Name: Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em Drosophila Larvas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda métodos locais e globais para avaliar nocicepção térmica em larvas de Drosophila. Este protocolo utiliza sondas térmicas e placas aquecidas para quantificar respostas comportamentais e estudar processamento sensorial.

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Agradecemos Christian Landry para o calor de design da sonda, Daniel Babcock para o desenvolvimento do ensaio sonda larval calor, Sean Sweeney para sugerindo o ensaio de calor de placas, o Bloomington Drosophila Stock Center para as populações da mosca, e membros Galko laboratório para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 NS069828 para MJG e um NIH MARC U-STAR Training Grant (T34GM079088 para a Universidade de Houston Downtown-Scholars Academy) para o acesso das minorias às carreiras de investigação (AVG).

<ol><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li>
<li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810(2011).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li>
<li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors--noxious+stimulus+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

Os ensaios aqui descritos podem ser usados ​​para avaliar qualitativamente e quantitativamente as larvas de genótipos diferentes para a capacidade de resposta a estímulos térmicos nocivos. Uma característica principal do ensaio sonda de calor é que o estímulo é dada apenas com um único locus. Este presumivelmente leva à demissão de apenas um pequeno subconjunto de classe IV de neurônios as do segmento contactados pela sonda e, talvez, aqueles que imediatamente segmentos adjacentes 11. Devido à estimulação local, o ensaio de sonda de calor imita a experiência comum sensorial de detecção de um estímulo nocivo que está localizada a uma região do corpo em particular, como uma mão contactando um fogão quente. Uma desvantagem do ensaio sonda de calor é que tem alguma variabilidade utilizador para utilizador que pode provavelmente ser atribuída a três factores: i) a pressão com a qual o utilizador aplica a sonda para a larva, ii) a localização precisa da sonda sobre a larva em relação aos neurónios subjacentes nociceptiva, e iii) o ang precisole em que a sonda contacta com a superfície da larva. Nós relatado anteriormente uma estratégia quantitativa de larvas de categorização em não-respondedores, respondedores e respondedores lentos, rápidos baseados em sua latência de retirada a uma dada temperatura 1. Aqui nós relatamos em resposta larval a temperaturas ainda mais elevadas. Curiosamente, descobrimos que existe um limite máximo para larvais térmicas respostas nociceptivas e que este limite máximo situa-se entre 52 e 54 ° C. Isso pode indicar que as larvas não possuem um potencial receptor transiente (TRP) canais capaz de modular a temperaturas superiores a 52 ° C. Alternativamente, poderia sugerir que os neurônios ou músculos usados ​​para iniciar ou executar a resposta do motor danificado antes mesmo de funcionar na retirada aversivo. Relatamos também uma análise diferente da amplitude da retirada-resposta utilizando-se o número de rolos como um indicador da &quot;robustez&quot; da resposta. Ingenuamente, umaSeria de esperar que estes parâmetros aumentaria com o aumento da temperatura ou do tempo de estimulação. Surpreendentemente, descobrimos que este não é o caso. As larvas estimuladas durante um tempo mais longo a uma temperatura na extremidade baixa da gama nociva (42 ° C) mostram rolos mais e mais tempo gasto de rolamento do que as larvas sondado a temperaturas mais elevadas (48-52 ° C). Isto sugere que dentro da janela de temperatura nocivo é sobretudo a duração da exposição que determina a amplitude da resposta. Uma vez que as larvas expostas a temperaturas altamente nocivo (48-52 ° C) respondem, em média, muito rapidamente, que não apresentem como rolos muitos como larvas exposto a uma temperatura inferior a nociva durante um longo período de tempo. A análise da amplitude da resposta aqui relatados acrescenta uma outra dimensão quantitativa ao longo do qual os diferentes genótipos ou manipulações ambientais podem ser comparados. Uma característica principal do ensaio em placa de calor é que envolve uma exposição global para o nocivocalor. Como tal, é mais parecido com o animal sentado em um caldeirão de aquecimento do que tocar um fogão quente. Embora não seja claro quando uma larva pode experimentar um estímulo nocivo globalmente na natureza, no laboratório as respostas comportamentais a esta exposição global são mais complexos do que aqueles observados com a estimulação local. Uma força de ensaio em placa de calor, também observado por outros 3, é que tem variabilidade utilizador para utilizador pouco desde tocar a larva não é um componente do protocolo. A variância apenas substancial parece ser na definição quando cada comportamento começa e isto pode ser minimizado com visualização