Agroinoculação direta de Mudas de Milho por Injeção com Vírus mosaico de rabo-de-cavalo recombinante e clones infecciosos do vírus do mosaico de cana-de-açúcar
27 de fevereiro de 2021
Um protocolo de injeção à base de agrobacterium (agroinjeção) é apresentado para a inoculação do vírus do mosaico de rabo-de-raposa e do vírus do mosaico de cana-de-açúcar em mudas de milho. A inoculação dessa forma leva à infecção viral, silenciamento genético induzido por vírus de genes marcadores e superexpressão viral de GFP.
Este protocolo permite a inoculação de vetores virais diretamente em plantas de milho que podem ser facilmente aplicadas na maioria das configurações de laboratório sem a necessidade de qualquer equipamento especializado caro. A inoculação direta elimina o uso de um host alternativo como fonte inóculo, economizando tempo e recursos. Este método poderia ser aplicado a vetores virais adicionais, linhas de milho e potencialmente outras espécies monocot.
Comece plantando de 1 a 2 sementes de milho no meio de cultivo à base de turfa em pequenas pastilhas colocadas dentro das bandejas. Coloque as bandejas em uma câmara de crescimento abaixo de 16 horas por dia a 25 graus Celsius e noites de 8 horas a 22 a 25 graus Celsius, ou em uma estufa de 22 a 25 graus Celsius com 16 horas diárias e 8 horas noturnas. Regar regularmente plantas e fertilizar uma vez por semana com 15-5-15 fertilizantes líquidos a 330 partes por milhão de concentração.
Prepare a agrobacterium para injeção, inoculando a cepa de agrobacterium contendo a construção viral desejada em meios LB com antibióticos. Em seguida, incubar o frasco ou tubos a 28 graus Celsius enquanto treme a 225 RPM por 24 horas. No dia seguinte, pelota as bactérias por centrificação a 4.000 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente e descarte o sobrenante.
Em seguida, lave a pelota com um mililitro de água deionizada. Suspenda a pelota em um mililitro de solução de sulfato de magnésio milimão e meça a densidade óptica em 600 nanômetros. Em seguida, ajuste-o para 1.0.
Use mudas de milho de 4 a 7 dias para injetar agrobacterium. Monte a seringa e a agulha. Injete suavemente a suspensão bacteriana 2-3 milímetros acima do nó coleoptilular até que ele encha o coleoptile, ou seja visível na prostituta, pendente no estágio de crescimento das plantas.
Injete todas as mudas e troque a seringa e as agulhas para injetar cada construto. Confirme a infecção fenotípica observando lesões de silenciar os genes de controle, lesão imita 22 ou desaturação de fitoeno nas folhas. Use um dispositivo de imagem de fluorescência para triagem rápida de plantas e microscopia de fluorescência para detectar a presença da expressão GFP.
Realize a análise de expressão genética para detecção molecular de infecção. Extrair RNA total de folhas de plantas infectadas 14 a 21 dias após a infecção, e sintetizar o primeiro ramal de fio, conforme descrito no manuscrito do texto. Realize a transcriptase reversa PCR para confirmar a infecção e determinar a integridade do gene ou fragmento de interesse genético usando primers específicos projetados para diferentes construções virais.
Visualize o produto PCR em um gel de 1%agarose contendo uma mancha de ácido nucleico para determinar a presença ou ausência de vírus e gene ou fragmento genético. Este protocolo foi usado para inserir vírus recombinantes projetados para o gene em mudas de milho. Aproximadamente 12 dias após a injeção, foram observados fenótipos silenciados nas folhas como necrose e fotobleaching.
A presença de construto nas folhas após a infecção foi detectada observando a expressão de proteína fluorescente verde sob uma fluorescência usando um filtro GFP diferente. A expressão de proteína fluorescente verde nas folhas infectadas pelo vírus do mosaico de cauda-raposa foi visualizada como pequenas áreas pontuadas de fluorescência distribuídas pelas folhas e como grandes manchas nas folhas infectadas pelo vírus do mosaico de cana-de-açúcar. Utilizando a análise de expressão genética, foi confirmada a infecção sistêmica pelo vírus do mosaico de cauda de raposa e o silenciamento ou supressão genética da desaturação de fitoeno e da lesão imita 22.
O construto também utilizou eficiência de infecção influenciada. No caso da infecção pelo vírus do mosaico de rabo-de-raposa, o vírus do mosaico de rabo-de-raposa e a lesão do vírus do mosaico foxtail imitam 22 tipicamente as maiores eficiências de infecção em 53% e 54%, respectivamente. O vírus do mosaico foxtail se desatura uma eficiência ligeiramente menor em 39% e a proteína fluorescente verde do vírus do mosaico foxtail, com a menor eficiência em 16% Enquanto isso, a eficiência da infecção da proteína fluorescente verde do vírus do mosaico de cana-de-açúcar foi de 8% O tempo e os sintomas serão baseados no vetor viral e na linha de milho utilizada.
