Name: Lavagem salina para amostragem do microambiente imunológico nasal canino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Aprenda a técnica de lavagem nasal salina para amostrar o microambiente imunológico nasal em cães com tumores. Este método não invasivo permite análises seriadas das respostas imunes durante a radioterapia.

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<ol><li>Cohn, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+nasal+disease%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin%3A+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Canine nasal disease: An update.</a> Vet Clin: Small Anim Pract. 50 (2), 359-374 (2020).</li>
<li>Mortier, J., Blackwood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+nasal+tumours+in+dogs%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Treatment of nasal tumours in dogs: A review.</a> J Small Anim Pract. 61 (7), 404-415 (2020).</li>
<li>Plickert, H., Tichy, A., Hirt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+canine+nasal+discharge+related+to+intranasal+diseases%3A+A+retrospective+study+of+105+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Characteristics of canine nasal discharge related to intranasal diseases: A retrospective study of 105 cases.</a> J Small Anim Pract. 55 (3), 145-152 (2014).</li>
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<li>Van Pelt, D. R., Mckiernan, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+treatment+of+canine+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and treatment of canine rhinitis.</a> Vet Clin North Am Small Anim Pract. 24 (5), 789-806 (1994).</li>
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<li>Lobetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+lymphoplasmacytic+rhinitis+in+33+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22JS+Afr+Vet+Assoc%22%5BJournal%5D)">Idiopathic lymphoplasmacytic rhinitis in 33 dogs.</a> JS Afr Vet Assoc. 85 (1), 1-5 (2014).</li>
<li>Ashbaugh, E. A., Mckiernan, B. C., Miller, C. J., Powers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+hydropulsion%3A+A+novel+tumor+biopsy+technique%5BTitle%5D)+AND+%22JAAHA%22%5BJournal%5D)">Nasal hydropulsion: A novel tumor biopsy technique.</a> JAAHA. 47 (5), 312-316 (2011).</li>
<li>Wheat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+immune+and+microbiological+responses+to+mucosal+administration+of+a+liposome-tlr+agonist+immunotherapeutic+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Local immune and microbiological responses to mucosal administration of a liposome-tlr agonist immunotherapeutic in dogs.</a> BMC Vet Res. 15 (1), 330(2019).</li>
<li>Darragh, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elective+nodal+irradiation+mitigates+local+and+systemic+immunity+generated+by+combination+radiation+and+immunotherapy+in+head+and+neck+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Elective nodal irradiation mitigates local and systemic immunity generated by combination radiation and immunotherapy in head and neck tumors.</a> Nat Commun. 13 (1), 7015(2022).</li>
<li>Pinard, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lymphocyte-specific+programmed+cell+death+protein+1+receptor+expression+and+cytokines+in+blood+and+urine+in+canine+urothelial+carcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Comp+Oncol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lymphocyte-specific programmed cell death protein 1 receptor expression and cytokines in blood and urine in canine urothelial carcinoma patients.</a> Vet Comp Oncol. 20 (2), 427-436 (2022).</li>
<li>Choi, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+canine+pd-1%2Fpd-l1+specific+monoclonal+antibodies+and+amplification+of+canine+t+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of canine pd-1/pd-l1 specific monoclonal antibodies and amplification of canine t cell function.</a> PLoS One. 15 (7), e0235518(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL&nbsp; Tubos</td><td>Eppendorf</td><td>05-402</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Pipeta</td><td>VWR</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Seringas</td><td>VWR</td><td>BD302830</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos Cônicos</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Cell Strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>8FR Cateter de Borracha Vermelha Estéril</td><td>Med Vet International</td><td>50-252-2428</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td></td></tr><tr><td>Physiological Salino (0,9%)</td><td>Vetivex</td><td>17033-492-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr></tbody></table>

