Name: Purificação e Expansão de Células T Assassinos Naturais Invariantes para Estudos In vitro e In vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a purificar e expandir células iNKT do baço de camundongo para estudos imunológicos in vitro e in vivo. Este método permite uma expansão de 30 vezes em duas semanas, superando a escassez natural dessas células raras.

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Agradecemos a Paolo Dellabona e Giulia Casorati pelo apoio científico e leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também ao NIH Tetramer Core Facility pelo tetramer CD1d do mouse. O estudo foi financiado pela fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (para m.F.) e associação italiana de pesquisa do câncer (AIRC) bolsa 2019-22604 (para G.D.).

Os procedimentos aqui descritos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) (nº 1048) do Instituto Científico de San Raffaele.
NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis. Todos os reagentes utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Processamento de baço
<ol><li>Eutanize os camundongos iVα14-Jα18 por inalação de CO2 de acordo com a política institucional. NOTA: os camundongos iVα14-Jα18 devem ter 8 semanas ou mais. Para evitar a rejeição das células da transferência in vivo das células, considere que as células isoladas de camundongos fêmeas podem ser transferidas de forma adotiva tanto em receptores masculinos quanto femininos, enquanto as células isoladas de camundongos machos só podem ser transferidas em receptores masculinos. Para experimentos in vitro, nenhum viés de gênero deve ser considerado. Mais camundongos podem ser agrupados para obter mais células.</li>
	<li>Disseca o baço do rato e esmague-o através de um coador de células de 70 nm para obter uma suspensão unicelular em 10 mL de soro salino tamponado fosfato (PBS) com 2% de soro bovino fetal (FBS).</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Remova o supernatante por inversão e processe com tampão de lise eritrócito. Resuspenque a pelota celular com 1 mL de ACK (Amônio-Cloreto-Potássio) Tampão de lise, incubar por 3 minutos à temperatura ambiente e bloquear com 5 mL de PBS com 2% de FBS. Centrifugar a 300 x g por 5 min. NOTA: A ACK está disponível comercialmente; consiste em uma solução de 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3e 0,1 mM Na2EDTA (ácido etilenodiaminetetraacético) dissolvido em H2O bidistilled, pH 7.2-7.4. Se for caseiro, esterilize por filtragem com um filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Remova o supernatante por inversão. Resuspense a pelota celular em 3 mL de PBS com 2% de FBS e remova resíduos de gordura por pipetação. Se necessário, acumule as células provenientes de diferentes camundongos.</li>
	<li>Conte as células e mantenha 50 μL para análise facs.</li>
</ol>2. Enriquecimento celular T
NOTA: Para os passos de enriquecimento, trabalhe rápido, mantenha as células frias e use soluções pré-refresadas a 4 °C durante a noite e depois mantidas no gelo
<ol><li>Centrifugar a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Resuspende todas as células na quantidade apropriada de PBS com 2% de FBS (500 μL para 107 células) e bloqueador de Fc (2,5 μL x 107 células); incubar por 15 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lave com 1-2 mL de tampão de separação MACS (MB) por 107 células totais e centrífuga a 300 x g por 10 min. NOTA: O buffer MACS está disponível comercialmente. É composto por PBS pH 7.2, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM EDTA. Se for caseiro, esterilize por filtragem com um filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Remova o supernatante por inversão e colora as células com CD19-FITC e H2(IAb)-FITC (use 5 μL x 107 células em 100 μL de MB). Misture bem e incubar por 15 min no escuro a 4-8 °C.</li>
	<li>Lave as células adicionando 1-2 mL de MB por 107 células e centrífuga a 300 x g por 10 min.</li>
	<li>Pipeta fora do supernante completamente e resuspensar a pelota celular em 90 μL de MB por 107 células totais. Adicione 10 μL de MicroEsferas Anti-FITC por 107 células totais. Misture bem e incubar por 15 min no escuro a 4-8 °C.</li>
	<li>Lave as células adicionando 1-2 mL de MB por 107 células e centrífuga a 300 x g por 10 min.</li>
	<li>Pipeta fora do supernasceto completamente e resuspend até 1,25 x 108 células em 500 μL de MB.</li>
	<li>Coloque uma coluna LD no campo magnético do separador MACS para prosseguir com o esgotamento. Para evitar entupimento, aplique um filtro de pré-separação na coluna LD e enxágue com 2 mL de MB.</li>