repetido / familiaridade. Uma diferença interessante entre os ensaios é as temperaturas às quais os comportamentos aversivos começar. Estes são muito mais baixa no ensaio em placa de calor do que com a sonda de calor. O comportamento preliminar exibido por larvas em contacto com a sonda de calor (cabeça e aumento da cauda) pode estar correlacionado com o thrash cabeça observada a ~ 27 ° C, na plataforma de calorensaio e. É possível que esta resposta reflete &quot;desconforto&quot; mais de &quot;dor&quot;. Nós não observaram uma correlação de chicotear, convulsões, paralisia e mesmo em concentrações elevadas (até 48 ° C), as temperaturas no ensaio de sonda de calor e pode ser que uma massa crítica de neurónio sensorial de queima a partir de mais do que uma região do corpo é necessário para trazer a esses comportamentos. Curiosamente, os comportamentos convulsivos e paralisia são observadas a temperaturas (~ 34 - 37 ° C) abaixo da extremidade inferior do limiar nociceptivo observado com a sonda de calor indicando que a estimulação global pode envolver soma das respostas neuronais que são insuficientes para provocar o comportamento com locais aplicação da sonda de calor. Que estas temperaturas são realmente percebida como nocivo para as larvas é suportada pela observação de que as larvas que começam o comportamento paralisia e são subsequentemente deixados a recuperar em alimentos mosca não na maioria dos casos sobreviver (Figura 5C). Favor da tese de que o pl calorensaio comeu é a leitura de respostas nociceptivas é o facto de que o bloqueio da transmissão sináptica na conhecidos nociceptivos neurónios sensoriais aumenta a latência da maioria dos comportamentos observados (Figura 6). A observação de que não há um aumento na latência para o comportamento temperatura mais elevada-chicotear sugere que outros neurónios sensoriais que não expressam md-Gal4 pode ser necessário para este comportamento. Em suma, ambos os ensaios envolvem expondo uma larva indivíduo a um estímulo nocivo térmica da temperatura definida - a ponta quente de uma sonda de metal pequeno no ensaio de local e de imersão em uma gota de água aquecendo rapidamente no ensaio global. Respostas comportamentais de Drosophila larvas de diferentes origens genéticas e / ou expostos a diferentes condições ambientais (por exemplo mais ou menos danos no tecido), pode ser estudada e quantificada utilizando estes ensaios. Em última análise, os resultados destes ensaios nos ajudará a entender melhor as redes genéticas que controlam nociception em Drosophila e outras espécies relacionadas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Sonda térmica </td><td> Pro-Dev Engenharia </td><td> Custom-construído sob demanda </td><td> As informações de contato podem ser fornecidas a pedido </td></tr><tr><td> Banho seco Incubadora </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718 </td><td> 1 bloco de aquecimento sólida e 1 bloco de aquecimento com poços de 16mm </td></tr><tr><td> Leica DFC290 12v/400mA Câmera colorida </td><td> Leica Microsystems </td><td> 12730080 </td><td> Qualquer equivalente câmara irá fazer. </td></tr><tr><td> Leica MZ6 microscópio </td><td> Leica Microsystems </td><td> Número da peça de corpo MZ6 zoom (portadora óptica) é 10445614 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Ace Unidade Modulamp </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schott dupla Gooseneck de 23 polegadas de Fibra Óptica Guia de Luz </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> Schott A08575 </td><td></td></tr><tr><td> Unidade de Controle Térmico </td><td> TSCI corp. </td><td> Custom Built </td><td> Detalhes podem ser fornecidas a pedido </td></tr><tr><td> Zeiss Stemi 2000 microscópio </td><td> Zeiss </td><td> NT55-605 </td><td> Qualquer equivalente microscópiovai fazer. </td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> Um milímetro de malha </td><td> Genesee Científico </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> Paintbrush </td><td> Dick Blick Materiais de arte </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> Reticulador UV </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin Jars </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> Copo 10ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> Éter dietílico </td><td> Fisher Scientific </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 X 10 mm de poliestireno prato de Petri </td><td> Falcão </td><td> 351008 </td><td> Nós não testamos pratos alternativos. </td></tr><tr><td> Lâmina de vidro </td><td> Corning </td><td> 26003 </td><td></td></tr><tr><td> Termopar </td><td> Omega Engineering, Inc. </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> Pedaço de vinil </td><td> Office Depot </td><td> 480009 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de microcentrífuga </td><td> Denville CientíficoInc. </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

métodos locais e globais de avaliação nocicepção térmica em<em&gt; drosophila</em&gt; larvas

