Name: Um método melhorado para rápido e preciso de medição de desempenho em vôo Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprenda a medir o desempenho de voo em Drosophila com um método de triagem de alto rendimento. Esta técnica utiliza câmera digital e software de análise para quantificar a altura de pouso e identificar mutações.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concede F32 NS078958 (DTB) e R01 AG033620 (BG).

1. Montar vôo Tester <ol><li> Cilindro vôo seguro para Anel Suporte 1 usando grampos cadeia. (Deixe cerca de 3 cm por baixo do cilindro para pesar prato.) (Nota: O cilindro de vôo que usamos é de 90 cm de comprimento, com um diâmetro de 13,5 cm.) </li><li> Insira pesar a cápsula com uma fina camada de óleo mineral por baixo do cilindro de voo. </li><li> Funil Segura para Anel Fique 2, utilizando uma braçadeira de anel e grampo garra. Ajustar a altura do funil de modo a que a parte inferior do funil é alinhada com a parte superior do cilindro de voo. (Nota: o diâmetro da ponta do funil deve ser menor do que o diâmetro exterior dos tubos de ensaio colocados nos tubos de descarga de modo a que os frascos não vai cair.) </li><li> Inserção do tubo de queda para o topo do funil e fixá-lo usando uma braçadeira garra. (Nota: Nós usamos um tubo de queda que é de 25 cm de comprimento Dropping voar contendo frascos dessa altura permite ejeção consistente de todas as moscas com força uniforme O diâmetro interno do tubo de queda deve ser sligh..tly maior do que o diâmetro externo do frasco para permitir que o frasco de cair livremente.) </li><li> Folha de corte (s) de poliacrilamida para o tamanho adequado. (Nota: Para ajudar na colocação e remoção da folha, a largura deve ser ligeiramente menor do que a circunferência interna do cilindro de voo). </li><li> Aplique uma fina camada de Emaranhado-Trap para a folha. Deixe descansar por 1 hora antes de usar. (Nota: Deixe espaço suficiente na parte superior e inferior da folha (aproximadamente 3 cm) não revestido para agarrar a folha para a inserção / remoção.) </li><li> Insira a folha de poliacrilamida no cilindro de vôo. </li><li> Monte a pista câmera usando suportes de pinho. (Nota: garantir que o fundo da pista pode suportar a câmera sem bloquear a lente Consulte a Figura 1B.). </li><li> Adicionar rolhas e parafuso no lugar. (Nota: coloque as rolhas em locais que permitam a câmera para ver toda a folha de plástico no modo panorâmico.) </li></ol> 2. Execute Experiment <ol> &lt;li&gt; Colete frascos de moscas a serem testadas. Para melhores resultados, usar não mais do que 20 moscas / frasco. </li><li> Bata suavemente voa para baixo do frasco, retire e insira em tubo de queda e liberar frasco. (Nota: O frasco cai no tubo de queda até atingir a abertura funil estreito Quando o frasco atinge o funil, as moscas são ejetados para dentro do cilindro de vôo.). </li><li> Levante o tubo de queda para remover o frasco vazio. (Nota: Vários frascos de moscas do mesmo grupo de teste pode ser analisada em uma única folha de poliacrilamida Nós achamos que até 200 moscas (10 frascos de 20 moscas cada) pode ser testada e fotografada prontamente em uma única folha.. </li><li> Retire a folha de plástico e coloque-o sobre uma superfície branca plana. (Nota: cartolina branca pode ser usado se bancadas são de cor escura.) </li><li> Monte a pista câmera sobre a folha de plástico. A câmara deverá ser suficientemente elevado acima da folha ter tanto a parte superior e inferior da folha, no campo de visão. </li><li> Deslize a câmera junto ªe pista, mantendo o botão &quot;capturar&quot; a adquirir uma imagem panorâmica. </li><li> O número de moscas que aterram no óleo podem ser contados manualmente para cada julgamento. </li><li> Repita os passos de 2,2-2,7 para todas as condições de um determinado experimento. As moscas podem ser removidas da folha entre cada ensaio. Alternativamente, pode ser usado várias folhas, com uma nova folha para cada julgamento. </li></ol> 3. Coleta de Dados <ol><li> Abrir arquivos de imagem usando o software ImageJ. </li><li> Corte imagens se necessário incluir apenas a área da superfície de aterragem. (Esta é a área revestida em emaranhado-Trap.) </li><li> Converter imagens de 8-bit em tons de cinza. </li><li> Criar um &quot;Threshold&quot; para filtrar o fundo branco. (Imagem → Ajustar → Threshold). </li><li> Defina os parâmetros para identificar cada mosca utilizando o menu &quot;analisar partículas&quot;. (Analisar → Analisar Partículas) Definir os parâmetros utilizados para identificar uma partícula. Com a nossa criada, nós achamos que utilizar umárea de 5-90 pixels 2 e uma circularidade de 0,4-1,0 irá identificar com precisão todas as amostras. </li><li> Medir a localização de cada mosca utilizando a lista gerada de coordenadas de cada partícula. A coordenada x em pixels pode ser convertida para centímetros para calcular a altura da aterragem. </li><li> Importe a tabela em uma planilha eletrônica (como o Microsoft Excel). </li></ol>