	<li>Quando o reservatório da coluna estiver vazio, aplique a suspensão da célula no filtro. Colete as células sem rótulo que passam pela coluna.</li>
	<li>Lave 3 vezes com 1 mL de MB, somente quando o reservatório da coluna estiver vazio. Recolhe o efluente total, que será enriquecido em células T, e conte as células. Mantenha sempre 50 μL para análise FACS.</li>
</ol>3. enriquecimento celular iNKT
<ol><li>Centrifugar a 300 x g por 5 min e remover o supernatante por inversão.</li>
	<li>Colorisse as células com CD1d-tetramer-PE (mouse PBS57-CD1d-tetramer), de acordo com a titulação de anticorpos em 50 μL de MB por 106 células. Misture bem e incubar por 30 minutos no escuro no gelo. NOTA: O procedimento também pode ser realizado com tetramers mCD1d rotulados pela APC e contas anti-APC; ajustando os fluorochromes utilizados nas seguintes manchas em conformidade. No presente protocolo, utilizamos mouse PBS-57-CD1d-tetramers fornecidos pelo NIH. αgalactosylceramida (αGal-Cer) é o antígeno prototípico reconhecido pelas células iNKT; PBS-57 é um análogo de αGal-Cer com solubilidade melhorada9; a NiH Tetramer Facility fornece ligantes PBS-57 complexos para tetramers CD1d. No entanto, outros dimers CD1d/tetramers/dextramers estão comercialmente disponíveis e podem ser carregados com um antígeno lipídico como αGal-Cer. Prevemos a possibilidade de ajustar o protocolo para seu uso.</li>
	<li>Lave as células adicionando 1-2 mL de MB por 107 células e centrífuga a 300 x g por 10 min.</li>
	<li>Pipeta fora do supernante completamente e resuspensar a pelota celular em 80 μL de MB por 107 células totais. Adicione 20 μL de MicroEsferas Anti-PE por 107 células totais. Misture bem e incubar por 15 min no escuro a 4-8 °C.</li>
	<li>Lave as células adicionando 1-2 mL de MB por 107 células e centrífuga a 300 x g por 10 min.</li>
	<li>Pipeta fora do supernasceto completamente e resuspend até 108 células em 500 μL de MB. Caso contrário, se as células excederem10 8,ajuste o volume de acordo.</li>
	<li>De acordo com a contagem de células, coloque uma coluna LS (até 108) ou MS (até 107) no campo magnético do separador MACS. Enxágüe a coluna com MB (3 mL para LS, 500 μL para MS).</li>
	<li>Aplique a suspensão do celular na coluna.</li>
	<li>Colete células sem rótulo que passam. Lave a coluna 3 vezes adicionando a quantidade apropriada de MB (3 x 3 mL para a coluna LS, 3 x 500 μL para coluna MS) somente quando o reservatório da coluna estiver vazio. O efluente total é a fração negativa.</li>
	<li>Remova a coluna do campo magnético e coloque-a em um novo tubo de coleta.</li>
	<li>Pipeta MB na coluna (5 mL para coluna LS ou 1 mL para coluna MS); empurre o êmbolo fornecido para dentro da coluna e limpe a fração positiva (enriquecida em células iNKT).</li>
	<li>Para aumentar ainda mais a recuperação da célula iNKT, centrifugar a fração negativa em 300 x g por 10 min e repetir passos 3.6-3.7 com uma nova coluna LS ou MS. Acumule as frações positivas e determine a contagem de células. Mantenha 50 μL de frações positivas e negativas para análise FACS.</li>
	<li>Verifique as etapas de Purificação pela análise FACS. As amostras incluem: ex-vivo do baço, fração enriquecida com células T, fração positiva iNKT e fração negativa iNKT. Colorique as células com: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC e DAPI. NOTA: A recuperação esperada de um mouse iVα14-Jα18 é de células 2x106 iNKT .</li>
</ol>4. ativação e expansão de células iNKT
<ol><li>Ative células magnéticas iNKT purificadas com o ativador T do mouse anti-CD3/CD28 em uma proporção de 1:1.<ol>
<li>Centrifugar a fração positiva da célula iNKT a 300 x g por 5 min.</li>
		<li>Enquanto isso, transfira o volume apropriado de contas magnéticas anti-CD3/CD28 para um tubo e adicione um volume igual de PBS, vórtice por 5 segundos. Coloque o tubo em um ímã por 1 minuto e descarte o supernatante.</li>
		<li>Remova o tubo do ímã e resuspenque as contas magnéticas lavadas no volume adequado de RPMI completo (meio RPMI 1640, FCS inativado por calor de 10%, 1 mM piruvato de sódio, 1% aminoácidos não essenciais, penicílina de 10 U/ml e estreptomicina, 50 μM β-Mercaptoethanol) para ter 5 x 105 células iNKT em 1 mL. Use esta suspensão para resuspensar a fração positiva iNKT centrifusada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placa 1 mL da suspensão celular (5 x 10células iNKT) e contas magnéticas anti-CD3/CD28 em uma placa de 48 poços com 20 U/mL IL-2 e incubar a 37 °C.</li>
	<li>Após 5 dias, adicione 10 ng/mL IL-7.</li>
	<li>Divida as células 1:2 quando atingirem 80-90% de confluência, adicione sempre 20U/mL IL-2 e 10 ng/mL IL-7. Nessas condições, as células iNKT podem ser expandidas por até 15 dias.</li>
</ol>