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

Neste artigo, demonstramos ensaios para estudar a nocicepção térmica em larvas de Drosophila. Um ensaio envolve a estimulação espacialmente restrita (local) de 1,2 nociceptores térmica, enquanto o segundo envolve uma ativação (global) no atacado da maioria ou todos os neurônios tais 3. Juntas, essas técnicas permitem a visualização e quantificação das funções comportamentais de Drosophila nociceptivas dos neurônios sensitivos. A larva Drosophila é um sistema modelo estabelecido para estudar a nocicepção térmica, uma resposta sensorial para temperaturas potencialmente prejudiciais que é evolutivamente conservada entre espécies 1,2. As vantagens de Drosophila para tais estudos são relativa simplicidade do seu sistema nervoso ea sofisticação das técnicas genéticas que podem ser usados ​​para dissecar a base molecular da biologia subjacente 4-6 Em Drosophila, como em todos os metazoários, os response para estímulos térmicos nocivos geralmente envolve um &quot;nocifensive&quot; retirada aversivo ao estímulo apresentado 7. Tais estímulos são detectados através de terminações nervosas livres ou nociceptores e da amplitude da resposta organismal depende do número de nociceptores que recebem o estímulo nocivo 8. Em Drosophila, são os da classe IV, os neurónios sensoriais dendríticas arborização que detectam nocivas estímulos térmicos e mecânicos 9 em adição ao seu papel recentemente descoberto como fotorreceptores 10. Esses neurônios, que foram muito bem estudadas ao nível de desenvolvimento, arborize sobre a folha de barreira epidérmica e fazer contatos com quase todas as células epidérmicas 11,12. O axônio único de cada classe IV projectos de neurónios na medula ventral do nervo do sistema nervoso central 11, onde eles podem ligar a segunda ordem neurónios que projecto para o cérebro. Em condições basais, neuro sensorial nociceptivans não dispara até um limiar relativamente elevado for atingido. Os ensaios aqui descritos permitem que o investigador para quantificar as respostas comportamentais da linha de base ou, presumivelmente, a sensibilização que se segue danos nos tecidos a seguir. Cada ensaio provoca distintas, porém relacionadas locomotores respostas comportamentais a estímulos térmicos nocivos e permite ao pesquisador visualizar e quantificar diversos aspectos da nocicepção térmica em larvas de Drosophila. Os ensaios podem ser aplicados a larvas de genótipos desejados ou para larvas criadas em diferentes condições ambientais que podem afectar a nocicepção. Uma vez que a nocicepção térmica é conservada entre espécies, os resultados recolhidos a partir de dissecção genética em Drosophila provavelmente informar a nossa compreensão de nocicepção térmica em outras espécies, incluindo vertebrados.

Neste artigo, demonstramos ensaios para estudar a nocicepção térmica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas. Um ensaio envolve a estimulação espacialmente restrita (local) de nociceptores térmicos<sup&gt; 1,2</sup&gt; Enquanto o segundo envolve uma ativação (global) no atacado da maioria ou todos os neurônios tais<sup&gt; 3</sup&gt;. Juntas, essas técnicas permitem a visualização e quantificação das funções comportamentais de<em&gt; Drosophila</em&gt; Nociceptivas dos neurônios sensitivos.

Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Neste artigo, demonstramos ensaios para estudar a nocicepção térmica em larvas de Drosophila. Um ensaio envolve a estimulação espacialmente restrita (local) de ...