<ol><li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Am%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of behavior.</a> Sci. Am. 229, 24-37 (1973).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. , e2504(2011).</li>
<li>de Vries, S. E., Clandinin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Stimulation+of+Escape+Behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster.</a> J. Vis. Exp. , e50192(2013).</li>
<li>Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+aggression+in+Drosophila+%28fruit+flies%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Studying aggression in Drosophila (fruit flies).</a> J. Vis. Exp. , e155(2007).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> J. Vis. Exp. , e3795(2012).</li>
<li>Shiraiwa, T., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proboscis+extension+response+%28PER%29+assay+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e193(2007).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li>
<li>Atkinson, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+separation+of+two+behavioral+phenotypes+by+a+mutation+affecting+the+promoters+of+a+Ca-activated+K+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel.</a> J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).</li>
<li>Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+component+of+calcium-activated+potassium+channels+encoded+by+the+Drosophila+slo+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus.</a> Science. 253, 551-555 (1991).</li>
<li>Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mutation+that+eliminates+a+calcium-dependent+potassium+current%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+control+of+flight+speed+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).</li>
<li>Mronz, M., Lehmann, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+free-flight+response+of+Drosophila+to+motion+of+the+visual+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment.</a> J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.

Usando os métodos descritos aqui, temos sido capazes de avaliar rapidamente o desempenho de vôo de um grande número de mutantes de Drosophila, proporcionando maior eficiência do que era possível anteriormente. Para nossos experimentos, nós rotineiramente separar machos e fêmeas e criá-los em baixa densidade (menos de 20 moscas / frasco) para limitar a agressão que possa danificar asas. Outra consideração importante é controlar adequadamente as diferenças de desempenho de vôo, devido a diferenças de fundo genéti...

Drosophila tem sido utilizado para estudar a base genética de comportamento 1, e os investigadores desenvolveram um número de maneiras para analisar vários tipos de comportamento 2-6. As moscas têm sido particularmente úteis no fornecimento de modelos úteis de distúrbios neuromusculares 7. Um ensaio comum usado para estudar o comportamento locomotor é o desempenho de vôo. O testador vôo original é útil para identificar vôo mutantes defectivos e para a avaliação quantitativa da capacidade voo 1, mas tem várias deficiências que limitam a sua aplicação para as telas de alto rendimento: o uso de cilindros revestidos de petróleo é confuso e complicado, algumas funções, como o comprimento do cilindro e introdução de moscas para dentro do tubo com força variável reduzir a precisão quantitativa e é difícil de recuperar moscas vivo do testador. Para superar essas limitações, nós modificamos o testador vôo para incluir uma série de melhorias. Nós adicionamos uma &quot;gota tuser &quot;a introdução de moscas para eliminar a variabilidade entre experiências e os utilizadores. Usamos folhas de acrílico removível revestido com um adesivo que permite uma mais fácil limpeza e recuperação de moscas individuais. Temos aumentado o comprimento do tubo de voo para melhorar a exactidão quantitativa e fiabilidade. Finalmente , usamos uma câmera digital e software de imagem para calcular as alturas de pouso de moscas. Acreditamos que essas melhorias serão úteis para qualquer laboratório interessado na realização de telas genéticos de larga escala por defeitos no desempenho de vôo.