<ol><li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+natural+killer+T+%28NKT%29+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1%28-%29CD4%28%2B%29+CD1d-dependent+precursor+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li>
<li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li>
<li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li>
<li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li>
<li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimodal+CD40%2FFas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li>
<li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li>
<li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li>
<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD62L%2B+NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li>
<li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li>
<li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-party+CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4%2BCD25%2BFoxP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li>
<li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li>
<li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li>
<li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735(2018).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma%3A+an+interim+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li>
<li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma%3A+A+Phase+I+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li>
<li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui mostramos um protocolo reprodutível e viável para obter milhões de células iNKT prontas para uso. Devido à escassez dessas células in vivo, um método para expandi-las era altamente necessário. O protocolo que propomos não requer uma instrumentação específica nem um alto número de ratos. Exploramos camundongos transgênicos iVα14-Jα18 de propósito para reduzir o número de camundongos necessários para o procedimento.
Outro protocolo bem sucedido para expansão celular iNKT a partir de camundo...

Invariantes Células T assassinas naturais (células iNKT) são linfócitos T inatas que expressam um receptor de células αβ T semi-invariante (TCR), formado em camundongos por uma cadeia vα14-Jα18 inata emparelhada com um conjunto limitado de diversas cadeias Vβ1, que é específica para antígenos lipídicos apresentados pela molécula de classe I da MHC CD1d2. as células iNKT passam por um programa de seleção agonista, resultando na aquisição de um fenótipo ativado/inato do efeito ou do tímumo, que ocorre através de várias etapas de maturação3,4, produzindo um cd4+ e um subconjunto CD4. Através deste programa, as células iNKT adquirem fenótipos de efeito t (TH) distintos, ou seja, TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) e TH17 (iNKT17), identificáveis pela expressão dos fatores de transcrição T-bet, GATA3, PLZF e RORγt,respectivamente 5. As células iNKT reconhecem uma gama de lipídios microbianos, mas também são auto-reativas contra lipídios endógenos que são regulados no contexto de situações patológicas de estresse celular e danos teciduais, como câncer e autoimunidade2. Após a ativação, as células iNKT modulam as funções de outras células inatas e adaptativas do efeito imunológico através do contato direto e da produção de citocinas2.
As investigações das células iNKT foram facilitadas por modelos de camundongos, incluindo camundongos deficientes de CD1d ou Jα18 deficientes, e pela produção de tetramers CD1d carregados de antígeno mais a geração de anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para o TCR semi-invariante humano. No entanto, a geração da linha celular iNKT do mouse primário tem se mostrado difícil. Para caracterizar melhor as funções antitumorais das células iNKT e utilizá-las para a terapia celular adotiva, criamos um protocolo para purificar e expandir células esfécnicas iNKT de camundongos transgênicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, em que as células iNKT são 30 vezes mais frequentes do que em camundongos do tipo selvagem.
Células iNKT expandidas podem ser exploradas para ensaios in vitro, e in vivo após transferência de volta para camundongos. Neste cenário, por exemplo, mostramos seus potentes efeitos anti-tumor7. Além disso, as células iNKT expandidas in vitro são favoráveis à modificação funcional via transferência ou edição de genes antes de sua injeção in vivo8, permitindo uma análise funcional perspicaz das vias moleculares, bem como abrindo caminho para terapias celulares avançadas.

<table><tbody><tr><td>Solução de cloreto de amônio-potássio (ACK)</td><td>em casa</td><td></td><td>0,15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0,1mM EDTA, pH 7,2-7,4</td></tr><tr><td>microesferas anti-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701</td><td></td></tr><tr><td>microesferas anti-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD19 -FITC</td><td>Biolegend</td><td>115506</td><td>clone 6D5</td></tr><tr><td>CD1d-tetrâmero -PE</td><td>NIH tetrâmero core facility</td><td></td><td>mouse PBS57-Cd1d-tetrâmeros</td></tr><tr><td>CD4 -PeCy7</td><td></td><td>Biolegend clone 100528</td><td>RM4-5</td></tr><tr><td>Fc bloqueador</td><td>BD Bioscience</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td> <td>Euroclone</td><td>ECS0186L</td><td>inativado por calor e filtrado .22 antes do uso</td></tr><tr><td>Tampão de coloração do fator de transcrição FOXP3</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>H2 (IAb) -FITC</td><td>Biolegend</td><td>114406</td><td>clone AF6-120.1</td></tr><tr><td>hrIL-2</td><td>Chiron Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>LD Colunas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>LS Colunas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Tampão MACS (MB)</td><td>em casa</td><td></td><td>0,5% de albumina de soro bovino (BSA; Sigma-Aldrich) e 2Mm EDTA</td></tr><tr><td>MS Colunas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina e estreptomicina (Pen-Strep)</td><td>Lonza</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PermWash</td><td>BD Bioscience</td><td>51-2091KZ</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponado Salino (PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Pré-Separação (30 &micro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Rato Recombinante IL-7</td><td>R & D System</td><td>407-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 com glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>piruvato de sódio</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta; -APC</td><td>Biolegend</td><td>109212</td><td>clone H57-597</td></tr><tr><td>&alpha; CD3CD28 ativador T de camundongo Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

purificação e expansão de células t assassinos naturais invariantes para estudos in vitro e in vivo