lavagem salina para amostragem do microambiente imunológico nasal canino

Saline Lavage for Sampling of the Canine Nasal Immune Microenvironment

Com este método de lavagem nasal, a amostra coletada parecerá ligeiramente turva, possivelmente com pedaços visíveis de detritos celulares e muco quando o tubo for girado. Uma amostra seria considerada contaminada com sangue periférico se o procedimento de lavagem induzir inadvertidamente sangramento e a amostra for tingida de vermelho. Embora parte da solução salina infundida seja perdida durante o procedimento, uma lavagem negativa seria considerada se a solução salina infundida não fluir de volta para fora da narina e para o tubo; As causas potenciais podem ser que a cabeça não esteja inclinada para baixo o suficiente para permitir um refluxo eficaz, a amostra tenha sido drenada caudal ou lateralmente pela narina contralateral ou o cateter de borracha vermelha não esteja firmemente fixado à seringa e a solução salina tenha vazado para fora do ponto de conexão.
Quando as amostras de lavagem nasal foram coletadas com sucesso de cães com câncer nasal, contagens de células nucleadas na faixa de 1 × 10 6-200 × 106 são esperadas, com 75-96% de células vivas. Alternativamente, quando amostras de lavagem nasal foram coletadas com sucesso de cães com cavidades nasais saudáveis e não inflamadas, as contagens de células estiveram na faixa de 7 ×10 5-2 × 106, com 6-16% de células vivas. Uma imagem representativa de espécimes citológicos obtidos de amostras de lavagem nasal de cães portadores de tumor é apresentada na Figura 2. Além disso, a avaliação por citometria de fluxo de populações celulares analisadas a partir de amostras de lavado nasal de cães saudáveis e portadores de tumor é apresentada na Figura 3. Seria de se esperar que a contagem de células e a porcentagem de viabilidade inferior a essas faixas indicassem que o procedimento de lavagem nasal e a coleta de amostras não foram bem-sucedidos. A Tabela 1 resume os resultados da técnica de lavagem nasal realizada pelos autores em relação ao número de procedimentos realizados, ao número de cães, à condição da cavidade nasal (saudável ou portadora de tumor), ao rendimento da contagem de células nucleadas, à viabilidade das células obtidas para o procedimento e se a amostra de lavagem foi considerada um sucesso ou fracasso para análise a jusante. Para os fins dos experimentos realizados com as amostras de lavagem nasal incluídas na Tabela 1, um rendimento mínimo de número de células de 150.000 foi considerado uma coleta de amostra de lavagem nasal bem-sucedida.
Com esta técnica de lavagem nasal, solução salina estéril a 0,9% é usada para coletar as células. Alternativamente, a solução de Hartmann (solução de Ringer com lactato) pode ser considerada; no entanto, as amostras coletadas com solução salina ou de Hartmann precisariam ser testadas para garantir viabilidade e resultados comparáveis para as células de interesse. Além disso, uma alternativa ao uso de cateter de borracha vermelha em cães sem tumor poderia ser realizar a lavagem nasal com cateter de Foley. Embora não seja utilizado na técnica de lavagem nasal aqui apresentada, o uso de um cateter de Foley permitiria a insuflação do balão na ponta do cateter, ocluindo a cavidade nasal e evitando a perda de líquido caudalmente. Além disso, embora não tenha sido testado na abordagem de processamento da lavagem nasal apresentada aqui, a adição de hialuronidase à amostra de lavagem nasal pode ser considerada para quebrar o muco coletado na amostra de lavagem nasal e liberar mais células para análise. Isso também precisaria ser otimizado para garantir que os resultados não sejam alterados pela adição de hialuronidase ao procedimento de processamento da lavagem nasal.
Os resultados publicados obtidos de procedimentos bem-sucedidos de lavagem nasal realizados em cães inscritos em um ensaio clínico de câncer canino são apresentados na Figura 310. Os resultados apresentados na Figura 3 são de um estudo que investigou o impacto da irradiação nodal eletiva no microambiente imunológico local de cães com tumores nasossinusais cujos tumores foram irradiados isoladamente ou em combinação com irradiação linfonodal cervical regional. Por meio de amostragem seriada da cavidade nasal de cães no ensaio clínico com lavagem nasal, a análise por citometria de fluxo das células coletadas revelou uma diminuição significativa nas populações de células T efetoras no último dia de radioterapia quando os linfonodos regionais foram irradiados concomitantemente com o tumor nasossinusal em comparação com os cães que receberam radioterapia direcionada ao tumor e os linfonodos regionais foram poupados. Isso demonstra a utilidade da amostragem em série da cavidade nasal com lavagem para investigar mudanças nas populações de células em diferentes pontos e com diferentes condições de tratamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema do método de lavagem nasal. Solução salina aquecida e estéril é infundida na cavidade nasal de cães anestesiados usando um cateter de borracha vermelha. O fluido de lavagem nasal é coletado em um tubo à medida que é drenado para fora do nariz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig02.jpg"> 
Figura 2: Composição celular de uma amostra de lavagem nasal coletada de um cão com tumor nasal. Imagem representativa de espécimes citológicos obtidos a partir de amostragem de lavagem nasal (aumento de 500x, coloração de Wright-Giemsa modificada). Os neutrófilos (setas) são as células predominantes, com algumas células epiteliais escamosas (cabeça de seta) e pequenos linfócitos maduros (destacados na caixa quadrada) também presentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig3v2.jpg"> 
Figura 3. Análise por citometria de fluxo de amostras de lavagem nasal coletadas de cães saudáveis e portadores de tumor. Comparação da abundância de células vivas, células imunes e neutrófilos entre cães saudáveis (azul, n = 3) e cães portadores de tumor com carcinoma nasossinusal (vermelho, n = 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig04.jpg"> 
Figura 4: Análise por citometria de fluxo de células coletadas da lavagem nasal de cães inscritos em um ensaio clínico que investiga o impacto da irradiação nodal eletiva (ENI) no microambiente imunológico local. Quantificação de células T CD4 (CD5+CD4+) e CD8 (CD5+CD8+) de amostras de lavagem nasal. Cães tratados com ENI simultaneamente com irradiação tumoral (n = 3) tiveram células T CD4 e CD8 efetoras significativamente reduzidas no último dia de radiação (Dia 3) em comparação com cães tratados com radiação direcionada apenas ao tumor (n = 3). Essa figura foi modificada de Darragh et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Saudável (n=3)</td>
			<td>Portador de tumor (n= 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Número de procedimentos realizados</td>
			<td>3</td>
			<td>80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contagem de células</td>
			<td>0,7 x 106 - 2,8 x 106</td>
			<td>1,6 x 106 - 210 x 106; Mediana: 8,7 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viabilidade celular</td>
			<td>6.3 - 15.9%</td>
			<td>75% - 96%; Mediana: 87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxa de sucesso</td>
			<td>100%</td>
			<td>98.80%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Resumo dos procedimentos de lavagem nasal realizados e características celulares das amostras obtidas.

Lavagem salina para amostragem do microambiente imunológico nasal canino

Evaluating the local immune microenvironment of the canine nasal cavity can be important for investigating normal tissue health and disease conditions, ...

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