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a nocicepção térmica em larvas de drosófila. Isso é realizado coletando larvas de drosófila para, posteriormente, expô-las a estímulos térmicos nocivos como um segundo passo opcional. As larvas podem ser irradiadas com UV, o que causa dano tecidual e sensibilização nociceptiva térmica. Em seguida, a larva pode ser testada localmente com uma sonda de calor ou globalmente utilizando uma placa aquecida, a fim de provocar respostas nociceptivas que podem ser quantitativamente medidas.O teste com a sonda térmica mostra que as larvas têm um limite máximo na resposta nociceptiva ao calor, bem como uma relação surpreendente entre a temperatura de entrada e a amplitude da resposta provocada. O ensaio com a placa aquecida mostra que as larvas exibem uma sequência estereotipada de comportamentos nociceptivos que dependem da temperatura da água ao redor e da atividade dos neurônios sensoriais nociceptivos. Os métodos descritos aqui podem ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da nocicepção térmica, como se os animais respondem de maneira diferente a estímulos térmicos nocivos apresentados de forma local ou global.Em geral, indivíduos novos no ensaio com sonda térmica terão dificuldades, pois dominar o ensaio exige prática para minimizar variações na pressão, na localização e no ângulo de aplicação da sonda. A demonstração visual do ensaio com placa aquecida é essencial, já que os comportamentos provocados pelo aumento de temperatura precisam ser observados para serem plenamente compreendidos. Para obter quantidade suficiente de larvas prole de um genótipo definido de interesse, cultive o estoque desejado diretamente ou monte cruzamentos em frascos contendo alimento para moscas, utilizando 20 a 30 fêmeas virgens e 15 a 20 machos. Cinco dias após a postura dos ovos, colha e limpe larvas de terceiro instar iniciais removendo o alimento amolecido com uma espátula e filtrando com água corrente suave através de uma malha com poros de 630 mícrons. Transfira as larvas de terceiro instar iniciais para uma pequena almofada úmida de alimento para prevenir inanição e dessecação.Após construir uma câmara de anestesia, use pinça ou pincel para colocar suavemente 10 larvas no início do terceiro estágio ao longo da parte interna da tampa e feche. Trabalhando em uma capela de exaustão, coloque a câmara de anestesia dentro de um frasco de acoplamento contendo um béquer de 10 mililitros com uma bola de algodão embebida em 1,5 mililitro de éter dietílico. Parafuse a tampa do frasco de acoplamento para expor as larvas aos vapores de éter por dois a 2,5 minutos.Após a e autorização, remova a câmara de e autorização do frasco Coplan e aguarde alguns segundos na capela para que quaisquer resíduos de vapores de éter se dissipem. Use uma garrafa com água para enxaguar suavemente as larvas da câmara de autorização para um pequeno recipiente de Petri. Seque delicadamente as larvas anestesiadas e, em seguida, fixe-as suavemente com o lado dorsal voltado para cima em uma tira de fita adesiva dupla face presa a uma lâmina de microscópio de vidro de três polegadas por uma polegada.Coloque a lâmina sobre a superfície inferior de uma câmara de irradiação UV e exponha as larvas à luz UV por seis segundos com intensidade de 20 milijoules por centímetro quadrado. Após a irradiação, mergulhe a lâmina em água para flutuar suavemente as larvas para longe da fita adesiva dupla face. Use pinça ou pincel para colocar delicadamente as larvas irradiadas em um recipiente de 15 por 45 milímetros.Um frasco de cultura de vidro com capacidade de um dracma contendo um mililitro de ração para moscas, para recuperação por oito a 24 horas a 25 graus Celsius ou à temperatura de cultivo desejada antes de serem transferidos novamente. Para ensaios de nocicepção térmica, primeiro ajuste a temperatura da sonda térmica ao ponto desejado. Utilize um pincel ou pinça para transferir suavemente uma larva individual para uma plataforma plana, garantindo que a larva fique coberta por uma fina película de água.Para minimizar a variação na pressão e garantir a localização e o ângulo corretos do sensor térmico, a prática leva à perfeição. Pressione suavemente a ponta do sensor contra as larvas no segmento A4, aplicando uma leve pressão com a ponta em um ângulo de aproximadamente 45 graus entre o sensor e a superfície das larvas. A pressão deve causar uma leve indentação na superfície das larvas e geralmente será suficiente para impedir a locomoção.Continue estimulando as larvas até que uma resposta de recuo seja exibida ou até que o corte de 22º seja atingido. As larvas que respondem geralmente mostram primeiro um comportamento preliminar de levantar a cabeça e a cauda, seguido pelo comportamento de recuo de rolar pelo menos 360 graus. Uma vez iniciado o comportamento de recuo, solte o contato com a sonda e registre a latência ou o tempo necessário para o recuo.Se nenhum comportamento de retirada for observado dentro de 20 segundos, então a larva é uma não respondedora. Posicione as guias de luz de fibra óptica para garantir uma iluminação com alto contraste adequada. Para visualizar as larvas, coloque o bloco aquecedor sobre a placa aquecedora com a superfície plana