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

As células T (iNKT) invariantes são linfócitos T inatas que expressam um receptor de células T semi-invariante (TCR) conservado específico para antígenos lipídicos auto ou microbianos apresentados pela molécula não polimórfica relacionada ao MHC CD1d. Estudos pré-clínicos e clínicos apoiam um papel para células iNKT em câncer, autoimunidade e doenças infecciosas. As células iNKT são muito conservadas em todas as espécies e sua investigação foi facilitada por modelos de camundongos, incluindo camundongos deficientes de CD1d ou deficientes em INKT, e a possibilidade de detectá-las inequivocamente em camundongos e homens com tetramers CD1d ou mAbs específicos para o TCR semi-invariante. No entanto, as células iNKT são raras e precisam ser expandidas para alcançar números gerenciáveis para qualquer estudo. Como a geração da linha celular iNKT primária do mouse in vitro tem se mostrado difícil, criamos um protocolo robusto para purificar e expandir células iNKT esplênicas a partir dos camundongos transgênicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg), nos quais as células iNKT são 30 vezes mais frequentes. Mostramos aqui que as células iVα14Tg iNKT primárias podem ser enriquecidas através de um processo de separação imunomagnética, produzindo cerca de 95-98% de células iNKT puras. As células iNKT purificadas são estimuladas por contas anti-CD3/CD28 mais IL-2 e IL-7, resultando em expansão de 30 vezes até o dia +14 da cultura com 85-99% de pureza. As células iNKT expandidas podem ser facilmente manipuladas geneticamente, fornecendo uma ferramenta inestimável para dissecar mecanismos de ativação e função in vitro e, mais importante, também após transferência adotiva in vivo.

O protocolo descrito neste manuscrito permite enriquecer células iNKT do baço de camundongos transgênicos iVa14-Ja18 através de um processo de separação imunomagnética resumido na Figura 1A. As células T do baço total são primeiramente selecionadas negativamente pelo esgotamento das células B e monócitos, seguidas pela classificação imunomagnética positiva da célula iNKT com tetramers CD1d carregados de antígeno lipídico PBS-57, que permitem manchar especificamente apenas células iNKT. Este ...

Descrevemos um protocolo rápido e robusto para enriquecer células T (iNKT) invariantes do assassino natural do baço do rato e expandi-las in vitro para números adequados para estudos in vitro e in vivo.

Purificação e Expansão de Células T Assassinos Naturais Invariantes para Estudos In vitro e In vivo