<table><tbody><tr><td>Espátula</td><td>Home Depot</td><td>630147</td><td><a href="http://www.homedepot.com">www.homedepot.com</a></td></tr><tr><td>Moldura de banda traseira de pinho (2x)</td><td>Home Depot</td><td>156469</td><td><a href="http://www.homedepot.com">www.homedepot.com</a>Tábua</td></tr> <tr><td>de Tiras de Pele</td><td>Home Depot</td><td>164704</td><td><a href="http://www.homedepot.com"> www.homedepot.com</a></td></tr><tr><td>Armadilha de Emaranhamento Revestimento de Armadilha de Insetos</td><td>BioControl Network</td><td>268941</td><td><a href="http://www.biconet.com">www.biconet.com</a></td></tr><tr><td>Computador Portátil&nbsp;</td><td>Apple</td><td></td><td><a href="http://www.apple.com/mac/">www.apple.com/mac/</a></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Cartolina branca</td><td>Staples</td><td>247403</td><td><a href="http://www.staples.com">www.staples.com</a></td></tr><tr><td>Prato de pesagem de poliestireno</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67091A</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>Câmera digital</td><td>Sony</td><td>DSC-TX7</td><td><a href="http://www.store.sony.com">www.store.sony.com</a> </td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td><a href="http://www.finescience.com">www.finescience.com</a></td></tr><tr><td>Cilindro de policarbonato (tubo de queda)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8585K62</td><td><a href="http://www.mcmaster.com">www.mcmaster.com</a></td></tr><tr><td>Cilindro de voo (acrílico)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8486K943</td><td><a href="http:// www.mcmaster.com">www.mcmaster.com</a></td></tr><tr><td>Folhas de policarbonato</td><td>McMaster-Carr</td><td>85585K25</td><td><a href="http://www.mcmaster.com">www.mcmaster.com</a></td></tr><tr><td>ring stand (2x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47808</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Suporte de anel</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47791</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Grampos de extensão de três pinos (x2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-7Q</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Funil</td> Grampos de corrente <td>Fisher Scientific</td><td>10-500-3</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr> <tr><td>(2x)</td><td>VWR</td><td>21573-275</td><td><a href="http://www.vwr.com">www.vwr.com</a></td></tr><tr><td>Frascos para injetáveis de vidro</td><td>VWR</td><td>66020-198</td><td><a href="http://www.vwr.com/">www.vwr.com</a></td></tr></tbody></table>

um método melhorado para rápido e preciso de medição de desempenho em vôo<em&gt; drosophila</em

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila provou ser um sistema modelo útil para a análise de comportamento, incluindo o vôo. O testador vôo caindo envolvido inicial voa em uma revestido a óleo cilindro graduado; altura de desembarque prevista uma medida de desempenho de vôo, avaliando como moscas longe vai cair antes de produzir o suficiente impulso para fazer contato com a parede do cilindro. Aqui nós descrevemos uma versão atualizada do testador de vôo com quatro grandes melhorias. Primeiro, nós adicionamos um &quot;tubo de queda&quot; para garantir que todas as moscas entrar no cilindro de vôo a uma velocidade semelhante entre ensaios, eliminando a variabilidade entre os usuários. Em segundo lugar, substituiu o revestimento de óleo com folhas de plástico removíveis revestidas em Emaranhado-Trap, um adesivo projetado para capturar insetos vivos. Em terceiro lugar, nós usamos um cilindro de mais tempo para permitir a discriminação mais precisa da capacidade de vôo. Em quarto lugar, usamos uma câmera digital e software de imagem para automatizar a marcação de desempenho de vôo. Estas melhorias permitem o rapid, avaliação quantitativa do comportamento de vôo, útil para grandes conjuntos de dados e telas genéticos de larga escala.

<html> Figura 1A mostra um esquema da montagem testador vôo atualizado. Figura 1B ilustra o projeto de trilha permitem a câmera para tirar uma imagem panorâmica sem bloquear o campo de visão. Os resultados representativos são mostrados na Figura 2, em que o desempenho de voo de moscas mutantes Slowpoke, que têm um voo conhecidos defeito 8-10, são comparados com o tipo selvagem Canton-S voa. Controle voa consistentemente pousar perto do topo d...

Aqui nós descrevemos um método para a medição rápida e precisa do desempenho de vôo em Drosophila, permitindo seleção de alto rendimento.

Um método melhorado para rápido e preciso de medição de desempenho em vôo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