A falta de um fenótipo visual pode não significar falta de silenciamento ou expressão. Este método também pode ser aplicado às tecnologias de edição de genes, melhorando os métodos de entrega para guias RNAs.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a entrega mediada por Agrobacterium de vetores virais recombinantes em plântulas de milho. O método permite a inoculação direta de construtos virais para estudos de silenciamento gênico e expressão gênica, eliminando a necessidade de plantas hospedeiras alternativas e equipamentos especializados. A abordagem é otimizada para vetores do vírus do mosaico do milheto (FoMV) e do vírus do mosaico da cana-de-açúcar (SCMV) e pode ser adaptada a diversos genótipos de milho e potencialmente a outras espécies de monocotiledôneas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia molecular vegetal
- Virologia vegetal
- Engenharia genética
Antecedentes
- Os métodos baseados em Agrobacterium são amplamente utilizados para introduzir DNA em tecidos vegetais.
- Vetores virais facilitam o silenciamento e a expressão gênica em plantas.
- A inoculação tradicional frequentemente requer um hospedeiro alternativo como fonte de vírus.
- Métodos de entrega direta podem economizar tempo e recursos em estudos genéticos de plantas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver e otimizar um protocolo para a entrega direta de vetores virais em plântulas de milho mediada por Agrobacterium.
- Demonstrar a eficácia do método para silenciamento gênico e expressão usando construtos de FoMV e SCMV.
- Fornecer uma técnica amplamente acessível para a pesquisa molecular em plantas.
Métodos Utilizados
- Crescimento de plântulas de milho em condições controladas (câmara de crescimento ou estufa).
- Preparação de Agrobacterium tumefaciens GV3101 contendo construtos virais recombinantes em pCAMBIA1380.
- Injeção da suspensão bacteriana próxima ao nó coleoptilar de plântulas de milho com 4–7 dias de idade.
- Observação fenotípica (mimetismo de lesão 22, silenciamento da fitoeno dessaturase, expressão de GFP) e confirmação molecular por meio de RT-PCR e eletroforese em gel de agarose.
Resultados Principais
- Infecção sistêmica bem-sucedida e disseminação de vírus recombinantes em plântulas de milho.
- Fenótipos observáveis: necrose e fotobranqueamento para silenciamento gênico, fluorescência GFP para expressão gênica.
- As eficiências de infecção variaram conforme o construto: vetor vazio FoMV e les22 (53–54%), FoMV pds (39%), FoMV GFP (16%), SCMV GFP (8%).
- A RT-PCR confirmou a presença e integridade dos construtos virais nas plantas infectadas.
Conclusões
- O protocolo permite a entrega eficiente e direta de vetores virais no milho sem a necessidade de equipamentos especializados.
- É eficaz tanto para estudos de silenciamento gênico quanto de expressão gênica no milho.
- O método é adaptável a outros vetores virais, linhagens de milho e potencialmente a outras monocotiledôneas, podendo facilitar aplicações de edição gênica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A inoculação agrodirigida direta em plântulas de milho com vetores virais recombinantes simplifica a investigação da função gênica e a validação de características em culturas monocotiledôneas. Esta abordagem elimina a necessidade de hospedeiros alternativos e equipamentos especializados, acelerando a descoberta inicial e permitindo testes rápidos de hipóteses em fluxos de trabalho de biotecnologia vegetal. O método possibilita fluxos de trabalho escalonáveis e reprodutíveis para estudos de silenciamento e expressão gênica, aumentando a confiança preditiva na validação de alvos e na engenharia de características.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite estudos rápidos de genômica funcional por meio da entrega direta de construtos de silenciamento gênico ou de expressão.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio de alterações fenotípicas observáveis associadas a alvos gênicos específicos.
- Oferece confiança preditiva na seleção de características e na priorização de alvos para o melhoramento de culturas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas validados de milho para triagem posterior de função gênica ou expressão de características.
- Padroniza protocolos de infecção e expressão, melhorando a reprodutibilidade entre genótipos e construtos.
- Gera saídas quantitativas por meio de RT-PCR e imagem de fluorescência para avaliação confiável de construtos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha estudos da função gênica com características relevantes para doenças ou importantes agronomicamente em culturas de monocotiledôneas.
- Permite a continuidade desde a descoberta inicial até a validação pré-clínica de características em pipelines de biotecnologia vegetal.
- Fornece insights mecanicistas que orientam o avanço ajustado ao risco de características modificadas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo direto de agroinoculação integra-se à continuidade de descoberta a validação em engenharia de características vegetais e genômica funcional.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao permitir o silenciamento ou expressão gênica direta no milho.
- Triagem: Fornece dados quantitativos e reprodutíveis de infecção e expressão para comparação de construtos.
- Análises: Utiliza RT-PCR e leituras de fluorescência para confirmar a presença do construto e os resultados funcionais.
- Pesquisa Translacional: Conecta estudos iniciais de função gênica com a validação pré-clínica de características em sistemas de culturas relevantes.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma amplamente acessível e adaptável para diversos vetores virais e genótipos de monocotiledôneas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de função gênica.
- Valor Operacional: Padroniza e amplia a entrega gênica sem necessidade de equipamentos especializados ou hospedeiros alternativos.
- Valor Estratégico: Acelera decisões de prosseguimento ou interrupção e melhora a eficiência do capital em pipelines de desenvolvimento de características.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de características ou alvos geneticamente modificados.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em biologia molecular de plantas e transformação mediada por Agrobacterium.
- Necessita de infraestrutura básica de laboratório para crescimento de plantas, cultivo bacteriano e análise molecular.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de injeção e análise para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diversos genótipos de milho e potencialmente a outras espécies de monocotiledôneas, com otimização do protocolo.
- A eficiência de infecção e a visibilidade do fenótipo podem variar conforme o construto e o genótipo, exigindo confirmação molecular.