voltada para cima e, em seguida, coloque a placa aquecedora na base do microscópio.Ligue a placa aquecedora na configuração alta e aguarde aproximadamente 15 minutos para que a temperatura se estabilize em 95 graus Celsius. Meça 80 microlitros de água destilada e coloque a gota de água no centro de uma placa de Petri de poliestireno de 60 por 15 milímetros com uma micropipeta. Use pinças para colocar suavemente uma larva limpa do terceiro estágio larval no centro da gota de água, introduzindo o mínimo de água adicional possível.Coloque suavemente a placa de Petri sobre o bloco de aquecimento sólido da placa aquecedora. Ajuste rapidamente a posição da placa para que as larvas inteiras e a gota de água estejam visíveis. Inicie o cronômetro.No momento, a placa de Petri é colocada sobre o bloco aquecedor sólido da placa térmica e registra-se o tempo de início de cada comportamento. Cinco. Comportamentos locomotores estereotipados são observados após a transferência da larva imersa em água para a placa térmica. O comportamento normal na ausência de calor envolve locomoção em formato de guarda-sol, acompanhada por movimentos de cabeça de busca.O comportamento de agitação da cabeça pode ocorrer em seguida, quando a larva move rapidamente a cabeça em um movimento para frente ou lateral. Esse movimento é semelhante à sua locomoção normal na água, mas ocorre de forma mais abrupta e com rolamento persistente. O comportamento ocorre quando a larva gira lateralmente pelo menos 360 graus completos.Isso pode ocorrer um número variável de vezes e, às vezes, envolve rolagens incompletas. Para fins de pontuação do comportamento, conte apenas rolagens completas de 360 graus. Este comportamento é o mais semelhante à cena com aplicação local da sonda térmica durante o comportamento de chicotada.A larva exibe movimentos rápidos de contração e liberação ao longo do eixo anteroposterior, aproximando brevemente a cabeça da cauda. Agitações são frequentemente observadas em rápida sucessão, duas ou simultaneamente com rolamentos. Por fim, a larva exibirá comportamento convulsivo, muitas vezes seguido por paralisia. Durante o comportamento convulsivo, a larva se estende ao longo do eixo interoposterior e exibe uma frequência elevada de movimentos do corpo inteiro.O comportamento de tremor sem paralisia por curvatura ocorre quando as larvas cessam o movimento. Em algumas larvas, isso é permanente, enquanto outras exibem posteriormente um movimento pulsátil de baixa frequência. Neste gráfico do percentual de respondentes pertencentes a cada categoria, observa-se um limite máximo na resposta larval à nocicepção térmica. No ensaio com sonda térmica, 100% das larvas são respondedoras rápidas até uma temperatura da sonda de 52 graus Celsius.No entanto, a 54 graus Celsius e temperaturas superiores, 90% ou mais das larvas deixam de responder mesmo após 20 segundos de contato. Embora essas larvas continuem se movendo após o 22º corte, o número de rolamentos ou o tempo gasto no comportamento de retirada de aversão também pode ser medido e representado graficamente. Surpreendentemente, parece haver uma relação inversa entre a temperatura do estímulo aplicado e a robustez da resposta, já que temperaturas mais baixas parecem provocar um maior número de rolamentos.Cinco comportamentos locomotores estereotipados são observados ao transferir a larva imersa em água para a placa aquecida. As latências médias nas quais esses comportamentos são observados são mostradas aqui, assim como as temperaturas médias da gota de água medidas para cada latência sob as condições ideais do ensaio apresentadas aqui; a porcentagem de larvas que exibem cada comportamento distinto variou de 77 a 100%. Embora ocasionalmente os comportamentos de rolagem e chicotada sejam omitidos, sobrepostos ou ocorram em ordem inversa, a porcentagem de larvas que sobreviveu após o início do comportamento de paralisia no ensaio com placa aquecida é mostrada aqui. As larvas foram aquecidas até a paralisia e então removidas para condições padrão de cultivo para recuperação.As larvas tratadas com placebo receberam tratamento equivalente, exceto pela exposição ao calor, e a formação de PPE em adultos viáveis foi quantitativa no sétimo ao 13º dia. Aqui, MD G quatro induz a expressão de transgenes regulados por UAS em todas as quatro classes de neurônios sensoriais periféricos multidentríticos. UAS ou one delta C expressa uma versão modificada do canal de potássio retificador aberto de drosófila necessário para a transmissão sináptica, e UAS orrc um delta NC expressa uma versão ainda mais modificada do mesmo canal que não interfere na transmissão sináptica.Observe que apenas as larvas que possuem tanto o driver MD GAL4 quanto o transgene UAS ORC1ΔC mostram latências aumentadas em quatro dos cinco comportamentos observados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir as respostas locais e globais de larvas de GEs a estímulos térmicos nocivos. Estes procedimentos podem ser combinados com outros métodos, como análise genética, para identificar os genes necessários para a nocicepção térmica. Ao realizar o ensaio com a sonda térmica, é importante lembrar-se de minimizar a variação na pressão, localização e ângulo de contato da sonda.