O objetivo geral deste procedimento é medir rapidamente e com precisão o desempenho de voo em Drosophila. Isso é realizado primeiramente soltando moscas em um cilindro de voo. O segundo passo do procedimento é imaginar a superfície de pouso com uma câmera digital.O passo final consiste em analisar os dados utilizando um software de imagem, medindo a altura do pouso de cada mosca. Em última instância, este procedimento ajuda a identificar mutações e condições como envelhecimento ou neurodegeneração, que prejudicam a capacidade de voo, além de auxiliar na quantificação do desempenho voador. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o teste de voo original, é que ela é mais adequada para triagens de alto rendimento de mutantes e outras condições que afetam o voo.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando percebemos quanto tempo era necessário para testar um grande número de genótipos utilizando o flight tester original. Prenda o cilindro de voo a uma haste de suporte usando braçadeiras de corrente. Deixe aproximadamente três centímetros abaixo do cilindro para o recipiente de trajeto.Cubra o prato com uma fina camada de óleo mineral e deslize-o sob o cilindro de voo. Fixe o funil a um segundo suporte com anel. Ajuste a altura do funil para que sua parte inferior fique alinhada com o topo do cilindro de voo.A parte mais estreita do funil deve ser mais estreita que um frasco para moscas. O diâmetro do tubo de queda deve ser ligeiramente maior que o de um frasco para moscas, para que o frasco possa cair livremente. Insira o tubo de queda na parte superior do funil e fixe-o usando uma braçadeira de garra.A seguir, de uma folha de poliacrilamida, corte um pedaço retangular com o comprimento do cilindro de voo e uma largura ligeiramente menor que a circunferência interna do cilindro de voo. Aplique uma camada fina de adesivo tangle trap na folha, deixando espaço suficiente na parte superior e inferior sem revestimento para segurar a folha. Após o adesivo na folha secar por uma hora, insira a folha no cilindro de voo com o lado adesivo voltado para dentro.Em seguida, monte a trilha da câmera utilizando suportes de pinho. Certifique-se de que a parte inferior da trilha possa sustentar a câmera sem obstruir a lente. Em seguida, parafuse as tampas no lugar, de modo que não interrompam a visão da câmera sobre a folha de plástico.Colete frascos de moscas para serem testadas, com não mais do que 20 moscas por frasco. Bata suavemente no frasco para fazer as moscas descerem até o fundo. Desamarre o frasco e insira-o no tubo de queda.Solte o frasco. Quando o frasco atinge as paredes do funil estreitante, as moscas são ejetadas para dentro do cilindro de voo. Levante o tubo de queda para remover o frasco vazio e carregue mais moscas, se desejar.Até 200 moscas provenientes de 10 frascos podem ser testadas e imagiadas facilmente em uma única lâmina de poliacrilamida. Agora, remova a folha de plástico e coloque-a sobre uma superfície plana e branca; uma cartolina branca pode ser usada se as bancadas forem de cor escura. Monte o trilho da câmera sobre a folha de plástico.A câmera deve estar suficientemente alta acima da folha para que tanto a parte superior quanto a inferior da folha estejam no campo de visão. Deslize a câmera ao longo da trilha enquanto mantém pressionado o botão de captura para adquirir uma imagem panorâmica. O número de moscas que pousam no óleo no recipiente abaixo da câmara de voo pode ser contado manualmente.Para cada ensaio entre as repetições, as moscas podem ser removidas da folha e a folha pode ser reutilizada. Abra os arquivos de imagem no software ImageJ e recorte as imagens, se necessário, para incluir apenas a área de pouso. A área revestida armadilha adesiva.Converta as imagens para escala de cinza de oito bits e crie um limiar para filtrar o fundo branco. Defina os parâmetros para identificar cada mosca.Usando o menu analisar partículas, defina os parâmetros. Utilizado para identificar uma partícula com o equipamento de demonstração. Uma área de cinco a 90 pixels quadrados e uma circularidade de 0,4 a 1,0 identificará com precisão todas as amostras.Agora, meça a localização de cada mosca utilizando a lista gerada de coordenadas para cada partícula. A coordenada X em pixels pode ser convertida para centímetros. Para calcular a altura do pouso, importe a tabela para uma planilha e prossiga com a análise.O desempenho de voo de moscas mutantes slow poke, que possuem um defeito de voo conhecido, foi comparado ao de moscas selvagens do tipo canton s. Todas as moscas tinham três dias de idade e foram criadas em temperatura ambiente; as moscas controle pousaram consistentemente próximo ao topo do cilindro. A dispersão dos pousos foi muito maior para os mutantes slow poke.A altura média de pouso para os cantos a 73 centímetros foi significativamente maior do que a dos mutantes slow poke a 44 centímetros. Após este procedimento, métodos adicionais como a histologia podem ser utilizados para responder perguntas adicionais sobre a integridade estrutural dos músculos de voo, neurônios motores ou junções neuromusculares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como pode avaliar rapidamente o desempenho de voo em oph.

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Este passo a passo protocolo analisa o comportamento de geotaxis negativo de drosófila usando um sistema automatizado de vários cilindro que hospeda centenas de moscas e sincroniza a sua acção por um motor elétrico. Após a sincronização, comportamento de voar geotaxis negativo é analisado, digitalmente gravada e analisados utilizando o software RflyDetection auto-concebidos.

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Aqui nós apresentamos um protocolo para determinar automaticamente o desempenho locomotor de Drosophila em mudança de temperaturas usando uma arena programável de temperatura controlada que produz mudanças de temperatura rápidas e precisas no tempo e no espaço.

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