Amostragem e processamento de escovação nasal usando videomicroscopia ciliar digital de alta velocidade – adaptação para a pandemia de COVID-19

A falta de procedimentos operacionais formais publicados e padronização impede que a videomicroscopia digital de alta velocidade seja considerada um teste diagnóstico confirmatório para discinesia ciliar primária. Além disso, para continuar fornecendo um serviço de diagnóstico durante esta crise do COVID-19, o protocolo de videomicroscopia ciliar foi adaptado para incluir medidas adequadas de controle de infecção. A avaliação funcional ciliar por meio de videomicroscopia digital de alta velocidade é altamente sensível e específica para o diagnóstico de discinesia ciliar primária.

Em comparação com outros testes diagnósticos primários de discinesia ciliar, a videomicroscopia digital de alta velocidade é relativamente fácil de realizar, barata e os resultados podem estar disponíveis em um dia. A videomicroscopia digital de alta velocidade tem maior sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de discinesia ciliar primária. Atualmente, apenas a microscopia eletrônica e o teste genético são reconhecidos como testes confirmatórios para discinesia ciliar primária, mas esses testes perderão o diagnóstico de discinesia ciliar primária em 15 a 30% dos pacientes.

Demonstrando o procedimento de escovação nasal estará Lionel Benchimol, um residente de otorrinolaringologia do meu laboratório. Antes de coletar a amostra nasal, peça ao paciente que assoe o nariz. Depois de limpar as passagens nasais, faça com que o paciente deite ou sente-se confortavelmente com a cabeça apoiada para trás.

Agite a escova no Medium 199 suplementado para umedecê-la e coloque um endoscópio na entrada do nariz para visualizar o corneto nasal inferior. Insira a escova de citologia no nariz e mova a escova posterior e anteriormente várias vezes sobre a parte posterior do corneto nasal inferior antes de retirá-la. Coloque o pincel em um tubo de M199.

Corte o fio para que ele caiba completamente dentro do tubo e feche imediatamente o tubo. Em seguida, coloque a amostra em um saco duplo hermético. Dentro de nove horas após a coleta da amostra, abra os tubos de amostra em uma cabine de segurança microbiológica e use uma pinça nasal Weil-Blakesley para agitar a escova e desalojar as tiras epiteliais coletadas.

Cole um espaçador de dupla face em uma lâmina de vidro e remova a proteção do espaçador. Agite suavemente o tubo para permitir que os cílios se espalhem por todo o tubo e use uma pipeta para transferir aproximadamente 60 microlitros de epitélio ciliado do meio do tubo para o espaçador. Coloque uma lamínula retangular de 22 por 4 milímetros no espaçador para fechar a câmara e desinfete a lâmina com etanol a 70% antes de removê-la do gabinete de segurança microbiológica.

Depois de trocar as luvas, coloque esta lâmina no prato de uma caixa aquecida e feche a tampa. Adicione óleo à objetiva de imersão em óleo e coloque a caixa no palco de um microscópio vertical ou de luz invertida. Ligue a caixa e o aquecedor de lente e ajuste as configurações de temperatura na caixa e nos controladores do aquecedor de lente.

Após cinco minutos, posicione a objetiva até que ela esteja apenas tocando a lamínula com a ponta da lente. Para visualizar as bordas ciliadas respiratórias da amostra, abra o software da câmera e use a objetiva do microscópio para localizar manualmente as células dentro da amostra e projetar as células no monitor. Verifique se a imagem está visível no monitor e ajuste o condensador e o foco da lente conforme necessário para melhorar a qualidade da imagem.

Quando as tiras de epitélio ciliado forem localizadas, selecione apenas bordas epiteliais ciliadas intactas e ininterruptas que medem pelo menos 50 mícrons de comprimento. Certifique-se de usar apenas bordas normais ou bordas com projeções menores para análise funcional ciliar e excluir bordas ciliadas com projeções principais e células ciliadas isoladas ou células isoladas sem contato entre si e qualquer outro tipo de célula. Quando uma boa borda for selecionada, use uma taxa de quadros da câmera de 500 quadros por segundo para gravar a borda dos cílios batendo por aproximadamente dois segundos.

Depois de registrar um mínimo de seis bordas boas na vista lateral, remova o slide da caixa aquecida e coloque o slide, a lamínula e o espaçador em um saco hermético. Em seguida, coloque as luvas e a máscara no saco e coloque o saco no recipiente apropriado para resíduos médicos perigosos. Para analisar a frequência do batimento ciliar, abra a gravação em um programa de software de análise de vídeo apropriado e divida as bordas ciliadas em aproximadamente cinco áreas adjacentes de aproximadamente 10 mícrons.

Identifique e visualize os cílios ou grupos de cílios em uma taxa de quadros reduzida e um máximo de duas medições de frequência de batimento ciliar por área para obter um máximo de 10 medições de frequência de batimento ciliar por aresta. Registre o número de quadros necessários para que um grupo de cílios complete cinco ciclos de batimento e use a fórmula para calcular a frequência do batimento ciliar. Para determinar a porcentagem de cada padrão de batimento ciliar distinto dentro de uma amostra, para cada cílio ou grupo de cílios, compare o caminho preciso percorrido pelos cílios durante um ciclo de batimento completo com o padrão normal de batimento ciliar observado na análise de videomicroscopia digital de alta velocidade.

Atribua um padrão de batimento ciliar distinto, como normal, rígido, imóvel, assíncrono ou discinético e circular, a cada cílio ou grupo de cílios analisado. Em seguida, calcule a porcentagem de cada padrão de batimento ciliar distinto dentro de cada amostra. O padrão de batimento ciliar atribuído à amostra é o padrão de batimento ciliar predominante observado.

Aqui, observamos resultados detalhados da análise funcional ciliar das amostras de escovação nasal de 14 voluntários adultos. Dessas 14 amostras de escovação nasal, 242 bordas ciliadas foram registradas e 212 atenderam aos critérios de inclusão definidos para análise. Um total de 807 medições de frequência de batimento ciliar e avaliações de padrão de batimento ciliar foram obtidas dos cílios ou grupos de cílios analisados.

Os índices médios de imotilidade foram semelhantes aos valores relatados anteriormente observados em voluntários saudáveis. O escore de discinesia e a frequência de batimentos ciliares foram semelhantes aos valores relatados anteriormente obtidos ao selecionar apenas bordas normais ou bordas com projeção menor. Quando bordas de baixa qualidade são usadas, são relatadas frequências de batimentos ciliares mais baixas e escores de discinesia mais altos.

As células sanguíneas e o muco adquiridos de uma escovação muito robusta podem bloquear o batimento dos cílios livres ou esconder os cílios do observador. Por outro lado, se a escova não pressionar firmemente contra o corneto nasal inferior, a amostra pode não conter tiras epiteliais ciliadas de alta qualidade suficientes. Além disso, se a escovação nasal for realizada na parte anterior da cavidade nasal, apenas células epiteliais não ciliadas de transição serão obtidas.

Os dois aspectos mais importantes do protocolo são a qualidade da escovação nasal e a escolha de fragmentos epiteliais de alta qualidade para evitar um resultado positivo completo ou uma falha da técnica.