Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em Drosophila Larvas

O objetivo geral do experimento a seguir é testar a nocicepção térmica em larvas de drosófilas. Isso é conseguido colhendo larvas de drosófila para posteriormente expô-las a estímulos térmicos nocivos como uma segunda etapa opcional As larvas podem ser irradiadas por UV, o que causa danos aos tecidos e sensibilização nociceptiva térmica. Em seguida, a larva pode ser sondada localmente com uma sonda de calor ou globalmente usando uma placa de calor para provocar respostas nociceptivas que podem ser medidas quantitativamente.

A sonda de calor mostra que as larvas têm um teto para a resposta nociceptiva ao calor e uma relação surpreendente entre a temperatura de entrada e a amplitude da resposta provocada. O ensaio da placa de calor mostra que as larvas exibem uma sequência estereotipada de comportamentos nociceptivos que dependem da temperatura da água circundante e da atividade dos neurônios sensoriais nociceptivos. Os métodos descritos aqui podem ajudar a responder a questões-chave no campo da nocicepção térmica, como os animais respondem de maneira diferente a estímulos térmicos nocivos que são apresentados local ou globalmente.

Geralmente, os indivíduos novos no ensaio de sonda de calor terão dificuldades porque dominar o ensaio requer prática para minimizar a variação na pressão, na localização e no ângulo de condução da sonda aplicada A demonstração visual do ensaio da placa de calor é crítica. Como os comportamentos provocados com o aumento da temperatura precisam ser vistos para serem mais apreciados. Para obter larvas de progênie suficientes de um genótipo definido de interesse, cultive o estoque desejado diretamente ou monte cruzamentos em garrafas contendo comida para moscas usando 20 a 30 fêmeas virgens e 15 a 20 machos cinco dias após a colheita da postura dos ovos e limpe as larvas do terceiro ínstar inicial, retirando o alimento mole para a mosca e coando com água corrente suavemente através de uma malha de tamanho de poro de 630 mícrons, transfira as larvas do terceiro ínstar inicial para uma pequena almofada úmida de comida para evitar fome e dessecação.

Depois de construir uma câmara de autorização, use uma pinça ou um pincel para colocar suavemente 10 larvas de terceiro ínstar ao longo do interior da tampa e feche. Trabalhando em uma capela de exaustão, colocou a câmara de autorização dentro de um frasco de acoplamento contendo um copo de 10 mililitros carregando uma bola de algodão embebida em 1,5 mililitros de éter datil. Aparafuse a tampa do frasco de coplan para expor as larvas aos vapores de éter por dois a 2,5 minutos.

Após a autorização, remova a câmara de autorização do frasco Coplan e aguarde alguns segundos no exaustor para que os vapores residuais do éter se dissipem. Use uma garrafa de esguicho de água para enxaguar suavemente as larvas da câmara de autorização em uma pequena placa de Petri. Seque as larvas anestesiadas e, em seguida, fixe-as suavemente com o lado dorsal para cima em uma tira de fita adesiva dupla face presa em uma lâmina de microscópio de vidro de três polegadas por uma polegada.

Coloque a lâmina na superfície inferior de uma câmara de irradiação UV e exponha as larvas à luz UV por seis segundos a 20 milijoules por centímetro quadrado de intensidade. Após a irradiação, mergulhe a lâmina em água para flutuar suavemente as larvas da fita adesiva dupla face. Use uma pinça ou um pincel para colocar suavemente as larvas irradiadas em um 15 por 45 milímetros.

Um frasco de cultura de vidro contendo um mililitro de alimento para moscas para recuperar por oito a 24 horas a 25 graus Celsius ou a temperatura de cultura desejada antes de hospedá-los novamente. Para ensaios de nocicepção térmica, primeiro predefina a temperatura da sonda térmica para o ponto de ajuste desejado. Use um pincel ou fórceps para transferir suavemente uma larva individual para uma plataforma plana, garantindo que as larvas sejam cobertas por uma fina película de água.

A fim de minimizar a variação de pressão, bem como para garantir a localização e o ângulo corretos da sonda de calor, a prática leva à perfeição. Pressione suavemente a ponta da sonda contra as larvas no segmento A quatro, aplicando uma leve pressão com a ponta em um ângulo de cerca de 45 graus entre a sonda e a superfície das larvas. A pressão deve causar um leve recuo na superfície das larvas e geralmente será suficiente para evitar a locomoção.

Continue estimulando as larvas até que uma resposta de retirada seja exibida ou até que o 22º ponto de corte seja alcançado. As larvas que respondem normalmente mostram primeiro um comportamento preliminar de levantar a cabeça e a cauda, seguido pelo comportamento de retirada de rolar pelo menos 360 graus. Assim que o comportamento de retirada for iniciado, libere o contato com a sonda e registre a latência ou o tempo necessário para a retirada.

Se nenhum comportamento de abstinência for observado em 20 segundos, a larva não responde. Posicione as guias de luz de fibra óptica para garantir que haja iluminação adequada de alto contraste. Para visualizar as larvas, coloque o bloco de aquecimento na placa de aquecimento com a superfície plana para cima e, em seguida, coloque a placa de aquecimento na base do microscópio.

