Um método melhorado para rápido e preciso de medição de desempenho em vôo Drosophila

O objetivo geral deste procedimento é medir com rapidez e precisão o desempenho de voo em Drosophila. Isso é feito primeiro soltando moscas em um cilindro de vôo. A segunda etapa do procedimento é obter imagens da superfície de pouso com uma câmera digital.

A etapa final é analisar os dados usando um software de imagem, medindo a altura de pouso de cada mosca. Em última análise, esse procedimento ajuda a identificar mutações e condições como envelhecimento ou neurodegeneração, que prejudicam a capacidade de voo e ajudam a quantificar o desempenho do voo. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o testador de voo original, é que ela é mais apropriada para telas de alto rendimento para mutantes e outras condições que prejudicam o voo.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos quanto tempo estava envolvido no teste de um grande número de genótipos usando o testador de voo original. Prenda o cilindro de vôo a um suporte de anel usando corrente clamps. Deixe aproximadamente três centímetros embaixo do cilindro para o prato de passagem.

Carregue o prato com uma fina camada de óleo mineral e deslize-o sob o cilindro de vôo. Prenda o funil a um segundo suporte de anel. Ajuste a altura do funil para que a parte inferior do funil fique nivelada com a parte superior do cilindro de vôo.

A parte mais estreita do funil deve ser mais estreita do que um frasco para moscas. O diâmetro do tubo de queda deve ser ligeiramente maior do que um frasco para moscas, para que o frasco possa cair livremente. Insira o tubo de queda no topo do funil e prenda-o usando uma garra clamp.

Em seguida, a partir de uma folha de poliacrilamida, corte um pedaço retangular do comprimento do cilindro de vôo com uma largura ligeiramente menor que a circunferência interna do cilindro de vôo. Aplique uma fina camada de adesivo de armadilha emaranhada na folha, deixando espaço suficiente na parte superior e inferior sem revestimento para segurar a folha. Depois que o adesivo na folha secar por uma hora, deslize a folha no cilindro de vôo com o adesivo para dentro.

Em seguida, monte o trilho da câmera usando suportes de pinho. Certifique-se de que a parte inferior da trilha possa suportar a câmera sem bloquear a lente. Em seguida, aparafuse as rolhas no lugar onde não interrompam a câmera view da folha de plástico.

Colete frascos de moscas a serem testados com no máximo 20 moscas por frasco. Bata suavemente as moscas no fundo do frasco. Desconecte o frasco e insira-o no tubo de gota.

Solte o frasco. Quando o frasco atinge as paredes do funil de estreitamento, as moscas são ejetadas para o cilindro de vôo. Levante o tubo de queda para remover o frasco vazio e carregue mais moscas, se desejar.

Até 200 moscas carregadas de 10 frascos podem ser testadas e visualizadas prontamente em uma única folha de poliacrilamida. Agora, remova a folha de plástico e coloque-a em Uma cartolina branca de superfície branca plana pode ser usada se as bancadas forem de cor escura. Monte a trilha da câmera sobre a folha de plástico.

A câmera deve estar suficientemente alta acima da folha para ter a parte superior e inferior da folha no campo de view. Deslize a câmera ao longo da trilha enquanto mantém pressionado o botão de captura para obter uma imagem panorâmica. O número de moscas que pousam no óleo no prato abaixo da câmara de vôo pode ser contado manualmente.

Para cada tentativa entre as tentativas, as moscas podem ser removidas da folha e a folha pode ser reutilizada. Abra os arquivos de imagem no software image J, corte as imagens, se necessário, para incluir apenas a área da superfície de pouso. A área revestida emaranha a armadilha.

Converta as imagens em escala de cinza de oito bits e crie um limite. Para filtrar o fundo branco. Defina os parâmetros para identificar cada mosca.

Usando o menu analisar partículas, defina os parâmetros. Usado para identificar uma partícula usando o aparelho de demonstração. Uma área de cinco a 90 pixels quadrados e uma circularidade de 0,4 a 1,0 identificarão com precisão todas as amostras.

Agora, meça a localização de cada mosca usando a lista gerada de coordenadas para cada partícula. A coordenada X em pixels pode ser convertida em centímetros. Para calcular a altura do patamar, importe a tabela para uma planilha e prossiga com a análise.

O desempenho de voo de moscas mutantes de puxão lento, que têm um defeito de voo conhecido, foi comparado às moscas do cantão do tipo selvagem. Todas as moscas tinham três dias de idade, criadas com controle de temperatura ambiente, as moscas pousaram consistentemente perto do topo do cilindro. A propagação do pouso foi muito maior para mutantes lentos.

A altura média de pouso para cantões em 73 centímetros foi significativamente maior do que a de mutantes lentos em 44 centímetros. Após este procedimento, métodos adicionais, como histologia, podem ser usados para responder a perguntas adicionais sobre a integridade estrutural dos músculos de voo, neurônios motores ou junções neuromusculares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como pode avaliar rapidamente o desempenho de voo em oph.