موقع محدد ليسين أسيتيل الهستونات لإعادة تشكيل النوكليوسوم باستخدام توسيع الشفرة الوراثية في الإشريكية القولونية

يعد الحصول على أحادي النوكليوسوم المعدل أمرا بالغ الأهمية لتصميم التجارب اللاجينية يوفر بروتوكولنا أحاديات النوكليوسومات المعاد تكوينها الأسيتيل التي يمكن استخدامها في المقايسات الكيميائية الحيوية والملزمة ، وتحديد الهيكل ، والمزيد. الميزة الأساسية لتقنيتنا هي تعدد استخداماتها.

يمكن تعديل هذا النظام بسهولة لدمج العديد من أنواع التعديلات في أحادي النوكليوسومات. ابدأ بإعداد لتر واحد من وسائط 2YT المعقمة في قارورة ثقافة. تلقيح 20 مل من الوسائط التي تحتوي على مضادات حيوية مناسبة مع مخزون الخلايا المحول المشترك الذي يحتوي على علامة تحتوي على البلازميد و pEVOL-AckRS وزراعتها عند 37 درجة مئوية للحصول على OD 0.6.

أضف المضادات الحيوية المناسبة في لتر واحد من وسائط 2YT المعقمة وقم بتلقيحها ب 20 مل من ثقافة البادئ. قم بزراعة المزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات للحصول على OD من 0.6 ، 2.8. أضف العوامل المحفزة و AcK للتركيز النهائي بمقدار واحد مللي مولار IPTG و 0.2٪ أرابينوز وخمسة مللي مولار AcK.

قم بزراعة المزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة ست إلى ثماني ساعات. ثم قم بتكسير الخلايا عند 2 ، 700 × جم لمدة 15 دقيقة وقم بتخزينها طوال الليل عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإذابة الحبيبات في 50 مل من محلول تحلل هيستون لكل لتر من الثقافة وصوتنة الخلايا بسعة 60٪ لمدة ثلاث دقائق مع ثانية واحدة وفواصل زمنية ثانية واحدة.

أجسام إدراج الحبيبات عند 41 ، 600 × جم لمدة 45 دقيقة. تخلص من المادة الطافية ثم أعد تعليق أجسام التضمين في 30 مل من محلول تحلل الهيستون ، ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 30 دقيقة. أعد تعليق أجسام التضمين مرة أخرى في 30 مل من محلول غسيل الحبيبات وكرر الطرد المركزي.

بعد ذلك ، قم بإذابة الأجسام الشاملة في 25 مل من ستة مولير غوانيدين هيدروكلوريد. احتضن مع التحريض عند 37 درجة لمدة ساعة واحدة ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 45 دقيقة. احتضان المادة الطافية بملليلتر واحد من راتنج النيكل-NTA متوازن بستة مولات من هيدروكلوريد الجوانيدينيوم لمدة ساعتين واستمر في تنقية النيكل-NTA في ظل ظروف مشوهة.

اغسل العمود بثلاثة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للغسيل ، ثم قم بإزالة بروتين هيستون الأسيتيل ب 10 مل من محلول الشطف. غسيل الكلى بروتين هيستون الأسيتيل مقابل 5٪ من حمض الأسيتيك لإزالة الأملاح لمدة ثلاث ساعات عند أربع درجات مئوية ، واستبدال المخزن المؤقت ست مرات على الأقل. Aliquot و lipolyze البروتين وتخزينها إلى أجل غير مسمى عند 80 درجة تحت الصفر.

قم بإذابة كميات من كريات بروتين هيستون H2A و H2B و H3 و H4 بحيث يكون هناك مخزون منفصل من كل بروتين هيستون في محلول هيدروكلوريد غوانيدينيوم للحجم الإجمالي البالغ 100 ميكرولتر. احسب تركيز كل بروتين هيستون عن طريق قياس المواد الماصة عند 280 نانومتر. إذا كان الامتصاص أكبر من واحد لأي بروتين ، فقم بتخفيفه باستخدام محلول هيدروكلوريد غوانيدينيوم للحصول على تركيز أكثر دقة.