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Este protocolo permite a purificação de células T ink, que são muito raras, e permite uma expansão de 30 vezes em seu número. A purificação pode ser realizada em um dia e produzir um grande número de células T de tinta prontas para uso para estudos in vivo e in vitro em duas semanas. Demonstrando o procedimento será Gloria Delfanti, uma pós-doutora no laboratório.Depois de dissecar o baço do mouse, esmague-o através de um coador de células de 70 nanômetros para obter uma única suspensão celular em 10 mililitros de PBS com 2%FBS. Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos. Remova o supernascer e resuspenque a pelota celular com um mililitro de tampão de potássio de cloreto de amônio estéril.Incubar as células por três minutos em temperatura ambiente, depois bloqueie com cinco mililitros de PBS com 2%FBS. Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos. Depois de remover o supernaspe, resuspenco a pelota celular em três mililitros de PBS com 2% FBS e remova resíduos de gordura por pipetação.Para os passos de enriquecimento, mantenha as células frias e use soluções pré-resfriadas a quatro graus Celsius e, em seguida, mantidas no gelo. Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos. Resuspenda todas as células na quantidade apropriada de PBS com 2%FPS e Bloqueador de Fc e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.Lave com um a dois mililitros de tampão de separação MACS por 10 milhões de células e centrífuga a 300 vezes G por 10 minutos. Depois de remover o supernascer, colorique as células com CD19-FITC e H2-IAb-FITC e incubar por 15 minutos no escuro a quatro a oito graus Celsius. Lave as células adicionando um a dois mililitros de tampão MACS por 10 milhões de células e centrífuga a 300 vezes G por 10 minutos.Remova o supernascer e resuspenja a pelota celular em 90 microliters de buffer MACS por 10 milhões de células. Adicione 10 microliters de microesferas anti-FITC por 10 milhões de células. Misture bem e incubar por 15 minutos no escuro a quatro a oito graus Celsius.Lave as células adicionando um a dois mililitros de tampão MACS por 10 milhões de células e centrífuga a 300 vezes G por 10 minutos. Remova o supernatante e resuspend até 125 milhões de células em 500 microliters de buffer MACS. Coloque uma coluna LD no campo magnético do separador MACS.Para evitar entupimento, aplique um filtro de pré-separação na coluna LD e enxágue-o com dois mililitros de buffer MACS. Aplique a suspensão da célula no filtro e colete as células sem rótulo que passam pela coluna. Lave o reservatório vazio da coluna três vezes com um mililitro de tampão MACS.Coletar o efluente enriquecido com células T e contar as células, mantendo 50 microliters para análise FACS. Depois de centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos, remova o sobrenaspeuta e manche as células com tetramer-PE CD1d. Misture bem e incubar por 30 minutos no escuro no gelo.Lave as células adicionando um a dois mililitros de tampão MACS por 10 milhões de células. Após a centrifugação a 300 vezes G por 10 minutos, remova o sobrenascimento e resuspenja a pelota celular em 80 microliters de tampão MACS por 10 milhões de células. Adicione 20 microliters de microesferas anti-PE por 10 milhões de células.Misture bem e incubar por 15 minutos no escuro a quatro a oito graus Celsius. Lave as células adicionando um a dois mililitros de tampão MACS por 10 milhões de