Ligue a placa de aquecimento para a configuração alta e aguarde aproximadamente 15 minutos para que a temperatura se estabilize em 95 graus Celsius. Meça 80 microlitros de água destilada e coloque a gota de água no meio de uma placa de Petri de poliestireno de 60 por 15 milímetros com um micropipetador. Use uma pinça para colocar suavemente uma larva limpa do terceiro ínstar médio no meio da gota d'água, introduzindo o mínimo de água adicional possível.

Coloque delicadamente a placa de Petri no bloco de aquecimento sólido na placa de aquecimento. Ajuste rapidamente a localização do prato para que todas as larvas e gotas de água fiquem à vista. Inicie o cronômetro.

No momento, a placa de Petri é colocada no bloco de aquecimento sólido da placa de aquecimento e registra o tempo de início de cada comportamento. Cinco. Comportamentos locomotores estereotipados são observados após a transferência da larva imersa em água para a placa de aquecimento. O comportamento normal na ausência de calor envolve locomoção do guarda-sol, acompanhada de movimentos de busca da cabeça.

O comportamento de batida da cabeça pode ocorrer em seguida, onde a larva move a cabeça rapidamente em um movimento para frente ou lateralmente. Este movimento é semelhante à sua locomoção normal na água, mas ocorre de forma mais brusca e persistente. O comportamento ocorre quando as larvas rolam lateralmente pelo menos 360 graus completos.

Isso pode ocorrer um número variável de vezes e às vezes envolve rolos incompletos. Para fins de pontuação, o comportamento conta apenas as jogadas completas de 360 graus. Esse comportamento é o mais semelhante à cena com a aplicação local da sonda de calor durante o comportamento do chicote.

A larva exibe movimentos rápidos de liberação de contração ao longo do eixo antio posterior que aproximam a cabeça muito brevemente da cauda O chicote é freqüentemente observado em rápida sucessão dois ou ao mesmo tempo que o rolamento. Finalmente, a larva exibirá comportamento convulsivo, muitas vezes seguido de paralisia. Durante o comportamento convulsivo, a larva se estende ao longo do eixo posterior de interoperabilidade e exibe um corpo inteiro de alta frequência.

O comportamento de agitação sem paralisia de flexão ocorre quando as larvas cessam o movimento Em algumas larvas, isso é permanente, enquanto outras exibem um movimento de pulsação de baixa frequência. Neste gráfico dos respondedores percentuais pertencentes a cada categoria, há um teto para a resposta de nocicepção térmica larval. No ensaio de sonda de calor, 100% das larvas respondem rapidamente até uma temperatura de sonda de 52 graus Celsius.

No entanto, a 54 graus Celsius ou mais, 90% ou mais das larvas não respondem mesmo após 20 segundos de contato. Embora essas larvas continuem se movendo após o 22º ponto de corte, o número de jogadas ou o tempo gasto no comportamento de retirada de aversão também pode ser medido e plotado. Surpreendentemente, parece haver uma relação inversa entre a temperatura de entrada da sonda e a robustez da resposta, pois temperaturas mais baixas parecem provocar um número maior de rolos.

Cinco comportamentos locomotores estereotipados são observados após a transferência da larva imersa em água para a placa de aquecimento. As latências médias nas quais esses comportamentos são observados são mostradas aqui, assim como as temperaturas médias das gotas de água medidas para cada latência sob as condições ideais de ensaio apresentadas aqui, a porcentagem de larvas mostrando cada comportamento distinto variou de 77 a 100% embora ocasionalmente os comportamentos de rolamento e chicote sejam omitidos, se sobreponham ou ocorram em ordem inversa, A porcentagem de larvas que sobreviveram após o início do comportamento de paralisia no ensaio da placa de calor é mostrada aqui. As larvas foram aquecidas até a paralisia e depois removidas para as condições padrão de cultura para recuperação.

As larvas tratadas simuladas receberam tratamento equivalente, exceto pela exposição ao calor e a formação de EPI em adultos viáveis foi quantitativa no sétimo ao 13º dia. Aqui, MD G quatro impulsiona a expressão de transgenes regulados por UAS em todas as quatro classes de neurônios sensoriais periféricos multidendríticos. UAS ou um delta C expressa uma versão modificada do canal de potássio retificador aberto de drosófila necessário para a transmissão sináptica e UAS orrc um delta NC expressa uma versão modificada adicional do mesmo canal que não interfere na transmissão sináptica.

Observe que apenas as larvas com o driver MD GALF quatro e o transgene UAS ORC um delta C mostram latências aumentadas para quatro dos cinco comportamentos observados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir as respostas locais e globais das larvas de miudezas transgênicas a estímulos térmicos nocivos. Esses procedimentos podem ser combinados com outros métodos, como análise genética, para identificar os genes necessários para a nocicepção térmica Ao tentar o ensaio da sonda de calor, é importante lembrar de minimizar a variação e a pressão, a localização e o ângulo de contato da sonda.