اجمع بين H2A مع H2B و H3 مع بروتينات H4 بنسبة مولية من واحد إلى واحد وقم بتخفيفها إلى تركيز بروتين إجمالي يبلغ أربعة ميكروغرام لكل ميكرولتر. غسيل الكلى بالتتابع عند أربع درجات مئوية مقابل اثنين من المخزن المؤقت TE المولي بين عشية وضحاها ، ومخزن مؤقت TE مولي لمدة ساعتين و 0.5 مولار TE المؤقت لمدة خمس ساعات. عند الانتهاء ، جهاز الطرد المركزي عند 16 ، 800 × جم عند أربع درجات مئوية لإزالة الرواسب.

احسب تركيز ثنائيات الهيستون والرباعيات عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر. امزج الثنائيات والرباعيات بنسبة مولار واحد إلى واحد واضبط تركيز كلوريد الصوديوم على 2 متر. اضبط 601 DNA على اثنين من المخزن المؤقت TE المولي باستخدام 100X TE buffer وكلوريد الصوديوم الصلب.

أضف المحلول إلى أوكتامر هيستون بنسبة مولارية 0.85 ، 2.9 إلى واحد. انقل خليط هيستون الحمض النووي إلى كيس غسيل الكلى وضعه عند حوالي 200 مل من اثنين من المخزن المؤقت TE مع التحريك اللطيف جدا عند أربع درجات مئوية. قم بإعداد المضخة التمعجية للتنقيط ببطء في المخزن المؤقت TE الخالي من الملح.

عندما يتضاعف الحجم تقريبا ، اسكب نصف الحجم. افعل ذلك أربع مرات على الأقل ، والتي قد تستغرق من أربع إلى ثماني ساعات حسب حجم البداية. بعد تقليل تركيز الملح إلى 150 ملليمول، قم بغسيل الكلى مقابل 20 ملليمولار TE عازلة بين عشية وضحاها.

قم بإزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي وقياس تركيز النيوكليوسومات باستخدام قارئ لوحة. أضف بروتياز TEV الخاص به واحتضنه طوال الليل عند أربع درجات مئوية لإزالة جميع علامات الهيستيدين. ثم قم بإزالة شوائب علامة الهيستيدين من محلول النيوكليوسوم باستخدام راتنج النيكل NTA المنسدل.

احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لوضع النيوكليوسوم وتجانس العينة. تخزين النيوكليوسومات على أربع درجات مئوية على المدى القصير. للتخزين طويل الأجل ، قم بتحويل النيوكليوسومات إلى المخزن المؤقت للتخزين وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

كان لبعض الرباعيات الأسيتيل إنتاجية أقل من غيرها كما تم تقييمها عن طريق تشغيل هلام SDS-PAGE بنسبة 12٪. كلما اقتربت من المنطقة الأساسية ، انخفض العائد المرصود. كان هذا على الأرجح بسبب الأستلة ، التي تتداخل مع مجموعة الأوكتامر.

بعد تجميع الأوكتامرات بتسلسل 601 DNA ، يمكن تقييم النيوكليوسوم باستخدام هلام PAGE أصلي 5٪ 1X TBE متبوعا بالتلوين ببروميد الإيثيديوم. قبل تحديد المواقع الحرارية ، تكون نطاقات النيوكليوسوم المرصودة واسعة جدا وقد تكون مخططة. عند تنفيذ هذا البروتوكول ، احتفظ بالبروتينات على الجليد في جميع الأوقات.

من الأهمية بمكان الحفاظ على الثنائيات والرباعيات والنيوكليوسوم المجمعة. سمح هذا الإجراء للباحثين بتثبيت مواقع أسيتيل ليسين ، وتحديدا في أحادي النوكليوسومات ، مما يفتح الباب لدراسة تعديلات ما بعد الترجمة في سياق الكروماتين. يمكن تكييفه بسهولة لتثبيت أي عدد من الأحماض الأمينية غير القانونية.