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Neurociência

Aqui, nós descrevemos um procedimento rápido, simples e confiável para determinar a menor temperatura em que ratos ou camundongos mostram comportamento...

Determinação rápida do limiar térmico nociceptivo em ratos diabéticos

As larvas de Drosophila têm neurônios sensoriais dedicados – nociceptores – cuja resposta a estímulos térmicos potencialmente prejudiciais desencadeia comportamentos aversivos – ou os chamados "nocifensivos" – no animal. Este vídeo descreve um método para avaliar a nocicepção térmica registrando o comportamento larval em resposta à aplicação local de uma sonda de calor na cutícula. Este método é, portanto, chamado de ensaio de sonda de calor local.

Ensaio de sonda de calor local: um método para avaliar a nocicepção de altas temperaturas em larvas de Drosophila

Estudos da morfogênese neuronal usando Drosophila arborização dendrítica larval (da) neurônios beneficiar na visualização situ de proteínas neuronais e epidérmicas por imunofluorescência. Descreve-se um processo que melhora a análise de imunofluorescência de Da neurónios e células epidérmicas vizinhas através da remoção de tecido do músculo da parede do corpo larval.

Remoção de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecido muscular larval Filetes para Análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas

Aqui demonstramos um novo ensaio para estudar nocicepção frio em larvas de Drosophila. Este ensaio utiliza uma sonda de Peltier-construído sob encomenda capaz de aplicar um estímulo frio nocivo focal e resulta em comportamento quanto ao frio quantificáveis. Esta técnica permitirá ainda dissecção celular e molecular da nocicepção frio.

Romance Ensaio para Fria nocicepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a temperatura ambiental preferida de larvas de Drosophila usando um gradiente térmico contínuo.

Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila

Aqui nós apresentamos um protocolo para determinar automaticamente o desempenho locomotor de Drosophila em mudança de temperaturas usando uma arena programável de temperatura controlada que produz mudanças de temperatura rápidas e precisas no tempo e no espaço.

Um método automatizado para determinar o desempenho de Drosophila em resposta às mudanças de temperatura no espaço e no tempo

Os limites térmicos podem prever os ambientes que os organismos toleram, que são informações valiosas diante das rápidas mudanças climáticas. Descritos aqui estão protocolos de alta produtividade para avaliar minima térmico crítico e tempo de knockdown de calor em insetos. Ambos os protocolos maximizam o rendimento e minimizam o custo dos ensaios.

Ensaios de alta taxa de limite térmico em insetos

O objetivo deste protocolo é mostrar como realizar um ensaio melhorado para o nocicepção mecânica em larvas de Drosophila. Usamos o ensaio aqui para demonstrar que a hipersensibilidade mecânica (aodínia e hiperalgesia) existe em larvas de Drosophila.

Um ensaio e ferramentas aprimoradas para medir o nocicepção mecânico em larvas de Drosophila

A avaliação e tratamento da dor em crianças é difícil porque as crianças não podem verbalmente relatam sua experiência. Neste vídeo podemos descrever quantitativa métodos eletrofisiológicos e técnicas de análise que pode ser usado para medir a resposta a eventos nocivos do sistema nervoso infantil.

Medidas eletrofisiológicas e Análise de nocicepção em bebês humanos

Drosophila melanogaster é um sistema modelo de genética e comportamentalmente tratável que tem sido usada para compreender a base molecular e celular de muitos processos biológicos importantes para mais de um século 1. Drosophila tem sido bem explorado para obter insights sobre a base genética do comportamento da mosca.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Aprenda métodos locais e globais para avaliar nocicepção térmica em larvas de Drosophila. Este protocolo utiliza sondas térmicas e placas aquecidas para quantificar respostas comportamentais e estudar processamento sensorial.

Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em

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