células e centrífuga a 300 vezes G por 10 minutos. Remova o supernatante e resuspende até 100 milhões de células em 500 microliters de buffer MACS.De acordo com a contagem de células, coloque a coluna LS ou MS no campo magnético do separador MACS e enxágue a coluna com tampão MACS. Aplique a suspensão da célula na coluna, colete células sem rótulo que passam e lave a coluna três vezes como descrito anteriormente. Esta é a fração negativa.Remova a coluna do campo magnético e coloque-a em um novo tubo de coleta. Tampão MACS pipeta na coluna e empurre o êmbolo fornecido para dentro da coluna para liberar a fração positiva enriquecida em células T de tinta. Para aumentar ainda mais a recuperação da célula INK T, centrifugar a fração negativa a 300 vezes G por 10 minutos e repetir etapas anteriores com uma nova coluna LS ou MS.Puxe as frações positivas e determine a contagem de células. Mantenha 50 microliters de frações positivas e negativas para análise FACS para verificar a pureza. Para ativar as células INK T em uma proporção de um para um, transfira o volume apropriado de contas magnéticas anti-CD3 e CD28 para um tubo e a um volume igual de PBS, depois vórtice por cinco segundos.Coloque o tubo em um ímã por um minuto e descarte o supernasce. Remova o tubo do ímã e resuspenda as contas magnéticas lavadas no volume adequado de RPMI. Centrífuga purifica células T de tinta purificada a 300 vezes G por cinco minutos e misture-as com contas magnéticas anti-CD3 ou CD28 do mouse.Placa um mililitro da suspensão celular, anti-CD23 e contas magnéticas CD28 em uma placa de 48 poços com 20 unidades por mililitro IL-2, em seguida, incubar a 37 graus Celsius. Após cinco dias, adicione 10 nanogramas por mililitro IL-7. Divida as células ao meio quando atingirem 80 a 90% de confluência, sempre adicionando 20 unidades por mililitro IL-2 e 10 nanogramas por mililitro IL-7.Nessas condições, as células T de tinta podem ser expandidas por até 15 dias. Usando este protocolo, as células T ink são enriquecidas a partir do baço de camundongos transgênicos através de um processo de separação imunomagnética. Após o enriquecimento, as células podem ser expandidas com contas anti-CD3 e CD28, resultando em uma expansão de 30 vezes em média até o dia 14 da cultura.A forte ativação com contas anti-CD3 e anti-CD induziu a queda da expressão TCR de célulaS T na superfície celular e uma população dupla negativa apareceu. A maioria das células T ink expandidas são CD4 negativos. Caracterização dos fatores de transcrição específicos da linhagem PLZF e ROR gamma T possibilitou identificar os fenótipos NKT1, NKT2 e NKT17 em células T ink enriquecidas nos dias zero e 14.As células T de tinta enriquecida mostram um fenótipo de efeito t80, que é conservado após 14 dias de expansão, conforme confirmado pela secreção de ambos os interferon gama e IL-4 após PMA e estimulação de ionomicina. Durante as etapas de purificação, lembre-se de trabalhar rápido com soluções pré-refrescadas e se livrar de quaisquer resíduos de gordura que possam ser vistos durante a pipetação. Células INK T expandidas podem ser exploradas para ensaios in vitro e transferências in vivo para camundongos, mesmo após modificações funcionais via transferência ou edição de genes.A expansão in vitro das células T da TINTA supera a limitação dada pela escassez, tornando-as exploráveis em estudos pré-clínicos nos campos da vigilância imunológica tumoral, doenças infecciosas e autoimunidade.

