma relação inversa entre a temperatura do estímulo aplicado e a robustez da resposta, já que temperaturas mais baixas parecem provocar um maior número de rolamentos.

Cinco comportamentos locomotores estereotipados são observados ao transferir a larva imersa em água para a placa aquecida. As latências médias nas quais esses comportamentos são observados são mostradas aqui, assim como as temperaturas médias da gota de água medidas para cada latência sob as condições ótimas do ensaio apresentadas aqui; a porcentagem de larvas que exibem cada comportamento distinto variou de 77 a 100%. Embora ocasionalmente os comportamentos de rotação e chicotada sejam omitidos, sobrepostos ou ocorram em ordem inversa, a porcentagem de larvas que sobreviveu após o início do comportamento de paralisia no ensaio com placa aquecida é mostrada aqui. As larvas foram aquecidas até a paralisia e então removidas para condições padrão de cultivo para recuperação.

As larvas tratadas com placebo receberam tratamento equivalente, exceto pela exposição ao calor, e a formação de PPE em adultos viáveis foi quantitativa no sétimo ao 13º dia. Aqui, MD G quatro induz a expressão de transgenes regulados por UAS em todas as quatro classes de neurônios sensoriais periféricos multidentríticos. UAS ou one delta C expressa uma versão modificada do canal de potássio retificador aberto de drosófila necessário para a transmissão sináptica, e UAS ourc um delta NC expressa uma versão ainda mais modificada do mesmo canal que não interfere na transmissão sináptica.

Observe que apenas as larvas que possuem tanto o driver MD GAL4 quanto o transgene UAS ORC1ΔC mostram latências aumentadas em quatro dos cinco comportamentos observados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir as respostas locais e globais de larvas de GEs a estímulos térmicos nocivos. Estes procedimentos podem ser combinados com outros métodos, como análise genética, para identificar os genes necessários para a nocicepção térmica. Ao tentar realizar o ensaio com a sonda térmica, é importante lembrar-se de minimizar a variação na pressão, localização e ângulo de contato da sonda.