purification-expansion-mouse-invariant-natural-killer-t-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui nós descrevemos um método eficiente para expandir e purificar um grande número de células NK e avaliar a sua função.

Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

Este vídeo demonstra o isolamento de linfócitos, incluindo células natural killer ou células NK, do tecido hepático humano para expansão seletiva. A digestão enzimática e mecânica, seguida de separação por gradiente de densidade, promove o isolamento de linfócitos, incluindo células NK. Os linfócitos coletados podem ser usados para a expansão seletiva das células NK.

Isolamento de células assassinas naturais do tecido hepático para expansão seletiva

Este vídeo ilustra um método para isolar células T natural killer invariantes, também conhecidas como células iNKT. O procedimento começa com a injeção de um glicolipídio sintético em um camundongo para estimular a ativação e proliferação de células iNKT no baço. Posteriormente, suspensões unicelulares são preparadas a partir do baço e incubadas com complexos de reconhecimento de células iNKT marcados com fluoróforos, seguidos de separação baseada em esferas magnéticas, para isolar as células...

Isolando células T assassinas naturais invariantes de um modelo de camundongo

As células T CD4+ virgens polarizam para vários subconjuntos, dependendo do ambiente no momento da ativação.  A diferenciação de células T CD4+ virgens em vários subconjuntos efetores pode ser alcançada in vitro através da adição de estímulos de receptores de células T e sinais específicos de citocinas.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Aqui apresentamos um protocolo adaptado que pode ser usado para gerar um grande número de células T natural killer invariantes murinas do baço de camundongo. O protocolo descreve uma abordagem pela qual as células iNKT esplênicas podem ser enriquecidas, isoladas e expandidas in vitro usando um número limitado de animais e reagentes.

Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação na vivo da ativação de células (células T) de T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pela medula óssea de GM-CSF (BM)-derivado de células dendríticas (DCs). Além disso, este protocolo descreve isolamento BM e células T, geração de DC e DC e células T transferência adotiva.

Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

Nós descrevemos aqui um ensaio in vivo cytometry-baseado do fluxo da matança que permita a examinação do immunodominance em respostas citotóxicas do linfócito de T (CTL) a um antígeno modelo do tumor. Nós fornecemos exemplos de como este ensaio elegante pode ser empregado para estudos mecanistic e para o teste da eficácia da droga.

Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

Este é um método para isolar células linfoides uterinas de camundongos grávidas e não grávidas. Este método pode ser usado para múltiplas aplicações a jusante, como fenotipagem FACS, classificação celular, ensaios funcionais, RNA-seq e proteômica. O protocolo aqui demonstra como fenótipo grupo 1 células linfoides inatas uterinas por citometria de fluxo.

Isolamento de células linfoides inatas uterinas para análise por citometria de fluxo

Aprenda a purificar e expandir células iNKT do baço de camundongo para estudos imunológicos in vitro e in vivo. Este método permite uma expansão de 30 vezes em duas semanas, superando a escassez natural dessas células raras.

Purificação e Expansão de Células T Assassinos Naturais Invariantes para Estudos In vitro e In vivo

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